Este protocolo demonstra as condições necessárias para manter a função retiniana no ERG ex vivo, particularmente a onda B extremamente sensível produzida pelas células ON-bipolares. Com o ERG ex vivo, podemos medir a função de diferentes tipos de neurônios da retina com uma alta relação sinal-ruído, permitindo a fácil introdução de agentes farmacológicos. Este método é particularmente receptivo a quantificar a eficácia dos agentes farmacológicos na função e na doença da retina.
Para começar, converta uma configuração de matriz de vários eletrodos conectando o suporte de amostra ERG ex vivo a um amplificador diferencial por meio de um headstage. O amplificador deve ser conectado à entrada analógica da placa de interface do sistema de matriz de vários eletrodos. Use o software de gravação para a matriz de vários eletrodos para gravar e armazenar os dados de entrada do ERG ex vivo.
Defina o ganho do amplificador diferencial para 100 e adicione uma amplificação de tensão adicional de 10X, dependendo das especificações do digitalizador. Defina o filtro passa-baixas para 100 hertz. Alternativamente, para converter uma configuração de patch clamp, conecte o suporte de amostra ERG ex vivo através de um headstage a um amplificador diferencial, que deve ser conectado ao headstage do amplificador de patch clamp.
Use o software do sistema de patch clamp e o digitalizador para registrar e armazenar os dados de entrada do ERG ex vivo. Defina os parâmetros como mostrado anteriormente. Conecte LEDs com os comprimentos de onda apropriados ao microscópio.
Para controlar os estímulos de luz, use um driver de LED controlado por saídas analógicas de um digitalizador. Controle os LEDs com um software de gravação que permitirá o acionamento de estímulos de luz. Em seguida, calibre a saída de luz dos LEDs na posição da retina no suporte da amostra usando um fotodiodo.
Se necessário, insira filtros de densidade neutra para diminuir a intensidade da luz no caminho da luz. Para preparar o eletrodo, insira um eletrodo de pellet de cloreto de prata em um conector de isca roscado. Preencha o interior do conector de isca com cola quente e insira um soquete de dois milímetros na cola quente do lado não roscado.
Solde um fio de prata do eletrodo EP-1 ao soquete de dois milímetros. Parafusar o eléctrodo acabado com um anel O na rosca nas portas do eléctrodo do suporte da amostra ERG ex vivo. Para olhos grandes, incluindo olhos de doadores humanos, limpe o globo do tecido conjuntivo restante e remova o segmento anterior e a lente.
Use um bisturi para fazer um corte a aproximadamente três milímetros do limbo. Insira uma tesoura de dissecção curva na incisão e corte ao longo do limbo para remover a porção anterior do olho com a lente. Obter amostras de retina para eletrorretinografia ex vivo com um punch de biópsia descartável de três a seis milímetros.
Para montar o tecido no suporte da amostra, coloque a metade inferior do suporte da amostra em uma placa de Petri grande e encha-a com o meio de Ames oxigenado de tal forma que a cúpula do suporte da amostra esteja apenas submersa. Agarre cuidadosamente a borda da retina com pinça fina e transfira a retina para a cúpula do suporte da amostra ex vivo, o lado do fotorreceptor voltado para cima. Levante o suporte do espécime da solução de Ames, cuidando para que a retina permaneça no lugar.
Seque completamente a placa do suporte da amostra para minimizar o ruído, o crosstalk elétrico e o desvio de sinal. Em seguida, monte ambas as metades do suporte da amostra com quatro parafusos e conecte a linha de perfusão. Acione o eletrodo na metade inferior do suporte da amostra e conecte o cabo do ânodo ao lado interno da retina e o cabo do cátodo ao lado do fotorreceptor.
Perfundir o suporte do espécime com pelo menos um mililitro por minuto de meio de Ames oxigenado por 10 a 20 minutos para permitir que as respostas à luz se estabilizem. O ERG ex vivo permitiu o registro de respostas de luz fotorreceptora e de células ON-bipolar da retina do rato. O registro das respostas fotorreceptoras de retinas de doadores humanos foi possível com até cinco horas de atraso post-mortem de enucleação e menos de 20 minutos de atraso para respostas de células ON-bipolares.
Em condições ideais, as amplitudes de resposta e a cinética em ambos os tipos celulares foram relativamente estáveis ao longo do tempo, mas mostraram um declínio lento 40 a 45 minutos após a montagem das retinas no suporte da amostra. A temperatura reduzida no suporte da amostra retardou muito a cinética de ambos os fotorreceptores e células ON-bipolares. No entanto, diminuiu a amplitude da onda B, mas não da onda A.
Por outro lado, a desaceleração da taxa de perfusão reduziu as amplitudes das respostas das células fotorreceptoras e ON-bipolares, mas não afetou o tempo implícito da onda A ou B. A cessação da perfusão por 10 minutos, seguida de reperfusão, resultou em uma perda completa da função celular bipolar ON com respostas fotorreceptoras preservadas. Velocidade de perfusão e temperatura fisiológica suficientes são críticas para a obtenção de respostas estáveis, em particular, de células ON-bipolares no ERG ex vivo.
Este protocolo permite a exploração aprofundada das diferenças na função fotorreceptora na macular e periferia humanas, respondendo a questões que anteriormente só podiam ser realizadas em primatas não humanos.
