Este protocolo mostra a produção de transgênicos Fall Armyworm usando sistema de transformação baseado em piggyBac. Esperamos que esses métodos beneficiem a melhoria da transformação, não apenas no Verme do Exército de Outono, mas também insetos lepidopteranos. O método descrito aqui torna eficiente a transformação germinal de insetos pestes lepidopteranos.
Xien Chen, pós-doutorando no meu laboratório. Comece colocando 12 pupas machos e 12 pupas fêmeas em uma caixa. Coloque uma solução de 10% de sacarose na caixa para alimentar adultos.
Cubra a caixa com uma toalha de papel. No segundo dia pós-eclosão, exponha os adultos à luz intensa durante a noite. No terceiro dia pós-eclosão, transfira os adultos para um lugar escuro.
Colete os embriões dentro de duas horas após a posição. Adicione gotas de água ao pedaço da toalha de papel com ovos frescos mantidos em uma placa de Petri no gelo. Transfira os ovos suavemente para um deslizamento de vidro com uma escova fina e alinhe-os um a um em uma lâmina de vidro.
Mantenha os slides de vidro com os ovos alinhados no gelo antes da microinjeção. Injete uma mistura de 200 nanogramas por microliter e EGFP à base de co-doença, 200 nanogramas por microliter hiperativo piggyBac transposase mRNA, e água destilada estéril nos ovos usando a pressão de compensação do microinjetor automatizado. Mantenha os ovos injetados em 27 mais ou menos um grau Celsius, 60 mais ou menos 10% de umidade relativa até eclodir.
Alimente as larvas eclodidas em uma dieta artificial, e transfira cada larva para uma pequena xícara no estágio inicial de coalhada e estrela. Recolhe a pupa e coloca aproximadamente 150 fêmeas e 150 pupas machos em uma gaiola. Pendure vários pedaços de papel toalhas de 30 centímetros por 15 centímetros de tamanho na gaiola para coletar os ovos.
Colete as toalhas de papel com ovos diariamente e mantenha os ovos em condições adequadas até chocar. Mantenha as larvas de nénato a quatro graus Celsius por cinco minutos para imobilizá-las e, em seguida, transfira-as para uma placa gelada. Trie as larvas imobilizadas de recém-nascidos sob um microscópio estéreo de fluorescência.
Selecione os recém-nascidos positivos do EGFP, eleve-os para o estágio pupal, em cerca de duas semanas a 27 mais ou menos um grau Celsius. O hiperativo piggyBac transposase mRNA sintetizado in vitro foi detectado usando um gel de 1%Agarose. Os embriões injetados pelo PDS não apresentaram sinal de EGFP, enquanto os embriões de transposição de combísmo e hiperativos de combísmo de combísmo de co-pDA apresentaram fluorescência EGP, indicando que a construção do piggyBac foi bem sucedida.
As larvas do G1 obtidas a partir de ovos resultantes de uma auto-cruz de adultos G0 apresentaram forte sinal EGFP. Um fragmento contendo o promotor e o fragmento EGFP foi amplificado com sucesso usando o DNA genômico isolado das larvas positivas do EGFP como modelo. No entanto, o mesmo fragmento não foi detectado quando o DNA genômico foi isolado das larvas do tipo selvagem como modelo.
Os ovos para microinjeção devem ser o mais frescos possível e devem ser sempre mantidos no gelo antes da microinjeção para retardar seu desenvolvimento. Essa técnica abre caminho para os pesquisadores responderem perguntas sobre genômica funcional de insetos de pragas e desenvolverem métodos de controle genético para esta praga global.
