Este protocolo permite a formação de células tumorais metastáticas cerebrais e a geração de fatias cerebrais ex vivo que permitem testes rápidos de eficácia e radiação de drogas em um tumor pré-formado. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de testar rapidamente vários medicamentos ou tratamentos em um ambiente fisiologicamente relevante que mantém interações cérebro-tumor-hospedeiro. Este método pode ajudar a entender como as células metastáticas cerebrais crescem, sobrevivem e invadem o parênquim cerebral e entendem o papel do microambiente tumoral cerebral no crescimento e disseminação do câncer.
Demonstrando o procedimento estarão Lorela Ciraku e Emily Esquea, ambas candidatas ao doutorado do meu laboratório. Para começar, coloque os ratos anestesiados em uma estrutura estereotaxica e imobilize a cabeça usando barras de ouvido padrão. Esterilize a superfície da cabeça três vezes por repetida aplicação alternada de cotonetes de iodo e 70% de etanol antes da incisão.
Usando um bisturi cirúrgico, faça uma incisão de uma centimétrica de linha média em um ângulo diagonal para o eixo imaginário dividindo o cérebro do camundongo em duas metades simétricas para expor o crânio. Depois de limpar qualquer sangue com um cotonete, desvie a pele lateralmente para expor o local da injeção. Use uma broca de 0,73 milímetros para penetrar no crânio e fazer um furo usando leve pressão e movimento de torção.
Para injetar cinco microliters de células expressando a luciferase GFP, insira uma seringa de alta precisão a 3,5 milímetros de profundidade no cérebro. Deixe-o se acomodar por dois minutos e, em seguida, puxe a seringa para cima cerca de um milímetro. Após dois minutos, injete lentamente o primeiro volume e espere por mais dois minutos antes de injetar o resto do volume.
Depois de três minutos, puxe lentamente a seringa. Aplique cera óssea no local da injeção no crânio e sutura o tecido com suturas de polipropileno. Monitore o comportamento do camundongo logo após a cirurgia periodicamente para determinar se o tratamento especial, incluindo injeção salina e alimentos macios, são necessários para ajudar na recuperação rápida.
Para monitorar o crescimento do tumor através de imagens de bioluminescência, primeiro ligue o oxigênio e o isoflurane no sistema de imagem e permita que ambos sejam distribuídos para a câmara separada fora da caixa de imagem. Em seguida, depois de ligar o software e inicializar o instrumento, escolha a opção apropriada para visualizar e capturar todo o corpo do mouse. Em seguida, transfira os ratos para a câmara fora da caixa de imagens fornecida com oxigênio e isoflurano.
Uma vez que os camundongos estejam sob o efeito anestésico, injete os ratos intraperitonealmente com 200 microlitros de 30 miligramas por mililitro de luciferina. Coloque os ratos na câmara de imagem com o estômago voltado para o lábio do nariz das câmaras de imagem. Bloqueie a câmara, escolha dois minutos de exposição para iniciar a imagem e, em seguida, complete a imagem.
Depois de colocar o cortador de tecido em uma capa de fluxo laminar estéril, limpe todas as ferramentas e instrumentos com 70% de etanol. Depois de eutanásia do camundongo, remova e coloque o cérebro rapidamente na solução de sacarose-ACSF gelada. Usando uma espátula, transfira o cérebro em um papel filtro molhado pela ACSF em uma tampa de prato de 60 milímetros.
Usando uma lâmina afiada e estéril, corte o excesso de partes do cérebro que não contenham nenhum tumor, incluindo a parte inferior do cérebro, para trazer a forma do cérebro para um cubo não perfeito. Depois de colocar várias folhas de papel filtro molhado pela ACSF na plataforma de corte, coloque o tecido bloqueado sobre o papel do filtro. Para cortar o tecido em seções de 200 a 250 micrômetros de espessura, ajuste o tamanho do corte para 2 ou 2,5 unidades na régua do provedor e comece a cortar.
Use um pincel para transferir fatias cerebrais em um prato contendo sacarose-ACSF e separe as fatias sob um microscópio leve usando agulhas de calibre 27. Identifique as fatias positivas do GFP sob o microscópio fluorescente. Em seguida, usando uma pipeta quebrada de um mililitro estéril com uma abertura ampla, transfira fatias identificadas para um novo prato de 60 milímetros contendo dois a três mililitros de mídia de fatia adulta.
Em seguida, transfira de três a cinco fatias para cada inserção de cultura de tecido em cada poço de uma placa de seis poços a uma distância segura. Depois de remover o meio de excesso da superfície da pastilha, adicione um mililitro de meio de fatia de rato adulto equilibrado por baixo de cada inserção. Incubar os tecidos a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade por 24 horas antes da imagem.
Pipeta cinco microlitres de 30 miligramas por solução de luciferina mililitro no meio sob as pastilhas dentro de um capô estéril. Coloque a placa de seis poços com a tampa dentro da câmara de imagem do instrumento abaixo da câmera estacionária e tranque a porta da câmara. Abra o software e inicialize o instrumento.
Depois de escolher as configurações da câmera permitindo visualização e captura de apenas um poço por imagem, coloque o poço para ser filmado diretamente sob a câmera. Use a ferramenta ROI, encaixe-a em torno da forma e tamanho do tumor, meça o ROI e informe as leituras totais para quantificar o sinal bioluminescente de cada tumor na fatia. Depois de trazer a placa de volta para o capô de fluxo laminar estéril, use fórceps para levantar ligeiramente a pastilha do poço.
Depois de aspirar o meio, substitua o meio por um mililitro de meio fresco e coloque o inset de volta no poço. Para os experimentos onde as fatias são tratadas com vários compostos, como inibidores e metabólitos, prepare a concentração de reagente apropriada em 1,2 mililitros de mídia de fatia cerebral em um tubo de 1,5 mililitro, e, em seguida, transfira um mililitro de reagente para o poço que contém a fatia. As células luciferase MDA-MB-231 BR-GFP foram injetadas em camundongos nus, tumores foram autorizados a crescer, cérebros com tumores foram dissecados, fatiados, ex vivo crescidos e o crescimento do tumor foi monitorado por imagens de bioluminescência.
A coloração de H&E e a fluorescência GFP-positiva confirmaram a presença de um tumor na fatia cerebral. O aumento da coloração ki-67 confirmou a presença de células cancerígenas altamente proliferativas. Os tumores em fatias cerebrais que não foram expostos à irradiação continuaram a crescer ex vivo, enquanto tumores expostos à irradiação mostraram um crescimento paralisado.
As fatias cerebrais contendo tumores também foram monitoradas através de imagens ao vivo para visualizar o crescimento do tumor após o tratamento de irradiação. Consistente com a imagem bioluminescente, o controle das células cancerígenas cresceu rapidamente à medida que a intensidade do GFP aumentava e as células começaram a invadir o parênquim cerebral. Em contraste, as células cancerígenas em fatias cerebrais tratadas com irradiação eram citostáticas e a intensidade do GFP foi mantida.
Grandes células cancerígenas multinucleadas e um aumento na coloração do marcador de dano de DNA em células cancerígenas tratadas pelo IR foram detectadas. Além disso, foi detectado um aumento nos astrócitos reativos. A apoptose induzida pelo tratamento de RI não foi detectada nas fatias cerebrais do camundongo sem tumor.
As fatias cerebrais contendo tumores foram tratadas com diferentes concentrações de paclitaxel, uma droga quimioterápica. O tratamento diminuiu significativamente o tamanho do tumor após o 10º dia de tratamento. Foi detectado um aumento da apoptose nas células tumorais tratadas com paclitaxel.
O tratamento inibidor não alterou a viabilidade do tecido cerebral. Nenhum aumento na apoptose foi medido pela coloração de caspase-3 em fatia cerebral de camundongo livre de tumores tratada com paclitaxel. Quando o tratamento com os medicamentos de interesse terminou, as fatias podem ser analisadas para expressão proteica através de imunocytoquímica, estudos omicos ou alcançar suspensão unicelular adequada para citometria de fluxo.
