O protocolo apresentado é utilizado para triagem de alto rendimento e identificação de nano corpos inibitórios e não inibitórios visando transportadores eletrogênicos reconstituídos em proteoliposomes ou presentes em vesículas de membrana. Projetar ensaios de transferência pode ser difícil em vários casos, especialmente se substratos rotulados não estiverem disponíveis. Se a mesma eletrofisiologia permite estudar o efeito de nano corpos no transporte para praticamente qualquer transporte eletrogênico, uma vez que a eletrofisiologia SSM não requer substratos rotulados.
Nano corpos foram investigados por seu uso em aplicações médicas. Esta técnica pode ajudar a tela potenciais inibidores visando transportadores eletrogênicos específicos de humanos ou patógenos humanos. Para começar, pegue 10 tubos limpos e transfira 10 mililitros da membrana não ativada de sólido, ou SSM, tampão em cada tubo.
Para preparar os buffers SSM ativados, adicione o substrato nos tubos usando uma série de concentrações em torno da concentração máxima de metade esperada. Inicie o software SSM e deixe a máquina inicializar automaticamente. Defina o caminho de salvamento para dados.
Confirme apertando o botão OK. Selecione o protocolo de limpeza inicial padrão nas opções de fluxo de trabalho e clique em executar. Em seguida, monte o chip revestido de proteoliposome na tomada.
Mova o braço para travar o chip. Inclua o chip montado com a tampa. Selecione o CapCom do programa no fluxo de trabalho e deixe-o executado para determinar a condutividade e a capacitância.
Confirme que a condutividade está abaixo de cinco nanosiemens e a capacitância está entre 15 e 35 nanofarad antes de usá-lo para a medição. Transfira as soluções de ativação em frascos e posicione os buffers no sampler do teste. Transfira o tampão não ativado para um reservatório e coloque-o ao lado do suporte do chip na posição do reservatório à direita.
Crie um protocolo para o fluxo de trabalho usando uma sequência de sequência de solução não ativada, ativada e não ativante, ou uma sequência BAB, em um loop que executa três medições e se move para o próximo buffer de ativação para todos os 10 buffers. Use a taxa de fluxo padrão de 200 microliters por segundo com um segundo, um segundo, um segundo de fluxo para a sequência BAB e clique em reprodução para iniciar a medição. Salve o protocolo e deixe o fluxo de trabalho ser executado clicando no botão reproduzir.
Em seguida, realize o mesmo experimento usando lipossomos livres de proteínas. Use qualquer software preferencial para análise de dados para traçar a corrente medida versus tempo e use a função para estimativa de altura máxima na faixa de adição do buffer de ativação. Plote a corrente máxima contra a concentração do substrato para determinar o efeito meio máximo da concentração, ou EC50, do substrato através de regressão não linear.
Transfira 50 mililitros do buffer SSM não ativado para um tubo limpo. Adicione a colina do substrato a uma concentração final de cinco milimiliar e use-a para uma medição positiva de controle. Transfira 10 mililitros do buffer SSM não ativador para um tubo limpo.
Adicione colina substrato a cinco milimólares e nanocorpo a 500 nanôes de concentração final. Repita o passo para cada nanocorpo preparar as soluções de ativação como demonstrado. Inicie a máquina SSM e meça a capacitância e condutividade do chip revestido de proteoliposome, como demonstrado anteriormente.
Transfira a solução de ativação sem um nanocorpo em um frasco e coloque o buffer no sampler da sonda. Transfira o buffer não ativador sem um nanocorpo em um reservatório e posicione-o no sampler da sonda. Em seguida, repita este processo para todas as soluções que contenham nano corpos com solução ativadora e não ativante.
Crie um protocolo para o fluxo de trabalho Usando uma sequência BAB. Crie um loop que realize três medições da sequência BAB usando buffers sem nanocorpos, duas medidas da sequência BAB com buffers contendo um nanocorpo, 120 segundos de incubação de tempo de atraso com o nanocorpo, e três medidas da sequência BAB com buffers contendo o nanocorpo. Salve o fluxo de trabalho e deixe-o rodar clicando no botão reproduzir.
Em seguida, crie um novo protocolo para o fluxo de trabalho usando uma sequência BAB e um loop de cinco medidas para lavar o corpo nano reversivelmente ligado. Salve o fluxo de trabalho e deixe-o rodar clicando no botão reproduzir. Compare a última corrente de pico das medições com a medição inicial somente do substrato.
Se a corrente máxima atingir o valor inicial, o nanocorpo foi lavado com sucesso e as condições iniciais foram restabelecidas. Caso contrário, repita o fluxo de trabalho ou mude para um novo chip. Repita este processo usando chips individuais para cada tela de nanocorpo, ou repita com vários nanocorpos usando o mesmo chip.
Use qualquer software preferencial para análise de dados para traçar a corrente medida versus o tempo. Em seguida, o software seleciona automaticamente a função para estimativa de altura máxima na faixa de adição do buffer de ativação. Normalize a corrente máxima e a presença do nanocorpo com base na medição apenas do substrato.
Plote as correntes máximas no histograma e compare as correntes máximas das medições apenas do substrato com as correntes de pico medidas na presença de nano corpos para identificar nano corpos inibitórios. Transfira 50 mililitros do buffer SSM não ativador em um tubo limpo e adicione a colina do substrato a uma concentração final de cinco mililitros, e use-o como solução de ativação para controle positivo. Adicione cinco mililitros da solução não ativante a oito tubos limpos, em seguida, adicione colina substrato e nanocorpo inibitório aos tubos em concentrações na faixa de IC50 esperada.
Adicione 10 mililitros da solução não ativante aos oito tubos e adicione nanocorpo inibitório a cada tubo correspondente ao tampão de não ativação. Inicie a configuração SSM e meça a capacitância e condutividade do chip revestido de proteoliposome. Transfira a solução de ativação sem nanocorpo para um frasco e coloque-a no sampler da sonda.
Em seguida, transfira o tampão não ativado sem nanocorpo para um reservatório e posicione-o na posição do reservatório ao lado do suporte do chip à direita. Transfira as soluções ativantes e não ativantes contendo nano corpos em frascos e posicione os buffers no sampler da sonda. Crie um protocolo para o fluxo de trabalho usando uma sequência BAB.
Inclua um loop para medir cada concentração duas vezes, incubar por 120 segundos e medir mais três vezes. Use qualquer software preferencial para análise de dados para traçar a corrente medida versus tempo e selecione a função para a estimativa de altura máxima na faixa de adição do buffer de ativação. Plote as correntes de pico contra a concentração de nanocorpo para determinar o IC50 através de regressão não linear.
Para determinar a concentração de substrato a ser utilizada durante uma triagem de nano corpos, o transporte eletrogênico foi medido sob diferentes concentrações de substrato para determinar o EC50. Uma concentração de substrato correspondente a condições saturadas, cinco milimiliar, foi selecionada e mantida constante em todos os buffers de ativação. O efeito dos nanomutos inibitórios no transporte eletrogênico foi visualizado a partir da diminuição das amplitudes das correntes de pico.
Após executar o protocolo de lavagem para permitir a desvinculação de nanocorpos, observou-se uma recuperação de 80 a 95% da amplitude inicial de corrente de pico. Ao mudar de condições não ativadas para ativação, nenhuma corrente de artefato significativa foi introduzida por nano corpos presentes nestes buffers. Após a seleção de nanomá corpos com propriedades inibitórias, foram determinados os valores IC50 para nanocas individuais.
É crucial dar tempo suficiente para a calibração dos proteoliposomes no chip com o tampão contendo o nanocorpo. Uma vez que a ligação é reversível, o nanocorpo precisa estar presente tanto em buffers de ativação quanto não ativantes.
