Meu laboratório tem trabalhado em pesquisa COVID-19, e recentemente desenvolvemos um novo ensaio que nos permitiu detectar rapidamente e com precisão anticorpos SARS-CoV-2. Este protocolo descreve um alto ensaio de rendimento para detectar anticorpos anti-SARS-CoV-2 em amostras de soro do paciente, o que é crítico dada a pandemia atual. A maioria dos ensaios sorológicos atuais sacrifica a velocidade para sensibilidade ou vice-versa.
Nossos dados mostram que nosso ensaio é sensível e tem um tempo de resposta rápido. A fim de produzir uma quantidade suficiente de bioreporter HiBiT-RBD alto, comece por preparar-se para a cultura celular. Primeiro, prepare o meio de águia modificado de Dulbecco completo contendo 10% de soro bovino fetal e 1%penicilina e estreptomicina.
Em seguida, aqueça a mídia em um banho de água de 37 graus Celsius. Ligue o armário de segurança biológica e use 70% de etanol para esterilizar a superfície do gabinete. Para cultivar a linha celular, retire-a de menos 80 graus Celsius ou nitrogênio líquido e descongele-a em um banho de água de 37 graus Celsius.
Misture as células descongeladas com pelo menos 10 mililitros de meio completo. Pipete a suspensão da célula em uma placa de Petri de 15 centímetros e gire a placa para distribuir as células uniformemente. Coloque o prato em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 85 a 95% de umidade.
Observe as células sob o microscópio até que o nível de confluência atinja 80 a 90% Em alta confluência, remova o meio, lave as células com PBS quente e adicione três a cinco mililitros de 0,25% trypsin-EDTA para separar as células da superfície. Depois de aproximadamente cinco minutos, olhe para as células sob um microscópio. Se todas as células estiverem flutuando, adicione pelo menos quatro mililitros de médio e transfira a suspensão celular para um novo tubo estéril.
Conte as células usando um hemócito e adicione um milhão de células em cada poço de uma placa de seis poços para transfecção. Para realizar a transfecção do plasmídeo HiBiT-RBD, use um micrograma da expressão HiBiT-RBD plasmid com um reagente de transfecção adequado. Incubar por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente, em seguida, adicione o volume total a cada poço da placa dropwise.
No dia seguinte, substitua o meio contendo a mistura de transfecção por meio completo. Observe bem o controle de transfecção 48 horas após a transfecção. Colete o supernatante em microtubos de 1,5 mililitro.
Adicione 500 microliters de 1X tampão de lise passiva ou PLB às células, depois incubar e agitar a placa por 15 minutos à temperatura ambiente para a lise celular. Em seguida, para avaliar o sinal de luminescência do bioreporter utilizando um ensaio de luciferase, primeiro preparar os componentes de reação e usar o supernatante como fonte do biorelador. Diluir o BiT grande e substrato para 1X antes de usar.
Transfira 50 microlitres do supernatante de cada poço ou tubo para uma placa de 96 poços e adicione 50 microliters de 1X grande BiT a cada poço. Incubar por cinco minutos em temperatura ambiente. Abra o software do luminômetro, adicione 50 microlitadores de substrato 1X a cada poço, coloque a placa no luminômetro e execute o software.
Para realizar o ensaio de detecção de anticorpos HiBiT-RBD, prepare o bioreporter HiBiT-RBD como descrito anteriormente e combine 50 microliters do HiBiT-RBD contendo supernante com um micrograma do anticorpo COMERCIAL SARS-CoV-2 RBD em um microtubo de 1,5 mililitro. Adicione 20 microliters de proteína de ligação de imunoglobulina ou proteína G à solução. Leve o volume total para 300 microliters adicionando PBS.
Incubar os tubos em um agitador de tubo ou rotador por 30 minutos. Centrífuga a 12.000 G por 30 segundos. Em seguida, descarte o supernaspe e lave com PBS.
Repita o processo três vezes para remover o HiBiT-RBD gratuito. Resuspenque as células em 50 microliters de PBS e transfira para uma placa de 96 poços. Adicione 50 microliters de 1X biT grande e espere por cinco minutos.
Em seguida, adicione 50 microliters de 1X substrato NanoLuc. Leia imediatamente o sinal de luminescência com um luminômetro. Prepare quantidades maiores do biorelato hibit-RBD para um ensaio de alto rendimento e combine 20 microliters de proteína magnética G com 50 microliters do supernatante HiBiT-RBD em cada poço de uma placa de 96 poços para cada amostra.
Adicione 10 microliters da amostra de soro a cada poço e leve o volume total a 150 microliters adicionando PBS. Incubar por 30 minutos em um shaker à temperatura ambiente. Em seguida, coloque a placa em uma arruela magnética para precipitar o complexo de anticorpos Protein G.
Descarte a solução na seção do meio de cada poço e adicione PBS para lavagem. Repita a etapa de lavagem pelo menos três vezes para remover o excesso de HiBiT-RBD. Adicione 50 microliters de 1X PBS e 50 microliters de 1X bit grande e incubar por pelo menos cinco minutos em temperatura ambiente.
Prepare o software luminômetro. Em seguida, adicione 50 microliters de substrato 1X. Coloque a placa na máquina, execute o software e regise os sinais.
Compare os sinais de amostras de soro, amostras de controle e sinal de fundo de poços vazios. Os sinais tanto do HiBiT-RBD contendo liseto celular quanto de sobrenante das células transfeinadas foram registrados para avaliar a fonte proteica apropriada. Os dados mostraram baixo fundo em comparação com um sinal forte quando ambas as partes foram combinadas.
A adição de Protein G ajuda a precipitação de anticorpos. O ensaio foi usado para comparar o sinal de um anticorpo neutralizante SARS-CoV-2 comercial com um IgG de controle. O sinal de anticorpo específico era robusto, enquanto o anticorpo de controle tinha perto do nível de fundo luminescente.
O vírus da estomatite vesicular oncolítico recombinante ou VSV com uma mutação na posição 51 da proteína M expressando RBD exógeno foi usado para vacinar camundongos. O soro coletado de camundongos vacinados produziu um sinal robusto em comparação com nenhum sinal em camundongos injetados com controle VSV. Este protocolo pode ser usado para detecção dos anticorpos SARS-CoV-2 em amostras de soro do paciente.
As etapas de lavagem após a incubação com protein G são fundamentais para reduzir o fundo. Além disso, é importante adicionar o substrato o mais rápido possível para evitar a perda de sinal. Com algumas etapas adicionais de otimização, o mesmo ensaio pode ser usado para analisar amostras de sangue e pode ser um método eficaz para determinar anticorpos anti-SARS-CoV-2 em amostras de sangue do paciente.
