使用基于HiBiT的生物报告器检测SARS-CoV-2受体结合域抗体

我的实验室一直从事COVID-19研究，我们最近开发了一种新型检测方法，使我们能够快速准确地检测SARS-CoV-2抗体。该协议概述了用于检测患者血清样本中抗SARS-CoV-2抗体的高通量测定方法，这在当前的大流行中至关重要。目前的大多数血清学检测会牺牲速度来提高灵敏度，反之亦然。

我们的数据显示，我们的检测方法既灵敏又具有快速的响应时间。为了生产足够数量的高HiBiT-RBD生物报告书，首先准备细胞培养。首先，制备含有10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素的完整Dulbecco改良鹰培养基。

然后在37摄氏度的水浴中加热介质。打开生物安全柜，使用70%乙醇对柜表面进行灭菌。要培养细胞系，请将其从零下80摄氏度或液氮中取出，然后在37摄氏度的水浴中解冻。

将解冻的细胞与至少10毫升的完整培养基混合。将细胞悬浮液移入15厘米培养皿中，并旋转板以均匀分布细胞。将培养皿置于37摄氏度，5%二氧化碳和85至95%湿度的细胞培养箱中。

在显微镜下观察细胞，直到汇合水平达到80%至90%在高汇合度下，取出培养基，用温PBS洗涤细胞，并加入3至5毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA以将细胞从表面分离。大约五分钟后，在显微镜下观察细胞。如果所有细胞都是漂浮的，则加入至少四毫升培养基，并将细胞悬浮液转移到新的无菌管中。

使用血细胞计数器计数细胞，并将100万个细胞加入六孔板的每个孔中进行转染。要进行HiBiT-RBD质粒的转染，请使用一微克HiBiT-RBD表达质粒和合适的转染试剂。在室温下孵育10至15分钟，然后将总体积滴入板的每个孔中。

第二天，用完整的培养基替换含有转染混合物的培养基。转染后48小时观察转染对照。将上清液收集在1.5毫升微管中。

向细胞中加入500微升1X钝化裂解缓冲液或PLB，然后在室温下孵育并摇动板15分钟以进行细胞裂解。接下来，要使用荧光素酶测定法评估来自生物报告者的发光信号，首先制备反应组分并使用上清液作为生物报告者的来源。使用前将大的BiT和底物稀释至1X。

将50微升上清液从每个孔或管转移到96孔板中，并向每个孔中加入50微升1X大BiT。在室温下孵育五分钟。打开光度计软件，向每个孔添加50微升的1X基板，将板放入发光计中并运行软件。

为了进行HiBiT-RBD抗体检测测定，如前所述制备HiBiT-RBD生物报告器，并将50微升含有HiBiT-RBD的上清液与1微克商用SARS-CoV-2 RBD抗体在1.5毫升微管中混合。向溶液中加入20微升免疫球蛋白结合蛋白或蛋白G。通过添加 PBS 将总体积增加到 300 微升。

将管子在管式振动器或旋转器上孵育30分钟。在12， 000 G下离心30秒。然后丢弃上清液并用PBS洗涤。

重复该过程三次以删除免费的HiBiT-RBD。将细胞重悬于50微升PBS中，并将其转移到96孔板中。加入50微升1X大BiT，等待5分钟。

然后加入50微升1X NanoLuc底物。立即使用发光计读取发光信号。为高通量测定制备大量HiBiT-RBD生物报告仪，并在每个样品的96孔板的每个孔中将20微升磁性蛋白G与50微升HiBiT-RBD上清液混合。

向每个孔中加入10微升的血清样品，并通过添加PBS使总体积达到150微升。在室温下在摇摇杯上孵育30分钟。然后将板放在磁性垫圈上以沉淀蛋白G抗体复合物。

将溶液丢弃在每个孔的中间部分，并加入PBS进行洗涤。重复洗涤步骤至少三次，以除去多余的HiBiT-RBD。加入50微升1X PBS和50微升1X大BiT，并在室温下孵育至少5分钟。

准备发光计软件。然后加入50微升1X底物。将印版放入机器中，运行软件并记录信号。

比较来自血清样品、对照样品和来自空孔的背景信号。记录来自含有细胞裂解物的HiBiT-RBD和转染细胞上清液的信号，以评估适当的蛋白质来源。数据显示，与两个部分组合在一起时的强信号相比，背景较低。

添加蛋白G有助于抗体沉淀。该测定用于将来自商业SARS-CoV-2中和抗体的信号与对照IgG进行比较。特异性抗体信号信号强劲，而对照抗体接近发光背景水平。

重组减毒溶瘤性水疱性口炎病毒或VSV在表达外源性RBD的M蛋白位置51处发生突变，用于为小鼠接种疫苗。从接种疫苗的小鼠收集的血清与注射对照VSV的小鼠相比产生了强大的信号。该协议可用于检测患者血清样本中的SARS-CoV-2抗体。

与蛋白质G孵育后的洗涤步骤对于减少背景至关重要。此外，尽快添加基板以避免信号丢失也很重要。通过一些额外的优化步骤，相同的测定可用于分析血液样本，并且可能是确定患者血液样本中抗SARS-CoV-2抗体的有效方法。