O processo de indução de hPSCs para células retinentais é complicado e demorado. Este protocolo otimizado pode gerar tecidos de retina com alta reprodutibilidade e sem custo. A vantagem deste protocolo é a quantificação do tamanho do EB e da densidade de revestimento para aumentar significativamente a eficiência e a repetibilidade da indução da retina a partir de hPSCs.
Com este método, todas as principais células da retina aparecem sequencialmente e recapitulam os principais passos do desenvolvimento da retina. Facilitará a modelagem da doença e a terapia celular para doenças degenerativas da retina. Demonstrando o procedimento, estamos com Yuanyuan Guan, um estudante de doutorado, e Bingbing Xie, um técnico do laboratório.
Comece preparando 50 mL de solução ECM adicionando 1 mL da terceira solução de estoque de 50 vezes a 50 mL de DMEM. Em seguida, adicione 1 mL desta solução ECM preparada para cada poço de uma placa de seis poços e incuba-a por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Prepare o meio de manutenção hPSC de acordo com a instrução do fabricante e pré-o à temperatura ambiente por 30 minutos.
Despeje um frasco criogênico de hPSCs de um tanque de nitrogênio líquido incubando-o em um banho de água a 37 graus Celsius por 30 segundos. Desinfete-o cuidadosamente usando um spray de álcool de 75% e coloque-o em um armário de biosegurança. Transfira a suspensão celular do frasco para um tubo de 15 milímetros.
Em seguida, adicione 5 mL de manutenção pré-aquecida meio gota a gota ao tubo usando uma pipeta de 5 mL, enquanto agita suavemente o tubo para misturar os hPSCs. Centrifugar o tubo a 170 vezes G por cinco minutos. Remova cuidadosamente a maior parte do supernante usando uma pipeta de 1 mL, deixando para trás aproximadamente 50 microlitres de supernascer para evitar a perda das células.
Suspenda a pelota com 1 mL de meio de manutenção por tubulação para cima e para baixo. Retire o ECM dos poços pré-revestidos e adicione 1,5 mililitros de meio de manutenção a cada poço. Em seguida, distribua 0,5 mililitros de suspensão celular em cada poço.
Agite suavemente a placa para distribuir uniformemente os hPSCs. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por pelo menos 24 horas para promover a adesão celular. Alterar o meio todos os dias e a passagem de hPSCs em 80% de confluência.
No dia-0, inicie a diferenciação removendo as células de confluência de 80% de um poço da placa de seis poços. Colete as células com solução de dissociação EDTA, conforme descrito no manuscrito do texto. Remova a solução EDTA e adicione 1 mL de meio de manutenção contendo 10 fluvastatina micromolar para parar a dissociação celular.
Colete as células com uma pipeta de 1 mL. Transfira a suspensão celular para uma placa de Petri ultra-baixa de 100 milímetros e adicione 9 mL de meio de manutenção contendo 10 fluvastatina micromolar ao prato. Agite suavemente o prato duas vezes para distribuir as células uniformemente.
Em seguida, coloque-o na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Depois que as células forem cultivadas por pelo menos 24 horas, observe-as sob o microscópio. Adicione 9 mL de meio de manutenção e 3 mL de NIM a um tubo de 15 mL.
Transfira as culturas celulares para um tubo de centrífuga de 15 mL e adicione 10 mL da mistura nim pré-aquecida ao prato. Centrifugar o tubo a 60 vezes G durante 3 minutos para coletar os agregados. Em seguida, remova o supernatante usando uma pipeta de 5 mL, deixando para trás aproximadamente 500 microliters para evitar a perda de células.
Adicione 2 mL da mistura ao tubo e transfira a suspensão de volta para a mesma placa de Petri. Agite suavemente o prato para distribuir uniformemente os agregados celulares. Em seguida, coloque o prato de volta na incubadora.
No dia-5, retire o ECM dos pratos pré-revestidos e adicione 10 mL de NIM pré-aquecido a cada prato. Pegue o prato que contém Ebs e verifique a qualidade dos EBs sob o microscópio, certificando-se de que eles são brilhantes e redondos. Colete todos os EBs em um tubo de 15 mL e deixe que eles se acomodem por 5 minutos.
Em seguida, remova a maior parte do supernante, deixando para trás cerca de 2 mL de médio. Depois de contar os EBs, semeou-os drop-by-drop a uma densidade de aproximadamente 2-3 EBs por centímetro quadrado em pratos revestidos contendo 10 mL de NIM. Agite delicadamente os pratos para distribuir os EBs uniformemente e coloque-os na incubadora por pelo menos 24 horas.
Use uma agulha de tungstênio ou uma agulha com uma seringa de 1 mL para desprender mecanicamente as vesículas ópticas morfologicamente identificáveis, juntamente com o epitélio pigmento de retina adjacente nos dias 28 a 35. Cultuá-los em suspensão. Coloque 50-60 vesículas ópticas em cada prato de cultura de baixa fixação de 100 milímetros, contendo 15 mL de RDM para formação organoide de retina.
Troque o meio a cada 2 a 3 dias até o dia 42. Para iniciar a diferenciação da retina, os HPSCs foram dissociados em pequenos aglomerados e cultivados em suspensão, que formavam EBs desde o Dia-1. No Dia-5, os EBs foram banhados nos pratos de cultura revestidos pelo ECM e as células migraram gradualmente para fora dos EBs.
No dia 16, o meio de indução foi substituído pelo RDM, fazendo com que os domínios da retina neural se formassem e gradualmente se projetassem do prato, bem como, células formando estruturas semelhantes a vesículas ópticas cercadas por células RPE. Durante os dias-28 a 35, organoides de retina constituídos pela retina neural, ligados a uma esfera RPE. De um lado, as células se formaram.
À medida que a diferenciação e especificação da retina progrediam, os hPSCs produziam subtipos de retina neural que gradualmente se alinhavam em camadas, imitando as características arquitetônicas de uma retina humana nativa. As células gânglios retinais foram geradas pela primeira vez a partir de progenitores da retina e acumuladas no lado basal da retina neurológica. Com este protocolo, os organoides da retina desenvolveram-se em fotorreceptores altamente maduros com ambos, varas e cones ricos.
As células fotorreceptoras estavam localizadas no lado apical, enquanto as células amacrinas, as células horizontais, as células bipolares e as células gliais muller estavam todas localizadas na camada intermediária da retina neural. Os pontos-chave deste protocolo são criar alta qualidade de Ebs e semeá-los na densidade certa.
