Oi, neste vídeo vamos mostrar como explorar os epitranscriptos m6A e m5C sobre infecção viral. Para começar o experimento, você precisará de 50 milhões de células para os não infectados e 50 milhões para a condição infectada. Para obter um conjunto de dados de alta qualidade após análise, você precisará alcançar uma infecção universal.
Aqui infectamos essas células com um vetor baseado em HIV e medimos o GFP codificado viralmente pela FACS. Neste caso, tivemos 80% das células infectadas e prosseguimos com o fluxo de trabalho começando com a extração total do RNA. Então dividimos as células em alíquotas de 10 milhões cada e as lisemos em 1 mL de Trizol.
Em seguida, adicionamos 200 microliter de clorofórmio ao lise celular e misturado por inversão. Neste ponto, deixamos o lise sentar por três minutos em temperatura ambiente e, em seguida, centrifugar todas as amostras em alta velocidade por 15 minutos a quatro graus. Você espera ver uma separação de fase em três fases diferentes, como é mostrado aqui.
O RNA está sentado na fase superior, então transfira cuidadosamente a fase aquosa para um tubo fresco, prestando atenção em não transferir a camada orgânica. Neste ponto, adicione 0,5 mL de isopropanol à fase aquosa e misture cuidadosamente por inversão. As amostras podem então ser incubadas uma hora a 80 graus para garantir a precipitação do RNA.
Após a centrifugação em alta velocidade, você deve ser capaz de ver uma boa pelota de RNA como é mostrado aqui. Descarte cuidadosamente o supernatante por inversão ou por pipetação, prestando atenção em não interromper a pelota. Em seguida, lave a pelota de RNA com um mL de etanol de grau molecular de 75%.
E vórtice da amostra brevemente. Após a centrifugação, certifique-se de recuperar uma boa pelota de RNA branca. Descarte o supernatante e deixe a pelota de RNA secar por 15 minutos em temperatura ambiente.
Resuspenda cada pelota em 20 microliter de água e acumule todas as amostras da mesma condição juntos. O RNA total está pronto para o isolamento do mRNA por seleção poli-A. Para cada amostra de 75 microgramas de RNA, prepare 200 microliter de contas magnéticas oligo-DT e lave-as em um mL de tampão de ligação.
Coloque o tubo em um suporte magnético e deixe que as contas se liguem ao ímã durante uma mistura. Descarte o sobrenante e repita o procedimento para uma segunda lavagem. Em seguida, remova as contas das bancadas magnéticas e resumita cuidadosamente em 100 microliter de tampão de ligação.
Neste ponto, prepare a amostra de RNA dividindo-as em 75 microgramas de RNA por aliquot resuspended em 100 microliter de água. Adicione 100 microliter de tampão de ligação e incubar por dois minutos a 65 graus. Em seguida, gire as amostras e incubar no gelo.
Adicione então 100 microliter de contas magnéticas lavadas a cada amostra de RNA e permita a ligação em uma roda giratória por 15 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, coloque o tubo de volta em um rack magnético e deixe-os incubar por um minuto. Em seguida, recupere o supernaente em um tubo fresco e mantenha-o de lado para uma segunda rodada de isolamento.
Lave as contas duas vezes com 200 microliter de tampão de lavagem e, em seguida, proceda para a eluição. A fim de elute poly-A selecionado RNA a partir das contas magnéticas, adicione 20 microliter de TRIS HCl gelado a cada amostra e pipeta cuidadosamente. Em seguida, incubar suas amostras a 80 graus por dois minutos para liberar o RNA das contas.
Transfira o supernante contendo RNA poli-A selecionado para um tubo fresco, tomando cuidado para evitar a transferência de contas. O passo de eluição, bem como a etapa de isolamento, devem ser repetidos duas vezes para aumentar o rendimento do mRNA. MRNA está agora pronto para entrar no pipeline meRIP-Seq na etapa de fragmentação ou ir diretamente para a conversão de bisulfato.
O primeiro passo para entrar no gasoduto meRIP-Seq consiste na fragmentação do mRNA. Para isso, você precisa de cinco microgramas de mRNA divididos em alíquotas de 18 microliter em tubos de 0,2 mL. Para garantir dados consistentes, é fundamental trabalhar rapidamente e com apenas poucas amostras no momento.
Para este experimento, a fragmentação foi otimizada para obter fragmentos de tamanho entre 115 e 200 nucleotídeos. Em seguida, adicione dois microliter de reagente de fragmentação a cada tubo contendo 18 microliter de mRNA sendo cuidadosos ao depositar a gota na parede do tubo. Gire todas as amostras para permitir o contato entre o reagente e o RNA ao mesmo tempo e incubar a 70 graus por 15 minutos.
Uma vez que a incubação termine, pare a reação adicionando dois microliter de 0,5 M EDTA. Neste ponto, você pode purificar seu mRNA fragmentado com seu método de escolha e proceder a um controle de qualidade RNA por analisador de fragmentos. Esta etapa é opcional, mas permitirá avaliar o tamanho do fragmento antes de engajar a precipitação do RNA.
Como você pode ver aqui na quarta pista, nós obtemos para o nosso fragmento amostral de cerca de 150 nucleotídeos cada. Em seguida, prosseguimos com meRIP-Seq. O primeiro passo consiste em algumas contas magnéticas A/G com anticorpos anti-m6A ou controles IgG.
Para cada plano de reação, transfira 25 microliter de contas magnéticas para um tubo fresco. Por favor, note que você precisará de pelo menos uma condição específica m6A e uma condição de controle. Lave cada 25 microliter de contas com 250 microliter de tampão IP.
Levemente resuspenque as contas pipetando para cima e para baixo e coloque o tubo no rack magnético por um minuto, a fim de permitir a separação das contas. Remova e descarte o supernaspeito, prestando atenção em não aspirar as contas magnéticas e repetir o passo de lavagem uma vez. Em seguida, resuspenja as contas magnéticas em 100 microliter de tampão IP por cada 25 microliter de volume original de contas.
Prepare e rotule um tubo por cada condição. No nosso caso, teremos dois tubos para a condição infectada, um para m6A e um para controle de IgG, e dois tubos para a condição não infectada. Em seguida, adicione 100 microliter de contas lavadas em cada tubo.
As contas estão agora prontas para serem acoplado a anticorpos específicos ou controles IgG. Adicione cinco microgramas de anticorpo anti-m6A específico ou anticorpo de controle anti-IgG a cada tubo contendo 100 microliter de contas magnéticas lavadas. Permita a conjugação de contas de anticorpos incubando o tubo 30 minutos em uma roda giratória.
Enquanto isso, prossiga com a preparação da amostra. Para cada condição planejada, seja de controle m6A ou IgG, seu material inicial será de 2,5 microgramas de mRNA fragmentado resuspended 100 microliter de água. Para ter um volume final de reação de 500 microliter, adicione 295 microliter de água a cada amostra.
Adicione então cinco microliter do inibidor RNAase concentrado em 40 unidades por microliter para uma quantidade total de 200 unidades por amostra e misture suavemente. Por fim, adicione 100 microliter de 5X tampão IP concentrado a cada tubo. As amostras estão prontas para a reação de precipitação imunológica.
Recupere as contas magnéticas acoplado com anticorpos da roda giratória e gire-as para baixo. Adicione então 500 microliteres das amostras previamente preparadas a cada 100 microliteres de contas acoplado aos anticorpos específicos. Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo várias vezes para resuspensar completamente as contas.
Incubar-os ou sua reação meRIP em uma roda giratória a quatro graus durante duas horas. Uma vez que a incubação acabou, gire cada tubo e coloque-os em um rack magnético por um minuto para permitir a separação das contas. Em seguida, remova a fração desvinculada e coloque-a em um tubo fresco e mantenha-a para análise mais aprofundada, se necessário.
Remova o ímã do rack e resuspenja todas as amostras em 500 microliter de tampão IP. Resuspenda cada amostra cuidadosamente, pipetando para cima e para baixo. Insira o ímã no rack, incuba por um minuto e, em seguida, remova cuidadosamente o sobrenatário.
Repita a lavagem duas vezes e, em seguida, proceda com a eluição. Para cada par de amostras, m6A específica e controle, prepare 225 microliter de tampão de eluição contendo 20 milimiliar de m6A purificado. Em seguida, adicione 100 microliter de tampão de eluição por amostra.
Incubar todas as amostras uma hora a quatro graus em um roqueiro. Em seguida, colete todas as amostras de RNA enriquecidas m6A em um tubo fresco e proceda com uma segunda rodada de eluição. Purifique o RNA enriquecido m6A com seu método de escolha e, neste momento, as amostras estão prontas para preparação e sequenciamento da biblioteca.
Para investigar a modificação do M5C, usamos conversão de bisulfito. Inicie o experimento com 500 nanogramas de RNA poli-adenilado. Embora opcional, adicionar à sua amostra 500 picogramas de RNA poli-A esgotado para garantir a representação ribossômica e 0,5 microliter de sequência sintética comercialmente disponível permitirá que você avalie a taxa de conversão de bisulfoto no sequenciamento.
Ajuste sua amostra para um volume final de 20 microliter na água e, em seguida, adicione 130 microliter de reagente de conversão de RNA a cada amostra. Misture cuidadosamente por tubos para cima e para baixo e gire para baixo toda a amostra para ter certeza de que não há gotas deixadas na lateral dos tubos. Incubar todas as amostras em uma máquina PCR para três ciclos de desnaturação de 70 graus por cinco minutos e conversão de bisulfato a 54 graus durante 45 minutos.
Realize a desaminação na coluna adicionando diretamente em uma coluna vazia, 250 microliter de buffer de ligação de RNA, 150 microliter da sua amostra convertida de bisullfita. Misture a amostra por pipetação para cima e para baixo, mas preste atenção em não tocar nos filtros da coluna. Adicione 400 microliter de 95-100% etanol à mistura de tampão de ligação de RNA da amostra diretamente na coluna.
Feche a tampa e misture imediatamente por inversão. Gire sua amostra por 30 segundos e descarte o fluxo. Lave sua coluna com tampão de lavagem e adicione 200 microliter de solução de dessefonação ao centro de cada coluna.
Incubar toda a sua amostra por 30 minutos em temperatura ambiente. Gire a amostra por 30 segundos e, em seguida, prossiga com duas rodadas de lavagem. Adicione 400 microliter de tampão de lavagem a cada amostra, centrífuga por 30 segundos a toda velocidade e descarte o fluxo-through.
Coloque a coluna em um novo tubo vazio e elute o bisullfita convertido RNA em 20 microliter de água. Controle a eficiência de conversão de bisulfato pelo RT-qPCR e, em seguida, proceda à preparação e sequenciamento da biblioteca. Após a análise biointicética, aqui está um exemplo de resultados que você pode obter com este fluxo de trabalho.
Aqui comparamos o epitranscriptome das células infectadas pelo HIV versus as células não infectadas. a 24 horas após a infecção. No painel A, você pode ver os resultados que obtemos explorando o epitranscriptome m6A.
Neste gráfico, traçamos as leituras enriquecidas do m6A sobre a análise de meRIP-Seq. Podemos ver que um dedo de zinco está hipermetilado 24 horas após a infecção. Realizamos o mesmo tipo de análise para a investigação de epitranscrito m5C no painel B.In este gráfico, cada citosina não metilada é exibida em vermelho, enquanto a proporção de citosina que foi metilada m5C é mostrada em azul.
Como você pode ver, PHLPP1, todas as três citosinas que são hiper-metiladas 24 horas após a infecção pelo HIV. No geral, este fluxo de trabalho permite investigar tanto o epitranscriptome M6A quanto o m5C de células infectadas e pode ser aplicado como tal em partículas virais também. A compreensão da infecção viral é capaz de modificar a paisagem epitransomica hospedeira nos dará acesso a uma nova camada de regulação.
A investigação de transcrições diferenciadas metiladas sobre infecção viral fornecerá, naturalmente, um recurso valioso para uma nova intervenção terapêutica. No link aqui abaixo você pode encontrar nosso recurso de acesso aberto para a investigação da transcrição diferencial metilada sobre a infecção pelo HIV ao longo do tempo.
