Imagens de células vivas de matrizes de células únicas chamadas LISCA também são uma leitura automatizada dos cursos de tempo fluorescente de centenas de células individuais. A vantagem da abordagem é que as respostas celulares individuais são registradas a partir de células espacialmente isoladas em micro ambientes idênticos, permitindo uma análise eficiente de emissões com grandes estatísticas. Para fabricar uma matriz unicelular, use um bisturi para cortar uma única obra-prima dos PDMs contendo seis tiras de pó micro da camada PDMs, e coloque a obra-prima no banco do laboratório com o micro padrão voltado para cima.
Use uma lâmina de barbear para cortar cada uma das seis listras de micropattern em um selo PDMs, cortando algumas das áreas padronizadas para garantir que as bordas do selo estejam abertas. Em seguida, arranhe cuidadosamente a folha protetora do deslizamento de cobertura de um slide de seis câmaras para marcar as posições do canal do slide e coloque o deslizamento de tampa no banco com a folha protetora voltada para baixo. Use pinças para colocar os selos na tampa nas posições marcadas do canal, com os padrões micro voltados para baixo, e verifique o acessório dos selos sob um microscópio.
Os quadrados em contato com o slide parecerão mais escuros que o interespaço. A qualidade do padrão é diminuída por quadrados que não estão devidamente ligados ao slide. Se os selos tiverem fixado com segurança, trate o deslizamento da tampa e os selos com plasma de oxigênio a 0,2 milibarbares de pressão e aproximadamente 40 Watts por três minutos para fazer as superfícies entre os selos PDMs e o deslizamento de cobertura hidrofílico.
No final da limpeza do plasma, coloque a tampa em um armário de biossegurança e adicione 15 microliters de solução de poli-l-lisina pelílica a cada selo para que a solução seja absorvida no padrão hidrofílico do selo. Após 20 minutos, enxágue os selos com um mililitro de água ultrapura. Use pinças para remover os selos do slide e enxágue a tampa uma segunda vez com um segundo mililitro de água ultrapura.
Quando o deslizamento da tampa secar completamente, conecte um slide pegajoso de seis canais ao deslizamento da tampa, tomando cuidado para que as micro áreas padronizadas se alinhem com a parte inferior dos canais. E adicione 40 microliters de PBS e 40 microliters de solução de fibronectina a cada canal. Para misturar as duas soluções, remova 40 microlitadores de um reservatório e adicione-o ao reservatório oposto do mesmo canal três vezes para gerar uma solução homogênea.
Quando todos os canais tiverem sido misturados, incubar o slide por 45 minutos em temperatura ambiente antes de lavar cada canal três vezes com 120 microliters de PBS por lavagem. Troque o PBS para 37 graus Celsius, meio de crescimento celular totalmente suplementado nos canais, adicionando 120 microliters médio a um reservatório e remova-o do reservatório oposto. Adicione 40 microliters de 400.000 células por células mililitros suspensão de interesse e 40 microliters de meio de crescimento celular para cada canal, e misture a solução celular com o meio como demonstrado.
Após a mistura, remova 40 microliters de suspensão de cada canal para que apenas os canais sejam preenchidos com suspensão celular, e coloque o slide em uma incubadora de cultura celular. Após uma hora, verifique a adesão celular por microscopia de contraste de fase, e adicione 120 microliters de 37 graus Celsius de crescimento celular médio a cada canal, em seguida, retorne o slide para a incubadora de cultura celular por mais três horas. Para configurar um sistema de perfusão, conecte uma seringa de um mililitro preenchida com 37 graus Celsius médio de crescimento celular ao tubo de entrada do sistema, e use a válvula para encher o tubo com meio.
Conecte o tubo de entrada ao reservatório de um canal, tomando cuidado para que nenhuma bolha de ar esteja presa, e conecte um conector serial ao reservatório em frente ao tubo de entrada do canal atual. Conecte o resto dos canais conforme demonstrado até que o número necessário de canais esteja conectado em série. E conecte o tubo de saída diretamente ao reservatório livre do canal final.
Em seguida, encha o tubo conectado com meio para confirmar que o sistema de perfusão não vaza. Para imagens de lapso de tempo das células, para configurar um protocolo de lapso de tempo para registrar uma imagem de contraste de fase e uma imagem de fluorescência, defina a configuração óptica para imagem de contraste de fase e imagens de fluorescência. Use um objetivo de 10 vezes, os filtros de fluorescência apropriados e um sistema automatizado de correção de foco para garantir uma melhor qualidade de imagem para as medições de longo prazo.
Selecione um tempo de exposição de 10 milissegundos para a imagem de contraste de fase e um tempo de exposição de 750 milissegundos para registrar a intensidade de fluorescência EGFP. Defina um cronograma com um intervalo de tempo de 10 minutos entre os loops consecutivos através da lista de posições e um tempo de observação de 30 horas. Em seguida, coloque os seis canais deslizando no único porão no suporte amostral da câmara de aquecimento Celsius de 37 graus Celsius do microscópio e tape o tubo do sistema de perfusão para o palco.
Insira as extremidades livres dos tubos de saída em um tubo cônico de 15 mililitros para coletar os resíduos líquidos. E defina a lista de posições para a medição do lapso de tempo de varredura, tomando cuidado para que o número de posições possa ser escaneado dentro do intervalo de tempo definido entre loops consecutivos através da lista de posição. Em seguida, inicie a medição do lapso de tempo.
Para transfecção das células com um marcador fluorescente, use uma seringa para lavar o sistema de tubos com um mililitro de 37 graus Celsius PBS, tomando cuidado para que o estágio do microscópio não se mova. Após a descarga, encha o sistema com 300 microliters de soro médio reduzido suplementado com o mRNA de interesse, a uma concentração final de 0,5 nanogramas de mRNA por microlitera, e permita que os lipoplexes incubam por uma hora. No final da incubação, lave o sistema com um mililitro de 37 graus Celsius meio de crescimento celular completo para remover qualquer mRNA não vinculado.
Ao final da análise, visualize os canais listados no menu do canal e role os prazos para inspecionar as células pré-eleitas e seus sinais fluorescentes integrados. Clique em uma célula de interesse para destacar seu curso de tempo de fluorescência ou clique em um curso de tempo para encontrar a célula correspondente. Pressione shift ao clicar em uma célula para selecioná-la ou dese selecioná-la.
Dese selecione todas as células que não sejam viáveis ou não se limitem a um local de adesão ou que estejam anexadas a outra célula para excluí-las de análises posteriores. Quando todas as células forem selecionadas ou desselecidas adequadamente, salve os cursos de tempo de célula única para a área celular e a fluorescência integrada em um diretório apropriado. Para quantificar o tempo de início da tradução após a transfecção e a força da expressão EGFP celular, um modelo de tradução de três estágios pode ser empregado.
A solução de modelo para EGFP pode ser equipada para cursos de tempo de célula única como ilustrado. Aqui, podem ser observados histogramas do tempo de início da tradução e a taxa de expressão das células transfetadas lipoplex. Como ambos os parâmetros são estimados para cada célula, a correlação desses parâmetros pode ser analisada como demonstrado no gráfico de dispersão, e comparada com células transfeinadas com nanopartículas lipídicas.
Como ilustrado, as células transfectadas com nanopartículas lipídicas apresentam menos variabilidade celular-célula em comparação com células transfeinadas com lipoplexes. E a média populacional demonstra um início mais rápido de tradução, bem como uma maior taxa de expressão. Nossa abordagem também pode ser adaptada a métodos alternativos de micro-padronização.
O mais importante para o LISCA é um bom confinamento celular e uma combinação de análise automatizada de imagens com uma supervisão conveniente do usuário. Como você viu, o comportamento celular é heterogêneo. E filmes de lapso de tempo unicelulares fornecem acesso a dinâmicas imparcial das redes bioquímicas inerentes.
Por exemplo, na expressão verde, apoptose ou ensaios de morte celular.
