Esta técnica facilita a visualização de encontros de adutos de DNA marcados com antígeno replisome e pode ser estendida às interações de qualquer proteína com uma estrutura de DNA ou lesão passível de imunodetecção. Este método pode ser usado para avaliar as frequências de interação dentro de células individuais, em vez de através de uma população, e permite a visualização de interações dependentes do ciclo celular in situ sem danificar as células. Quem demonstrará o procedimento será Ishani Majumdar, pós-doutora do Laboratório Seidman.
No dia anterior ao experimento, semeou-se 1,5 vezes 10 até a quinta célula em dois mililitros de meio em placas de cultura com fundo de vidro de 35 milímetros pré-tratadas com solução adesiva celular. No dia seguinte, substitua o sobrenadante em cada prato por um meio de TMP Dig micromolar de 37 graus Celsius Five micromolar para as culturas de células confluentes de 50 a 70% e retorne as placas à incubadora de cultura celular por 30 minutos para permitir que o TMP Dig se equilibre. Enquanto as células estão incubando, pré-aqueça uma caixa UV a 37 graus Celsius.
Ao final do equilíbrio, transferir as placas para a caixa pré-aquecida para expor as células a uma dose de luz UVA de três joules por centímetro quadrado de cinco minutos e substituir os sobrenadantes por dois mililitros de meio de cultura fresco pré-aquecido antes de retornar as placas à incubadora de cultura celular por uma hora. Ao final da incubação, lavar suavemente as culturas com PBS e fixar as células com um mililitro de formaldeído a 0,1% em PBS por cinco minutos à temperatura ambiente. Ao final da incubação, lavar as células uma vez com PBS antes de tratar as células duas vezes com 80 microlitros de tampão de extração do citoesqueleto suplementado com RNase por cinco minutos à temperatura ambiente por tratamento para remover o citoplasma.
Após a segunda incubação, lavar as células com dois mililitros de PBS três vezes antes de fixar as células com um mililitro de formaldeído a 4% em PBS por 10 minutos à temperatura ambiente. Após a segunda fixação, lavar as células três vezes com PBS, como demonstrado, seguido de tratamento com um mililitro de metanol 100% frio por 20 minutos a 20 graus Celsius negativos. Ao final da incubação, lavar as células três vezes em dois mililitros de PBS, seguido de uma incubação de 10 minutos em 80 microlitros de cinco milimolares Triton X-100 a quatro graus Celsius.
Ao final da incubação, tratar as células com 100 microlitros de EDTA de cinco milimolares em PBS, suplementado com um microlitro de 100 miligramas por mililitro de RNase A por 30 minutos a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, lavar as células três vezes em PBS antes de armazená-las em albumina de soro bovino a 5% e soro de burro a 10% em PBS em câmara úmida durante a noite a quatro graus Celsius. Para realizar um ensaio de ligadura de proximidade, adicione 40 microlitros da solução de anticorpos primários de interesse ao centro de cada placa e incube as placas na câmara úmida por uma hora a 37 graus Celsius.
Ao final da incubação, lavar as células três vezes com dois mililitros de PBST antes de adicionar 40 microlitros de solução de sonda PLA recém-preparada a cada prato por uma hora de incubação na incubadora de cultura celular. Ao final da incubação, lavar as células com três lavagens de 10 minutos em dois mililitros de tampão A em uma plataforma basculante à temperatura ambiente. Após a última lavagem, adicionar 40 microlitros de mistura de ligadura recém-preparada a cada placa para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius, seguida de três lavagens de dois minutos em tampão A na plataforma basculante.
Após a última lavagem, adicione 40 microlitros de solução de amplificação recém-preparada a cada placa para uma incubação de 100 minutos a 37 graus Celsius em uma câmara úmida. Ao final da incubação, lavar as células seis vezes com tampão B fresco por 10 minutos por lavagem na plataforma basculante. Após a última lavagem do tampão B, lavar as células uma vez com o tampão B 0,01x por um minuto à temperatura ambiente antes de marcar com os anticorpos secundários apropriados na câmara úmida por 30 minutos a 37 graus Celsius.
Ao final da incubação, lavar as amostras com três lavagens de 10 minutos em plataforma basculante em PBST à temperatura ambiente antes de montá-las em meio de montagem suplementado com DAPI. Dentro de quatro dias após a montagem, obtenha imagens de pelo menos 100 observações por amostra ou células de condição em um microscópio de epifluorescência ou confocal, usando as mesmas configurações de exposição para amostras experimentais e controle. O tag Dig pode ser visualizado por imunofluorescência para revelar a presença de ligações cruzadas interstrand em todo o núcleo.
Para visualizar a interação de replisomes com ligações cruzadas interstrand, o PLA pode ser aplicado para visualizar a frequência de associação do MCM5 e do tag Dig, uma hora após a introdução do crosslink interstrand. Como o estresse de replicação ativa a ATR quinase, o PLA entre pMCM duas serina 108 e o tag Dig também é positivo. Os resultados do PLA de núcleos individuais podem ser apresentados em uma reconstrução tridimensional permitindo a visualização de encontros de ligações cruzadas interstrand replisome ao longo do núcleo.
A análise do Replication Fork indica que os encontros de ligações cruzadas entre cadeias demonstram um fenômeno inesperado de reinicialização da replicação, já que as proteínas do complexo GINS não conseguem exibir o sinal de PLA com as ligações cruzadas interstrand. Em contraste, o ensaio com CD 45 é positivo, indicando que a outra proteína de bloqueio está retida. Quando as células são incubadas com um inibidor de ATR, o reinício é completamente suprimido e os PLAs GINS Dig fortemente positivos.
O tratamento CSK+R é essencial para reduzir o sinal de fundo. Certifique-se de revestir as placas com um adesivo celular e prefixar com 0,1% FA ou as células descascarão a placa.
