Name: microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches
Uploaded: 2020-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
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Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da National Defense Medical College e de uma bolsa de pesquisa em Saúde e Ciências do Trabalho para pesquisas sobre doenças intratáveis do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar, Japão.

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa Animal da National Defense Medical College (nº 16058). Os animais foram mantidos em chow de laboratório padrão (CLEA Japan Inc, Tóquio, Japão). Os animais de laboratório foram tratados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde.
1. Coleta e separação de linfócitos
NOTA: Uma vez que os linfócitos devem ser frescos e não podem ser armazenados, eles devem ser coletados de ratos para cada experimento. Além disso, os linfócitos gut-tropic devem ser coletados diretamente do duto torácico onde circulam. Espera-se que todos os procedimentos sejam concluídos dentro de 6 horas, e todos os instrumentos, luvas e superfícies estejam limpos. Para manter os animais em estado fisiologicamente estável, todos os soro fisiológicos e outros fluidos utilizados no experimento devem ser mantidos aquecidos.
<ol><li>Forme um tubo de canulação (1 mm de diâmetro) como uma curva de heparina (um raio de cerca de 5 mm) depois de mergulhá-lo em água quente (cerca de 80-90 °C) e fixá-lo em uma placa de plástico usando fita adesiva por algumas horas de antecedência.</li>
	<li>Anestesiar um rato Wistar macho (8-12 semanas) com injeção intraperitoneal de uma mistura de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) e Betulphar (2,5mg/kg) e cortar o cabelo do abdômen usando um cortador de cabelo. Retire o cabelo firmemente após a barba para que o cabelo não entre na cavidade abdominal.</li>
	<li>Após confirmar que a profundidade estável da anestesia necessária para o procedimento é obtida por beliscão do dedo do pé, faça uma incisão com tesoura cirúrgica horizontalmente da linha média para a área subcostal esquerda. Tenha cuidado para não danificar os vasos sanguíneos no peritônio parietal observando os vasos sob luz.</li>
	<li>Enrole o estômago com gaze molhada e mova o estômago suavemente para o lado de fora do corpo para revelar os órgãos retroperitoneais. Insira um entalhe entre os músculos eretores da coluna vertebral e o tecido adiposo usando uma tesoura cirúrgica e separe-os sem rodeios com os dedos.</li>
	<li>Retire cuidadosamente o tecido conjuntivo ao redor do duto torácico. O excesso de tecido conjuntivo aumenta com a idade. Expor o duto torácico de pouco abaixo das cruzes esquerdas do diafragma caudal até que um comprimento de 20 mm do ducto torácico fosse visível. Separe suavemente as aderências entre o ducto torácico e a aorta usando pinças de precisão ou cotonetes de algodão molhados.<ol>
<li>Realize este processo com cuidado porque alguns ratos têm artérias ramificadas da artéria abdominal atravessando o ducto torácico ou um curto ducto torácico devido a uma posição mais alta do plexo linfático (pequenos dutos torácicas se espalhando como teias de aranha). Evite contato desnecessário com o ducto torácico para evitar induzir edema.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplique uma ligadura por uma corda (3-0 de seda) no duto torácico logo abaixo das crus esquerdas do diafragma. O ducto torácico caudal fica distendido.</li>
	<li>Faça um orifício (5 mm de diâmetro) na parede abdominal esfaqueando a borda de corte da tesoura cirúrgica, passe o tubo de canulação curvado do grampo de cabelo e liga o tubo no músculo iliopsoas em um ponto. Encha o tubo de canulação com soro fisiológico normal contendo heparina de 10 U/mL.</li>
	<li>Depois de colocar uma corda (3-0 de seda) sob o ducto torácico distendido, esfaqueie o ducto torácico com a borda afiada de um tubo de canulação, cannulate-o em direção à cauda cerca de 5 mm, e liga o duto torácico com tubo de canulação para fixação.</li>
	<li>Para fornecer soro fisiológico para evitar a desidratação, crie um orifício (3 mm de diâmetro) na parede anterior do antrum do estômago usando pinças de precisão e passe o tubo de silício (2 mm de diâmetro) para o duodeno através do anel pilórico. Depois de costurar uma ferida e manter os animais nas gaiolas de Bollman, comece a infundir soro fisiológico carregado de açúcar no duodeno de cada rato a partir do tubo de silício a uma taxa de fluxo de 3 mL/h. Cubra toda a gaiola com uma toalha de papel para mantê-la aquecida.</li>
	<li>Fixar o tubo de canulação ao orifício no centro da tampa de um tubo cônico de 50 mL no gelo contendo heparina de 6 U/mL, soro bovino fetal de 10% e meio RPMI 1640 (pH 7,4; ver a tabela de materiais) e coletar linfócitos de ducto torácico (TDLs) no gelo. Tenha cuidado para não entrar em contato com a ponta do tubo para a parede do tubo cônico para evitar a oclusão do tubo cannulado devido à formação de coágulos fibrinas dentro do tubo. O fluido linfático (cerca de 20 mL) incluindo cerca de 1,0 x 108~109 linfócitos pode ser obtido em 6 horas. Para obter os linfócitos sob anestesia completa, o plano de anestesia é monitorado e o fluxo linfático é observado adequadamente. Os mesmos anestésicos são adicionados na mesma dose cerca de 3 horas depois que ratos são colocados na gaiola de Ballman para obter anestesia profunda continuamente por 6 horas.</li>
</ol>2. Rotulagem de linfócitos com carboxyfluorescein diacetate éster succinimidyl (CFDSE)
<ol><li>Dissolver CFDSE (Tabela de Materiais) em sulfóxido de dimetil (DMSO) a 15,6 mM (500 μg de CFDSE dissolvido em 60 μL de DMSO).</li>
	<li>Incubar linfócitos (1 x 108~109) em 50 mL de RPMI 1640 com 50 μL de solução CFDSE por 30 min a 37 °C, como descrito anteriormente10.</li>
</ol>3. Configuração experimental para estudos microvasculares
<ol><li>Anestesize os ratos receptores (8-12 semanas) com injeção intraperitoneal de uma mistura de Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) e Betulphar (2,5mg/kg) e confirme a profundidade da anestesia por pinça do dedo do dedo. Molhe o abdômen antes de preparar a pele para minimizar a contaminação do cabelo. Em seguida, abra o abdômen do receptor Wister rato através de uma incisão midline.</li>
	<li>Coloque um rato em uma placa portátil de aço inoxidável (cerca de 120 x 300 mm) com um orifício de retângulo ao redor do centro coberto com um escorregador de vidro (24 x 50 mm). Escolha cerca de 10 cm do segmento ileal, incluindo PPs para observação.</li>
	<li>Mantenha o intestino o mais quente possível e úmido com salina tamponada de fosfato (PBS) aquecida a 37 °C. Mergulhe a gaze que é usada para cobrir o intestino delgado com PBS.</li>
	<li>Ao mesmo tempo em que dá anestesia contínua com isoflurane de 2 % (ver tabela de materiais), coloque o slide no palco do microscópio e escolha áreas adequadas para observação da microcirculação em PPs onde alguns HEVs estão correndo pelo serosa. Os PPs variam em tamanho; os maiores são adequados para observação da microcirculação usando CLSM. O intestino delgado não é reto em lugares; um segmento reto de pelo menos 2 cm de comprimento sem qualquer tensão é adequado para observação.</li>
	<li>Cubra o segmento intestinal adjacente e mesenteria com algodão absorvente encharcado com PBS. Coloque o segmento do intestino entre duas bolas de algodão enroladas e posicione-o o mais longe possível do corpo do rato para evitar que ele seja vibrado pelos batimentos cardíacos e respiração do rato.</li>
	<li>Usando uma seringa de 1 mL, injete lentamente (mais de 1 min) TDLs rotulados com CFSE (1 x 108 células) na veia jugular dos ratos receptores. Uma injeção intravenosa rápida pode influenciar a circulação sistêmica.</li>
</ol>4. Microcirculação de linfócitos
<ol><li>Monitore continuamente os TDLs na microvasculatura de PPs usando CLSM e grave em um computador por 3 horas usando fotografia de lapso de tempo em intervalos de 30 s. A profundidade do serosa ao HEV de PPs é de cerca de 25 μm, permitindo a observação dos vasos linfáticos estroma e capilar a uma profundidade de 30 μm.</li>
	<li>Injete o Texas Red-dextran (25 mg/kg) na veia jugular de cada rato receptor para manchar a corrente sanguínea e Hoechest 33342 (5 mg/kg) para manchar os núcleos celulares.</li>
	<li>(Opcional) Para quantificar a dinâmica do linfócito, defina linfócitos aderindo aos HEVs por mais de 30 segundos como "linfócitos adesivos" e linfócitos emigrando de HEVs para stroma como "linfócitos migratórios". Em seguida, calcule a porcentagem média de migração (linfócitos migratórios / linfócitos adesivos + linfócitos migratórios) por campo de visão (aproximadamente 0,3 mm2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+immunity+in+gut+and+lymphoid+cell+trafficking.">Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking.</a> Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).</li><li>Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+control+of+lymphocyte+trafficking:+a+general+overview.">Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview.</a> Immunology. 116, 1-12 (2005).</li><li>Yopp, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingosine-1-phosphate+receptors+regulate+chemokine-driven+transendothelial+migration+of+lymph+node+but+not+splenic+T+cells.">Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells.</a> The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).</li><li>Lucke, S., Levkau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+functions+of+sphingosine-1-phosphate.">Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).</li><li>Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+collection+of+lymph+from+the+liver,+small+intestine,+or+thoracic+duct+of+the+rat.">Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat.</a> The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).</li><li>Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+of+Intestinal+Lymphoid+Follicles+in+Rat+Peyer's+Patches.">Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).</li><li>Miura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Demonstration+of+Sequential+Migration+Process+of+Lymphocyte+Subpopulations+in+Rat+Peyer's+Patches.">Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches.</a> Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).</li><li>Tomura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cellular+movement+in+vivo+with+photoconvertible+fluorescence+protein+"Kaede"+transgenic+mice.">Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice.</a> Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).</li><li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+of+Infected+Peyer's+Patches+Arises+From+Global,+Interferon-Receptor,+and+CD69-independent+Shutdown+of+Lymphocyte+Egress.">Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress.</a> Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).</li><li>Higashiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-Selectin-Dependent+Monocyte+Recruitment+Through+Platelet+Interaction+in+Intestinal+Microvessels+of+LPS-Treated+Mice.">P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice.</a> Microcirculation. 15, 441-450 (2008).</li><li>Shirakabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amelioration+of+colitis+through+blocking+lymphopcytes+entry+to+Peyer's+patches+by+sphingosine-1-phosphate+lyase+inhibitor.">Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).</li><li>Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Microscopy:+Visualizing+Immunity+in+Context.">Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li><li>Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+the+Landscape+of+In+Vivo+Immunity:+Insights+from+Dynamic+In+Situ+Imaging+of+Secondary+Lymphoid+Tissues.">Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues.</a> Immunity. 21, 331-339 (2004).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui descrevemos um protocolo para coletar linfócitos ingenuos e trópicos ingenuos e observar sua migração em PPs de ratos. Esses procedimentos podem revelar como os linfócitos se movem na microvasculatura dos PPs e possibilitar comparar visualmente sua dinâmica em uma condição normal ou medicada. A observação direta dessas dinâmicas tem muito mérito em obter uma pista para modificação imunológica por algumas drogas, embora o período observacional seja limitado a apenas algumas horas.
Mencionamos algumas dicas nos métodos. Entre eles, um dos procedimentos mais delicados é que o operador deve cannular o ducto torácico de forma rápida e precisa. Se uma operação demorar muito tempo e envolver danos desnecessários, ocorrem sangramentos significativos e inflamação, resultando em uma diminuição da coleta de TDL devido ao edema do tecido conjuntivo e obstrução do ducto torácico. Costumávamos cannutar o tubo depois de criar uma pequena incisão no duto torácico usando uma tesoura com uma pequena borda de corte. No entanto, este procedimento interfere no local da canulação devido à drenagem de linfáticos. Portanto, agora não cortamos o duto torácico; em vez disso, nós esfaqueá-lo com uma borda afiada. Este método facilita a cannulação e aumenta as taxas de sucesso. Além disso, o local de incisão no ducto torácico é muito importante por causa da cavidade abdominal limitada. Se o local da incisão estiver muito próximo do diafragma, a parte curva do tubo de cannulação colidiria contra o diafragma. Se estiver muito longe do diafragma, também é difícil cannular o tubo profundamente o suficiente para garantir a fixação devido ao plexo linfático do ducto torácico caudal. Mesmo em casos de boa cannulação, o tubo de canulação pode ser facilmente ocluído pela formação de fibrina. Assim, recomendamos lavar periodicamente o tubo com heparina.
Os recentes avanços no CLSM permitiram observar a área focalizada de forma mais clara e precisamente em tempo real em comparação com um estudo anterior11. Agora usamos CLSM em nosso laboratório, mas podemos observar a microcirculação com mais clareza usando um microscópio multifotográfico. Embora o protocolo exija modificação em vários pontos, juntamente com o andamento técnico, permite a observação da área localizada do órgão de interesse12,13.
O mérito e a chave do método é que envolve separar linfócitos de animais receptores, incuba-los usando qualquer tipo de composto in vitro e observá-los após sua injeção em animais receptores. Isso possibilita elucidar apenas os efeitos dos linfócitos. Pelo contrário, se quisermos elucidar os efeitos de qualquer tipo de compostos em outras células além de linfócitos, como o endotélio vascular, podemos tratar animais receptores com qualquer tipo de compostos e observá-los após a injeção de linfócitos de controle. Para elucidar as mesmas coisas usando camundongos, devemos criar animais geneticamente manipulados condicionalmente um a um. Além disso, a triagem dos linfócitos isolados utilizando marcadores de superfície específicos permitiria estudar a dinâmica de tipos específicos de linfócitos.
Como mostrado no vídeo deste estudo, os linfócitos se movem indefinidamente e lateralmente através do endotélio vascular do corpo real, por isso é difícil avaliar os efeitos sobre seu comportamento utilizando observações in vivo apenas. Além disso, se o mecanismo de ação de uma droga administrada for examinado, ele é originalmente inadequado para examinar cada local de ação. O mérito deste estudo é que, separando linfócitos e incubando-os in vitro, os efeitos medicinais podem ser examinados separadamente nos lados vascular e linfócito. Menos variáveis são mais fáceis de analisar.

As manchas de Peyer (PPs) consistem em centenas de folículos linfoides na álmina propria do intestino delgado. Os PPs são divididos em folículos, região interfollicular e centros germinais localizados na parte inferior dos folículos, onde linfócitos são estimulados pela apresentação de antígeno. Não há vasos linfáticos diferentes, e os antígenos invadem a órmina propria do lúmen intestinal através da camada celular epitelial. A região epitelial que cobre folículos linfoides é chamada de epitélio associado ao folículo, dentro do qual células M intercaladas especializadas captam antígenos mucosais. As células M tomam antígenos do lado luminal e os antígenos são então capturados por células dendríticas e apresentados em direção a linfócitos ingênuos que fluem para PPs através do endotélio de venules endoteliais elevados (HEVs)1. Os PPs desempenham um papel importante na imunidade intestinal e estão relacionados com o estágio inicial da inflamação. Muitas interações moleculares envolvem a entrada de linfócitos a órgãos linfoides secundários (SLOs), incluindo moléculas de adesão, quimiocinas2,3e sphingosina-1-fosfato4; assim, há muitos alvos terapêuticos esperados. Portanto, observar a dinâmica do linfócito dentro dos PPs nos permite vislumbrar o estágio inicial da inflamação e examinar a utilidade de várias drogas promissoras.
O método aqui se concentra na migração de linfócitos em PPs, que inclui vários procedimentos (cannulação no ducto torácico5 e coleta de linfócitos e observação a longo prazo após a injeção em linfócitos coletados). Como esses procedimentos são complexos e foi difícil ver exatamente como cada procedimento foi realizado em relatórios anteriores, mencionamos aqui algumas dicas para conseguir uma observação bem sucedida. Por exemplo, a canulação dos tubos no ducto torácico foi muito difícil, e a taxa inicial de sucesso da canulação foi inferior a 50%. No entanto, melhoramos o método e alcançamos uma taxa de sucesso superior a 80%. Mencionamos algumas outras dicas neste manuscrito que são necessárias para a observação bem sucedida para permitir a avaliação quantitativa da migração transendotelial de linfócitos em várias condições.
Em relatórios anteriores, era difícil entender as mudanças tridimensionais ao longo do tempo, como a injeção intravenosa de tinta da Índia para manchar a estrutura vascular dos PPs6, ou o microscópio sendo monofocal7. Nos últimos anos, um método observacional utilizando alguns animais transgênicos de proteína fluorescência fotoconvertível, como camundongos Kaede, esclareceu movimentos celulares sistemáticos in vivo8. O outro estudo esclareceu o desligamento independente do CD69 da saída de linfócitos dos PPs9. Utilizamos microscopia de escaneamento a laser confocal (CLSM) devido à sua alta capacidade analítica. Agora podemos facilmente obter imagens de alta resolução e usá-las para analisar a dinâmica do linfócito.
Neste relatório, demonstramos uma série de métodos para avaliar a migração de linfócitos em PPs. Primeiro, mostramos métodos refinados de cannulação do ducto torácico para coletar linfócitos. Em segundo lugar, melhoramos os métodos observacionais de várias maneiras para manter órgãos objetivos sempre que possível sob observação microscópica, permitindo-nos obter imagens de alta qualidade por 3 horas. Em terceiro lugar, quantificamos os movimentos celulares da migração de linfócitos para avaliar os efeitos de alguns medicamentos. Esses protocolos modificados contribuirão para o desenvolvimento de avaliações de imunologia mucosa.

<table><tbody><tr><td>A1R+</td><td>Nikon</td><td></td><td>Comfocal Laser Scanning Microscopy</td></tr><tr><td>Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>099-06571</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>GIBCO</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red&amp;ndash;dextran</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1863</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopic observation of lymphocyte dynamics in rat peyer's patches

Linfócitos ingênuos recirculam do sangue para os tecidos linfoides sob condição fisiológica e é comumente reconhecido como um fenômeno importante na imunidade intestinal. O estroma de órgãos linfoides secundários, como as manchas de Peyer (PPs) ou linfonodos mesentéricos, são onde linfócitos ingênuos sentem antígenos. Linfócitos ingênuos circulam pela corrente sanguínea para alcançar venules endoteliais elevados, o portal de entrada em PPs. Estima-se que alguns imunomoduladores influenciem a migração de linfócitos, mas a avaliação precisa da dinâmica da microcirculação é muito difícil, e estabelecer um método para observar a migração de linfócitos in vivo pode contribuir para o esclarecimento dos mecanismos precisos. Refinamos o método de coleta de linfócitos do ducto linfático e observação da dinâmica detalhada dos linfócitos gut-trópicos em PPs de ratos. Escolhemos microscopia de varredura a laser confocal para observar PPs de ratos in vivo e gravamos usando fotografia de lapso de tempo. Agora podemos obter imagens claras que podem contribuir para a análise da dinâmica do linfócito.

Coleta de linfócitos de linfáticos Para preparar o rato para a canulação do ducto torácico, faça uma incisão no tenso ducto torácico como mostrado na Figura 1 e, em seguida, mantenha o rato na gaiola de um Bollman, como mostrado na Figura 2.
Quando os linfócitos são bem coletados, podemos obter cerca de 20 mL /6 h de fluido linfático contendo cerca de 107~108/mL linfócitos. Dos TDLs, 70% expressam CD4, entre os quais cerca de 90% das células expressam CD62L, o que significa a composição principal de TDLs (>60%) consiste em linfócitos ingenuos. Uma vez que os linfócitos coletados aqui são células que migram especificamente para o trato intestinal, são adequados para avaliar o estado de migração nas manchas de Peyer.
Observação microscópica Depois de injetar uma dose adequada de linfócitos fluorescentes, monte o intestino do rato receptor em uma lâmina de vidro, como mostrado na Figura 3. Uma imagem microscópica de PPs na condição fisiológica é mostrada na Figura 4.
Para a micro-observação, os ratos podem ser anestesiados sob laparotomia por cerca de 3 horas. Linfócitos aderem a HEVs, rolam e migram para o estroma circundante, e depois migram para capilares linfáticos. Quantificamos e avaliamos o percentual de linfócitos que migraram no estroma dentro do período de observação.
Após a injeção de uma dose adequada de linfócitos fluorescentes, linfócitos gut-trópicos começam a aderir aos HEVs e migrar através do endotélio para o estroma em cerca de 1 hora. A maioria se move dentro do estroma, enquanto outros migram para capilares linfáticos em cerca de 2-3 horas. A rotulagem de fluorescência bem desenvolvida neste estudo resultou em alta intensidade e nos permite observar a dinâmica do linfócito de área muito profunda. Além disso, usando um tipo diferente de rotulagem de fluorescência, podemos facilmente observar dinâmicas de diferentes tipos de linfócitos simultaneamente. Esta migração de linfócitos gut-tropic pode ser esclarecida visualmente para supressão por alguns imunomoduladores como o FTY720, como mostrado em nosso relatório anterior.
A observação do sistema microcirculatório em si é extremamente difícil, e é desejável estabelecer um método de avaliação fácil. Este estudo também possibilitou descobrir onde está o local de ação da droga nos patches do Peyer. Em particular, a administração ex vivo do FTY720 ao linfócito possibilitou limitar o local de ação apenas aos linfócitos, mas não ao endotélio. Combinados com a classificação de linfócitos específicos, resultados mais detalhados seriam obtidos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61568/61568fig1.jpg"> Figura 1: Procedimento para expor o ducto torácico e realizar a cannulação. Depois de cortar o peritônio longitudinalmente, o ducto torácico pode ser exposto movendo o estômago cranialmente e dissecando o tecido conjuntivo no lado direito dorsal da aorta abdominal. O tecido conjuntivo ao redor do diafragma deve ser cuidadosamente dissecado para evitar lesões. O ducto torácico deve ser exposto o mais largo cranialmente possível para criar espaço suficiente para a cannulação e, em seguida, ligado por uma sutura de seda 3-0 logo abaixo do diafragma para parar o fluxo de linfático e reter o fluido caudally. O fluido linfático leitoso é visível através do ducto linfático, onde o cateter pode ser inserido. O ducto torácico do rato deve ser ligeiramente tenso para garantir uma cannulação lisa. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61568/61568fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61568/61568fig2.jpg"> Figura 2: Imagem de todo o cenário para coleta de linfócitos torácicos (TDLs). Os ratos são mantidos nas gaiolas de Bollman e TDLs são coletados através do tubo de cannulação em cada frasco. Os frascos são colocados no gelo e substituídos a cada 12 horas para coletar fluido linfático fresco. A solução salina carregada de açúcar é administrada através de um tubo de silicone usando uma bomba de seringa a uma taxa de cerca de 3 mL/h para evitar a desidratação. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61568/61568fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61568/61568fig3.jpg"> Figura 3: O rato é colocado no estágio do microscópio conectado à máquina de anestesia, e uma substância fluorescente ou linfócitos fluorescentes são injetados do cateter venoso através da veia jugular interna(A). A área de observação do trato intestinal foi suavemente fixada entre duas bolas de algodão enroladas. O trato intestinal foi fixado longe do tronco para evitar vibração por movimentos respiratórios. Bolas de algodão laminadas foram encharcadas em soro fisiológico tamponado fosfato para evitar a secagem do intestino durante o período de observação(B). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61568/61568fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61568/61568fig4.jpg"> Figura 4: Imagem microscópica das manchas de Peyer na condição fisiológica (A). Os núcleos das células endoteliais vasculares são manchados de azul. O plasma de sangue é vermelho, e o fluxo sanguíneo é detectado pelo fluxo de células não manchadas. Linfócitos gut-trópicos (verde manchado) aderindo a venules endoteliais elevados(B). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61568/61568fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Aqui, descrevemos um método preciso para coletar linfócitos toráclicos e observar a migração de linfócitos gut-tropic nos patches de Rato Peyer por 3 horas usando fotografia de lapso de tempo. Esta técnica pode esclarecer como a dinâmica dos linfócitos são afetadas em condições inflamatórias.

Observação microscópica da Dinâmica do Linfócito em Patches de Rat Peyer

Na&#239;ve lymphocytes recirculate from the blood to the lymphoid tissues under physiological condition and it is commonly recognized as an important ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

3.9K visualizações.  National Defense Medical College. Aqui, descrevemos um método preciso para coletar linfócitos toráclicos e observar a migração de linfócitos gut-tropic nos patches de Rato Peyer por 3 horas usando fotografia de lapso de tempo. Esta técnica pode esclarecer como a dinâmica dos linfócitos são afetadas em condições inflamatórias.

Vídeo: Microscopic Observation of Lymphocyte Dynamics in Rat Peyer's Patches

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

Aplicação de um rato ligado patch Peyer Assay alça intestinal para avaliar absorção pelas células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Imunologia e Infecção

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense against pathogens. It is well established that Peyer&#39;s patches (PPs) have an essential role in the mucosal immune network by hosting several effector T and B cell subsets. A certain fraction of these effector cells, follicular T helper (TFH) and germinal center (GC) B cells are professionalized in the regulation of humoral immunity. Hence, the characterization of these cell subsets within PPs in terms of their differentiation program and functional properties can provide important information about mucosal immunity. To this end, an easily applicable, efficient and reproducible method of lymphocyte isolation from PPs would be valuable to researchers. In this study, we aimed to generate an effective method to isolate lymphocytes from mouse PPs with high cell yield. Our approach revealed that initial tissue processing such as the use of digestive reagents and tissue agitation, as well as cell staining conditions and selection of antibody panels, have great influence on the quality and identity of the isolated lymphocytes and on experimental outcomes.
Here, we describe a protocol enabling researchers to efficiently isolate lymphocyte populations from PPs allowing reproducible flow cytometry-based assessment of T and B cell subsets primarily focusing on&#160;TFH and GC B cell subsets.

In this study, we present a novel and effective protocol for the isolation of lymphocytes from Peyer&#39;s Patches (PPs), which can be subsequently used for in vivo and in vitro functional assays as well as flow cytometric studies of follicular T helper and germinal center B cells.

Unraveling jogadores-chave da imunidade Humoral: avançado e otimizado protocolo de isolamento de linfócitos de Murine do Peyer Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

Pesquisa do câncer

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign antigens from peripheral tissues to prime the adaptive immune response. Juxtaposed between innate and adaptive immune responses, the LN is an ideal site to study immune cell interactions1,2. Lymphocytes (T cells, B cells and NK cells), dendritic cells (DCs), and macrophages comprise the bulk of bone marrow-derived cellular elements of the LN. These cells are strategically positioned in the LN to allow efficient surveillance of self antigens and potential foreign antigens3-5. The process by which lymphocytes successfully encounter cognate antigens is a subject of intense investigation in recent years, and involves an integration of molecular contacts including antigen receptors, adhesion molecules, chemokines, and stromal structures such as the fibro-reticular network2,6-12. 
Prior to the development of high-resolution real-time fluorescent in vivo imaging, investigators relied on static imaging, which only offers answers regarding morphology, position, and architecture. While these questions are fundamental in our understanding of immune cell behavior, the limitations intrinsic with this technique does not permit analysis to decipher lymphocyte trafficking and environmental clues that affect dynamic cell behavior. Recently, the development of intravital two-photon laser scanning microscopy (2P-LSM) has allowed investigators to view the dynamic movements and interactions of individual cells within live LNs in situ12-16. In particular, we and others have applied this technique to image cellular behavior and interactions within the popliteal LN, where its compact, dense nature offers the advantage of multiplex data acquisition over a large tissue area with diverse tissue sub-structures11,17-18. It is important to note that this technique offers added benefits over explanted tissue imaging techniques, which require disruption of blood, lymph flow, and ultimately the cellular dynamics of the system. Additionally, explanted tissues have a very limited window of time in which the tissue remains viable for imaging after explant. With proper hydration and monitoring of the animal's environmental conditions, the imaging time can be significantly extended with this intravital technique. Here, we present a detailed method of preparing mouse popliteal LN for the purpose of performing intravital imaging.

Recent advances in 2-photon microscopy have enabled real-time in situ imaging of live tissues in animal models, thereby enhancing our ability to investigate cellular behavior in both physiologic and pathologic conditions. Here, we outline the preparations required to perform intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.

Imagem intravital do Linfonodo Popliteal Rato

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Peyer's patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and homeostasis. Particulate antigens and microbes in the intestinal lumen are continuously sampled by PP M cells in the follicle-associated epithelium (FAE) and transported to an underlying network of dendritic cells (DCs), macrophages, and lymphocytes. In this article, we describe protocols in which murine PPs are (i) dissociated into single cell suspensions and subjected to flow cytometry and (ii) prepared for cryosectioning and immunostaining. For flow cytometry, PPs are mechanically dissociated and then filtered through 70 &mu;m membranes to generate single cell suspensions free of epithelial cells and large debris. Starting with 20-25 PPs (from four mice), this quick and reproducible method yields a population of &gt;2.5 x 106 cells with &gt;90% cell viability. For cryosectioning, freshly isolated PPs are immersed in Optimal Cutting Temperature (OCT) medium, snap-frozen in liquid nitrogen, and then sectioned using a cryomicrotome. Tissue sections (5-12 &mu;m) are air-dried, fixed with acetone or methanol, and then subjected to immunolabeling.

There is an increasing interest in understanding the immunological functions of specific subpopulations of cells in Peyer's patches (PPs), the primary inductive sites of gut-associated lymphoid tissues. Here we outline parallel protocols for preparing PP single cell preparations for flow cytometric analysis and PP cryosections for immunostaining.

Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

Um modelo de celular endotelial Planar for Imaging imunológica Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Isolando os linfócitos de rato pequeno Intestinal sistema imunológico

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements from an experimentally observed displacement field produced by a cell pulling on an elastic substrate. Here, we adapted TFM to investigate the spatial and temporal structure of the force field exerted by B cells when activated by antigen engagement of the B cell receptor. Gel rigidity, bead density, and protein functionalization must be optimized for the study of relatively small cells (~ 6 &#181;m) that interact with, and respond specifically to ligands for cell surface receptors.

Here we present a protocol used to perform traction force microscopy experiments on B cells. We describe the preparation of soft polyacrylamide gels and their functionalization, as well as data acquisition at the microscope and a summary of data analysis.

Microscopia de Força de Tração para Estudar ativação de linfócitos B

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Bioengenharia

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the resolution of peripheral tissue responses. While a variety of methods are used to quantify leukocyte egress from non-lymphoid, peripheral tissues, the cellular and molecular mechanisms that govern context-dependent egress remain poorly understood. Here, we describe the use of in situ photoconversion for quantitative analysis of leukocyte egress from murine skin and tumors. Photoconversion allows for the direct labeling of leukocytes resident within cutaneous tissue. Though skin exposure to violet light induces local inflammatory responses characterized by leukocyte infiltrates and vascular leakiness, in a head-to-head comparison with transdermal application of fluorescent tracers, photoconversion specifically labeled migratory dendritic cell populations and simultaneously enabled the quantification of myeloid and lymphoid egress from cutaneous microenvironments and tumors. The mechanisms of leukocyte egress remain a missing component in our understanding of intratumoral leukocyte complexity, and thus the application of the tools described herein will provide unique insight into the dynamics of tumor immune microenvironments both at steady state and in response to therapy.

Here, we demonstrate the methods for in vivo quantification of leukocyte egress from na&#239;ve, inflamed, and malignant murine skin. We perform a head-to-head comparison of two models: transdermal FITC application and in situ photoconversion. Furthermore, we demonstrate the utility of photoconversion for tracking leukocyte egress from cutaneous tumors.

Quantificar a saída de leucócitos através de vasos linfáticos da pele murino e tumores

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

Biologia

Isolation of Lymphocytes from a Mouse Peyer&#39;s Patch

Source: Yazicioglu, Y. F., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58490">Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer&#39;s Patches.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we demonstrate the isolation of lymphocytes from a harvested mouse Peyer&#39;s patch. The isolated lymphocytes can be used for further analysis.

Isolamento de linfócitos de um adesivo de Peyer de camundongo

Source: Yazicioglu, Y. F., et al. Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer&#39;s ...