A detecção de fitopatógeno é um passo crucial no gerenciamento de doenças vegetais. Este protocolo fornece um método de detecção rápida para contaminação da água de irrigação devido a um patógeno comum de caça transmitido pela água. Usando esta técnica, patógenos específicos, como Phytophthora capcici, podem ser processados e rapidamente detectados a partir do nosso grande volume de água de irrigação enquanto permanece no local.
Demonstrando o procedimento estarão Owen Hudson, um estudante de mestrado do meu laboratório, e Sumyya Waliullah, pesquisadora de pós-doutorado do laboratório do Dr.Pingxi G para configurar uma bomba e filtro para detecção de Phytophthora capcici no local na água de irrigação. Conecte um frasco de filtragem a um tubo conectado a uma bomba de mão e coloque o funil buchner na rolha de borracha na boca do frasco filtrante. Em seguida, encaixe um pedaço de papel filtro de tamanho apropriado com um tamanho de retenção de 15 mícrons no funil.
Para obter amostras de água, coletar água de irrigação da fonte alvo. A água pode ter pequenas quantidades de detritos, mas não sedimentos ou solo significativos. Despeje lentamente entre 50 a 1000 mililitros de água de teste sobre o papel filtro dentro do funil enquanto usa a bomba de mão para criar uma sucção para puxar a água através do funil.
Quando toda a água tiver sido filtrada, use fórceps para remover o papel filtro do funil. E use uma tesoura estéril para cortar o papel em pequenos pedaços. Submerse de oito a 12 pedaços de papel em 400 microliters de tampão de extração em um tubo de 1,5 mililitro para uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente.
Vórtice ou agitar o papel por 10 segundos uma vez a cada minuto. No final da incubação, use fórceps para remover o papel com o mínimo de tampão possível. E repita a licença com o próximo conjunto de peças de papel filtro.
Para extração de DNA das amostras de papel filtro adicionou 20 microliters de proteinase K e 10 microliters de 10 nanogramas por RNAs microliter à amostra também e incubar a solução à temperatura ambiente por 15 minutos com vórtice ou tremendo a cada três minutos. No final da incubação, adicione 500 microliters de contas magnéticas em tampão de ligação à amostra e misture bem tremendo. Após cinco minutos em temperatura ambiente, coloque o tubo e o rack separador magnético por dois minutos antes de remover e descartar o supernatante.
Remova o tubo do separador magnético e suspenda vigorosamente as contas em 500 microliters de tampão de lavagem. Após 30 segundos, devolva o tubo ao ímã e espere dois minutos antes de descartar o supernatante. Repita a lavagem com 500 microliters de tampão de lavagem também e 500 microliters de 80% de etanol como acabou de demonstrar.
E o ar conduz a pelota magnética por 15 minutos em temperatura ambiente. No final da incubação suspenda as contas em 50 microliters de tampão de elução com pipetação por um minuto antes de colocar o tubo de volta no ímã por dois minutos para permitir a coleta do supernatante. Após a preparação da mistura de primer LAMP como indicado na tabela, adicione 2,5 microliters de primer mix 12,5 microliters de uma lâmpada de lava mastermix um microliter de DNA extraído e nove microliters de água dupla destilada a um tubo PCR e configurar um controle positivo e um negativo.
incubar todas as amostras em um blog de calor de 64 graus Celsius por 45 minutos ou o gênio três instrumentos de amplificação no final da incubação, uma carga de cinco microliters de cada amostra amplificada em um gel de 1%agarose e imagem das bandas resultantes em uma máquina de imagem ultravioleta. Se for utilizado um corante calorimétrico, veja a mudança de cor para determinar os resultados como positivos ou negativos. Se um instrumento de amplificação portátil foi usado, visualize o gráfico de amplificação na tela para determinar os resultados.
O tempo óptico para executar o ensaio LAMP a 64 graus é de 45 minutos, já que as concentrações mais baixas que foram positivas para detecção não são amplificadas até 40 minutos, enquanto concentrações mais altas são amplificadas em 20 minutos. A amplificação pode ser confirmada em um gel de 1%agarose rotulado com uma mancha de ácido nucleico. Como ilustrado o PCR convencional é 40 vezes menos sensível que o LAMP.
Detectando 4,8 vezes 10 para o terceiro zoospores por mililitro concentrações no menor. Nesta análise, foram coletadas amostras de água de sete lagoas utilizadas para produção comercial de vegetais no Condado de Tift, Geórgia. Três dos quais demonstraram resultados positivos da LAMP.
Quando as amostras foram testadas por PCR convencional, no entanto, os zoospores foram detectados em apenas uma das três amostras positivas. Nesta tabela, são resumidas as diferenças entre os métodos de detecção utilizando variáveis como sensibilidade, tempo, preparação necessária, materiais e custo. LAMP é o método mais barato entre os métodos testados, e também é o mais rápido, exigindo apenas 30 a 60 minutos para amplificação em comparação com a amplificação convencional do PCR.
O uso deste DNA de protocolo extraído de patógenos de sementes umi intimamente relacionados resulta em nenhuma detecção para nenhuma das amostras, confirmando a especificidade dos primers. Certifique-se de não derramar a água da amostra muito rápido e tenha cuidado ao adicionar DNA extraído aos tubos da LÂMPADA para limitar a contaminação. Uma vez que outros patógenos transmitidos pela água tenham seus conjuntos específicos de primer desenvolvidos, os métodos de filtração e ácido de lâmpada podem ser adaptados para outros patógenos.
