Este trabalho foi apoiado em parte por fundos de startup da UCSD direcionados à O.S.A.

1. Criação da colônia quinquefasciatus
<ol><li>Montou várias colônias de adultos C. quinquefasciatus em gaiolas de dormitórios de insetos. NOTA: As colônias foram fornecidas pela Dra. Protocolos detalhados para a criação de mosquitos Culex podem ser encontrados em outrasliteraturas 21.<ol>
<li>Mantenha os mosquitos a 25 ± 1 °C a 30% de umidade com um ciclo de 12:12 h durante o dia:noturno.</li>
		<li>Forneça 20% de açúcar solução ad libitum introduzindo um recipiente de solução de açúcar com um pavio na gaiola ou saturando bolas de algodão com a solução de açúcar e colocando-o dentro da gaiola.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permitir que os mosquitos acasalem por pelo menos 3 dias antes da alimentação sanguínea(Figura 2A).</li>
</ol>2. Coleção de embriões estágio pré-blastoderm de C. quinquefasciatus
<ol><li>Após 3-6 dias após a eclosão, forneça às fêmeas 1-2 mL de uma farinha de sangue bovina citrated através de uma membrana sintética e aquecida a aproximadamente 40 °C em um sistema de alimentação sanguínea(Figura 2B). Existem também protocolos alternativos de alimentação sanguínea que podem ser usados para mosquitos Culex (por exemplo, ver ref21). NOTA: C. quinquefasciatus é conhecido por uma preferência por sangue aviário. Alguns laboratórios usam aves vivas anestesiadas ou sangue aviário para sua fonte de farinha de sangue21,22,23. No entanto, as colônias podem ser treinadas/selecionadas para se alimentar em sangue bovino ou pequenos roedores se esse recurso for selecionado por várias gerações.<ol>
<li>Permitir que as fêmeas descansem por um mínimo de 3 dias após a alimentação sanguínea para se submeterem à oogênese e à maturação dos óvulos antes de induzir a oviposição para experimentos de microinjeção.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No dia das microinjeções embrionárias, crie um copo de oviposição com água de oviposição infundida organicamente. A água de oviposição deve ser feita fermentando fezes de coelho (50 g/L), grama em decomposição (4,5 g/L) ou alimentos para peixes (25 g/L) em água ao longo de 5 ou mais dias24,25.</li>
	<li>Coloque o copo de oviposição na gaiola e coloque toda a gaiola em um local escuro(Figura 2C).</li>
	<li>Depois de cada 30 minutos, verifique se há jangadas de ovos.<ol>
<li>Se as jangadas de ovos estiverem presentes, colete as jangadas recolhendo-as com um pincel e coloque-as em um papel filtro molhado(Figura 2D,E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Alinhamento dos embriões do estágio pré-blastoderm de C. quinquefasciatus
<ol><li>Separe os ovos das jangadas pressionando a jangada e provocando os ovos individualmente usando um pincel de ponta fina e fórceps(Figura 2E).</li>
	<li>Alinhe os ovos individuais em uma fina tira de fita adesiva de dois lados colocada na parte superior de uma lâmina de vidro(Figura 2F).</li>
	<li>Ao alinhar, tente apontar o lado anterior de cada ovo na mesma direção para facilitar a acessibilidade. NOTA: Um método alternativo de alinhamento de ovos sem fita adesiva dupla face pode ser encontrado em um protocolo de microinjeção de embrião nasonia vitripennis publicado anteriormente26.</li>
	<li>Cubra os ovos com a mistura de óleo de halocarboneto. NOTA: A mistura de halocarboneto pode ser preparada com antecedência misturando suavemente dois reagentes de halocarbono e água (9:1:20, halocarbon 700 : halocarbon 27 : Água ultrapura) e, em seguida, incubando a mistura durante a noite a 25οC para facilitar a saturação da água do óleo halocarboneto.</li>
</ol>4. Preparação da agulha para microinjeções
<ol><li>Gere as agulhas de vidro capilar aluminossilicato usando um puxador de micropipette de vidro.<ol>
<li>Coloque um vidro capilar aluminossilicato em um puxador de agulha, de acordo com as instruções do manual do usuário do puxador de agulhas. NOTA: Agulhas capilares de quartzo e borossilicato também podem ser usadas, mas para este experimento, aluminossilicato é preferido devido à sua relativa acessibilidade e durabilidade.</li>
		<li>Defina o calor para 516, Velocidade para 100, Atraso para 70, Puxe para 97 e Pressão para 500 no puxador de agulha.</li>
		<li>Ative o puxador de agulha, de acordo com as instruções do puxador e repita conforme necessário para agulhas adicionais. NOTA: Durante o processo de injeção, as agulhas muitas vezes ficam entupidas ou acidentalmente quebradas, portanto, puxar agulhas adicionais para um único experimento é altamente recomendado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque a ponta da agulha tocando suavemente a ponta da agulha puxada na placa abrasiva de diamante rotativo por cerca de 10 s em um ângulo de 50°. NOTA: Chanfrar a agulha abre-a para permitir que o fluido flua ao mesmo tempo criando uma ponta mais nítida para facilitar a penetração no embrião. Um exemplo de agulha adequada pode ser visto em um artigo anterior26.</li>
	<li>Armazene agulhas puxadas e chanfradas incorporando-as em linhas de argila do modelador em uma placa de Petri. NOTA: Para garantir a melhor qualidade para pontas de agulha, as agulhas devem ser recém-puxadas e chanfradas o mais perto possível do tempo de injeção.</li>
</ol>5. Carregando a mistura de injeção
<ol><li>Prepare a mistura de injeção composta por reagentes de modificação de genoma (por exemplo, 200 ng/μL sgRNA e 200 ng/μL Cas9), ou soluções de injeção preferidas e mantê-lo no gelo. NOTA: Esta mistura pode ser preparada enquanto espera que os ovos sejam colocados. Mais detalhes sobre a produção e preparação do SGRNA para microinjeção podem ser encontrados em publicações anteriores27,28,29,30.</li>
	<li>Carregue 2 μL de mistura de injeção na agulha de injeção usando uma ponta de microcarregador.</li>
</ol>6. Microinjeção configurada
<ol><li>Coloque a agulha de injeção preenchida em um micromanipulador configurado ligado a um microinjetor eletrônico.</li>
	<li>Coloque o slide de vidro contendo os ovos alinhados no estágio de um microscópio composto.</li>
	<li>Usando o microscópio micromanipulador e composto, alinhe a agulha para apontar para a extremidade posterior do embrião em um ângulo de 25-35°.</li>
</ol>7. Microinjeção de embriões(Figura 2G)
<ol><li>Insira cuidadosamente a agulha no embrião e injete a mistura em uma quantidade de cerca de 10% do volume do embrião (700-800 pL, dependendo do tamanho dos ovos). NOTA: Ao injetar, o ovo deve inchar ligeiramente, no entanto, se muito fluido for injetado, os ovos podem estourar ou o fluido citoplasmado pode vazar.</li>
	<li>Injete cerca de 20 ovos por vez e pare e realize procedimentos de recuperação de embriões. NOTA: Durante a injeção, há uma grande chance de agulhas para entupir ou quebrar. Se ocorrer um entupimento, que pode ser determinado pela falta de fluido de injeção que flui através da agulha, tente limpar a agulha com a função limpa no microinjetor eletrônico ou tente reencorar a agulha. Se nenhum dos passos funcionar, mude rapidamente para uma nova agulha, garantindo que os ovos preparados permaneçam umedecidos.</li>
</ol>8. Recuperação e eclosão de embriões
<ol><li>Deixe os ovos imperturbáveis por pelo menos 5 minutos. Dentro de 20 minutos pós-injeção, remova cuidadosamente o óleo de halocarboneto escovando levemente com um pincel limpo(Figura 2H).</li>
	<li>Levante os ovos suavemente usando um pincel e coloque-os em uma xícara de água duplamente destilada(Figura 2I). Tome cuidado para manter os ovos na superfície da água.</li>
	<li>Verifique os ovos diariamente por 7 dias para eclosão(Figura 2J).</li>
	<li>Siga os procedimentos normais de criação de larvas21.</li>
</ol>9. Triagem para modificação do genoma
<ol><li>Triar os mosquitos injetados para os fenótipos mutantes usando um estereoscópio(Figura 2K).<ol>
<li>Verifique mutações que não tenham um fenótipo facilmente reconhecível, por amplificação pcr, ensaio T7 Endonuclease I e sequenciamento por subcloamento da regiãoalvo 31.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configure cruzamentos adicionais entre indivíduos injetados para detectar mutações hereiáveis dentro da linha germinal.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight">https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight</a> (2019)</li><li>APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: <a target="_blank" href="https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv">https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv</a> (2020)</li><li>Luke George, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+impacts+of+West+Nile+virus+on+North+American+bird+populations.">Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).</li><li>van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Epizootiology+and+Ecological+Significance+of+Malaria+in+Hawaiian+Land+Birds.">The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds.</a> Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).</li><li>Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitigating+Future+Avian+Malaria+Threats+to+Hawaiian+Forest+Birds+from+Climate+Change.">Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change.</a> PloS One. 12 (1), 0168880 (2017).</li><li>Martins, W. F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+insecticide+resistance+in+the+lymphatic+filariasis+vector+Culex+quinquefasciatus.">Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).</li><li>Norris, L. C., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+after+the+introduction+of+insecticide-treated+bed+nets+in+Macha,+Zambia.">Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia.</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).</li><li>Corbel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+insecticide+resistance+mechanisms+in+Anopheles+gambiae+and+Culex+quinquefasciatus+from+Benin,+West+Africa.">Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa.</a> Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).</li><li>Yadoul&#233;ton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+status+in+Culex+quinquefasciatus+in+Benin.">Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin.</a> Parasites &amp; Vectors. 8, 17 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia-based+population+control+strategy+targeting+Culex+quinquefasciatus+mosquitoes+proves+efficient+under+semi-field+conditions.">Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions.</a> PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).</li><li>Atyame, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+incompatibility+as+a+means+of+controlling+Culex+pipiens+quinquefasciatus+mosquito+in+the+islands+of+the+south-western+Indian+Ocean.">Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).</li><li>Almeida, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Wolbachia+on+fitness+of+Culex+quinquefasciatus+(Diptera;+Culicidae).">Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae).</a> Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+confinable+gene+drive+system+in+the+human+disease+vector+Aedes+aegypti.">Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti.</a> eLife. 9, 51701 (2020).</li><li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control.">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biology. 5, 11 (2007).</li><li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes.">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li><li>Gantz, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Cas9-mediated+gene+drive+for+population+modification+of+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi.">Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Zika+virus+in+transgenic+expressing+a+polycistronic+cluster+of+synthetic+small+RNAs.">Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).</li><li>Buchman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+dengue+neutralization+in+mosquitoes+expressing+an+engineered+antibody.">Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody.</a> PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).</li><li>Isaacs, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+resistance+to+Plasmodium+falciparum+development+in+transgenic+Anopheles+stephensi.">Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi.</a> PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).</li><li>Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Cytochrome+P450+genes:+their+constitutive+overexpression+and+permethrin+induction+in+insecticide+resistant+mosquitoes,+Culex+quinquefasciatus.">Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus.</a> PloS One. 6 (8), 23403 (2011).</li><li>Kauffman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearing+of+Culex+spp.+and+Aedes+spp.+Mosquitoes.">Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes.</a> Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).</li><li>Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+blood+meal+source+on+the+reproduction+of+Culex+pipiens+quinquefasciatus+(Diptera:+Culicidae).">Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).</li><li>Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Rearing+Culex+Mosquitoes.">Techniques for Rearing Culex Mosquitoes.</a> American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).</li><li>Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+and+electrophysiological+evaluation+of+oviposition+attractants+for+Culex+quinquefasciatus+say+(Diptera:+Culicidae).">Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae).</a> Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).</li><li>Allgood, D. W., Yee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oviposition+preference+and+offspring+performance+in+container+breeding+mosquitoes:+evaluating+the+effects+of+organic+compounds+and+laboratory+colonisation.">Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation.</a> Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).</li><li>Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+Microinjection+and+Transplantation+Technique+for+Nasonia+vitripennis+Genome+Manipulation.">Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56990 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+jewel+wasp+Nasonia+vitripennis+using+CRISPR/Cas9.">Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).</li><li>Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Efficient+Site-Specific+Mutagenesis+in+Malaria+Mosquitoes+Using+CRISPR.">Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR.</a> Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).</li><li>Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+Cas9+Expression+Yields+Highly+Efficient+Genome+Engineering+in+a+Major+Worldwide+Disease+Vector,+Aedes+aegypti.">Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+disease+vector+Culex+quinquefasciatus+using+clustered+regularly+interspaced+short+palindrome+repeats-associated+protein+9.">Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9.</a> Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).</li><li>New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i">https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i</a> (2020)</li></ol>

Com os recentes esforços para gerar ferramentas geneticamente modificadas para o controle de vetores de mosquitos, há a necessidade de desenvolver e otimizar protocolos de microinjeção de embriões para vetores comuns de doenças de mosquitos. Embora métodos tenham sido desenvolvidos para mosquitos Aedes e Anopheles, um protocolo projetado especificamente para Culex foi minimamente explorado. Em geral, os protocolos gerais de injeção de embriões de mosquitos podem ser divididos em 3 etapas gerais: 1) coleta e preparação de embriões, 2) injeção de embriões e 3) recuperação pós-injeção. Para gerar mutantes com sucesso, todas as três etapas devem ser otimizadas para as espécies-alvo. Este protocolo modificado para microinjeção de embriões é específico para a engenharia de genomas bem sucedidas de mosquitos Culex.
Maximizar a coleta de embriões é um gargalo comum nos protocolos de microinjeção de embriões. Para aumentar o número de ovos coletados em um curto período de tempo, os mosquitos foram restringidos de um substrato de oviposição por 2-3 dias após a refeição sanguínea. É importante notar que C. quinquefasciatus tendem a preferir fontes de sangue aviária em oposição a fontes de mamíferos ou membranas que se alimentam com sangue de mamíferos. No entanto, muitos pesquisadores têm dificuldade em adquirir uma fonte confiável de aviários vivos ou sangue aviário para alimentação sanguínea, de modo que os estoques de laboratório podem ser adaptados para se alimentar de fontes de sangue mais acessíveis. Também é crucial usar água rica em nutrientes para o substrato de oviposição, pois fornece pistas de oviposition para C. quinquefasciatus e a maioria dos outros vetores Culex. Existem muitos métodos para gerar água rica em nutrientes, que podem precisar ser otimizados entre laboratórios para garantir que um número adequado de ovos esteja disponível para microinjeção. Por exemplo, enquanto este método foi o mais bem sucedido com fezes de coelho fermentadas em água desionizada por 5 ou mais dias, outros pesquisadores têm mais sucesso com a grama ou alimentos de peixe como fonte de nutrientes e alguns até mesmo com água destilada21.
Uma vez que os mosquitos Culex colocam grupos de ovos em jangadas, coletar ovos é bastante simples. Os ovos podem simplesmente ser coletados recolhendo toda a jangada com um pincel. A separação do ovo é mais complicada, mas essencial para a injeção bem sucedida. Os ovos podem ser cuidadosamente separados da jangada aplicando uma pressão suave para baixo entre os ovos com pincel ou fórceps. Com alguma prática, vários usuários foram capazes de separar ovos únicos de jangadas de ovos. Após a separação de cada ovo, os ovos são alinhados na mesma orientação em fita adesiva de dois lados, que estabiliza os ovos durante a microinjeção. Os ovos são injetados na extremidade posterior afilada e a adição de óleo de halocarboneto mantém os ovos úmidos durante a manipulação.
Para limitar os danos embriões durante a microinjeção, as agulhas de injeção precisam ser de força adequada e chanfradas em um ângulo apropriado. Agulhas de aluminossilicato chanfradas por 10 segundos em um ângulo de 50° tiveram os melhores resultados, mas agulhas de borossilicato e quartzo também podem funcionar, mesmo que possam ser menos duráveis e mais caras. Além disso, o chanfrado adequado da agulha facilita o melhor fluxo das misturas Cas9 e sgRNA e cria um ponto mais acentuado para uma penetração mais fácil no embrião. Em muitos casos, o chanfrado também é uma maneira eficiente de corrigir rapidamente agulhas entupidas em vez de gastar o tempo e o esforço para substituir agulhas entupidas.
Após a injeção, os ovos devem permanecer imperturbáveis por pelo menos 5 minutos, com o óleo de halocarboneto sendo removido imediatamente depois, escovando-o suavemente com um pincel limpo. Após a remoção do óleo de halocarboneto, os ovos injetados podem ser colocados na água para eclodir, o que normalmente ocorre dentro de 3 dias após a injeção. Com a prática e o número suficiente de ovos, este protocolo pode alcançar mutações somáticas e germinas consistentes em C. quinquefasciatus e é versátil o suficiente para que ele seja facilmente adaptável a outros mosquitos Culex.

C. quinquefasciatus, comumente conhecido como mosquito da casa do sul, é um vetor competente de numerosos patógenos, incluindo o vírus do Nilo Ocidental (WNV), encefalite japonesa, encefalite de Saint Louis e encefalite equina oriental. Em particular, desde que foi detectada pela primeira vez em Nova York, em 1999, a WNV tornou-se uma importante doença transmitida por vetores em todo o continente dos Estados Unidos (EUA) com mais de 50.000 casos humanos relatados resultando em cerca de 2.300 mortes entre 1999 e 20181, bem como mais de 4.500 casos de equinos relatados entre 2008-2019. Além disso, pelo menos 23 espécies de aves encontradas na América do Norte foram impactadas por infecções por WNV com pelo menos 12 espécies classificadas como irrecuperáveis como resultado do WNV3. O impacto da WNV nas populações humanas, equinas e aviárias deve-se ao comportamento alimentar oportunista de seus vetores. Normalmente, os pássaros são os principais hospedeiros da WNV, e humanos e cavalos são hospedeiros incidentais ou sem saída. Alguns patógenos vetorcidos por C. quinquefasciatus só infectam aves como o parasita da malária aviária, o plasmodium relictum. No Havaí, C. quinquefasciatus é um dos principais vetores da malária aviária e causou a extinção de muitas espécies de aves nativas4,5.
Para controlar as doenças transmitidas por C. quinquefasciatus,pesquisadores e órgãos de controle de vetores têm usado ferramentas de controle populacional de mosquitos comumente estabelecidas, como a aplicação de inseticidas6,no entanto, esses métodos são caros, não específicos para espécies, e têm eficácia limitada, pois a resistência aos inseticidas é alta em muitas populações de C. quinquefasciatus 6,7,8,9. Outras técnicas de controle, como estratégias de controle populacional baseadas em Wolbachiaforam desenvolvidas nos últimos anos10,11, mas os custos de aptidão associados à infecção por Wolbachia limitam a viabilidade dessa abordagem para este vetor12. Existem também métodos de controle de base genética que foram desenvolvidos em outras espécies de mosquitos, como Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 e Anopheles stephensi16, incluindo o desenvolvimento de mosquitos resistentes ao patógeno17,18,19, que também poderiam ser desenvolvidos para C. quinquefasciatus se as ferramentas de engenharia do genoma necessários forem desenvolvido para esta espécie. No entanto, a biologia C. quinquefasciatus difere muito de outros vetores de mosquitos Aedes e Anopheles, o que dificultou o desenvolvimento de tecnologias genéticas semelhantes neste vetor. Com o advento das tecnologias de engenharia de genoma baseadas em CRISPR, a engenharia precisa do genoma tornou-se cada vez mais trivial, acessível e adaptável e, consequentemente, levou ao desenvolvimento de novas ferramentas genéticas em uma ampla variedade de espécies.
Para gerar mutações com tecnologias baseadas em CRISPR, uma mistura de proteína Cas9 e guia sintético RNA (sgRNA), complementar ao loci desejado, é microinjetada em embriões estágio pré-blastoderm. Uma vez que as fêmeas C. quinquefasciatus depositam seus ovos em grupos ligados a uma estrutura flutuante de jangada (Figura 1), em oposição à oviposição de ovos individuais, um traço dos mosquitos Aedes e Anopheles, as microinjeções de embriões são cada vez mais complicadas nesta espécie. As larvas culex também emergem do lado anterior de cada ovo, que está em contato com a superfície da água(Figura 1),por isso a orientação de ovos pós manipulação é importante nesta espécie. Aqui descrevemos um protocolo detalhado projetado para a microinjeção da proteína Cas9 e sgRNA em embriões C. quinquefasciatus. Este protocolo foi projetado para acomodar características exclusivas da biologia culex, a fim de melhorar as taxas de sobrevivência de embriões e mutação do genoma através de certas etapas que são fundamentais para a coleta oportuna de ovos e sobrevivência de ovos.

<table><tbody><tr><td>9 oz clear plastic pet cup</td><td>Karat</td><td>C-KC9</td><td>Insect Rearing and Egg Collection</td></tr><tr><td>Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter)</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate</td></tr><tr><td>Blood</td><td>Colorado Serum Company</td><td>31025</td><td>The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection.</td></tr><tr><td>Bugdorm</td><td>Bugdorm</td><td>4F2222</td><td>Insect Rearing Cage</td></tr><tr><td>Cas9 Protein with NLS</td><td>PNABio</td><td>CP01</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Compound Microscope</td><td>Olympus BX41</td><td></td><td>Microinjection, for embryo injection</td></tr><tr><td>Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes)</td><td>Sutter Instruments</td><td>104E</td><td>Microinjection, to be used with beveler</td></tr><tr><td>DNase/RNase-Free distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Double-sided Tape</td><td>Scotch</td><td>B084NVQGXD</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Femtojet 4x or 4i programmable microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Femtotips Microloader tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>E5242956003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>Microinjection, embryo collection</td></tr><tr><td>Fine-tip paintbrush</td><td>ZEM</td><td>2595</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Halocarbon oil 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Hemotek</td><td>Hemotek</td><td>PS5</td><td>Line Maintenance</td></tr><tr><td>Microelectrode Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV10</td><td>Microinjection, needle beveling</td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000 or P-2000</td><td>Microinjection, needle pulling</td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr><tr><td>Non-Drying Modeling Clay</td><td>Jovi</td><td>B0025Z71IM</td><td>Microinjection, needle storage</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td>Microinjection, for embryo alignment</td></tr><tr><td>Sugar</td><td>Domino</td><td></td><td>20% sugar solution for adult sugar source.</td></tr><tr><td>T7 Endonuclease I</td><td>NEB</td><td>M0302</td><td>Preparation of microinjection materials</td></tr><tr><td>TOPO TA Cloning Kit</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>K451020</td><td>Preparation of microinjection materials</td></tr><tr><td>Ultra-fine tip forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-121</td><td>Microinjection, embryo alignment</td></tr></tbody></table>

embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus é um vetor de uma variedade diversificada de doenças transmitidas por vetores, como malária aviária, vírus do Nilo Ocidental (WNV), encefalite japonesa, encefalite equina oriental, filariase linfática e encefalite de Saint Louis. Notavelmente, a malária aviária tem desempenhado um papel importante na extinção de numerosas espécies de aves insulares endêmicas, enquanto a WNV tornou-se uma importante doença transmitida por vetores nos Estados Unidos. Para obter mais informações sobre a biologia C. quinquefasciatus e expandir sua caixa de ferramentas de controle genético, precisamos desenvolver métodos mais eficientes e acessíveis para a engenharia de genomas nesta espécie. No entanto, alguns traços biológicos exclusivos dos mosquitos Culex, particularmente suas jangadas de ovos, têm dificultado a realização de procedimentos de microinjeção necessários para a engenharia do genoma. Para enfrentar esses desafios, desenvolvemos um protocolo otimizado de microinjeção de embriões que se concentra em mitigar os obstáculos técnicos associados às características únicas dos mosquitos Culex. Esses procedimentos demonstram métodos otimizados para coleta de ovos, separação de jangadas de ovos e outros procedimentos de manuseio essenciais para a microinjeção bem sucedida em C. quinquefasciatus. Quando associados à tecnologia de edição de genomas CRISPR/Cas9, esses procedimentos permitem alcançar mutações germinas específicas, eficientes e hereditárias, que são necessárias para realizar engenharia avançada do genoma e desenvolver tecnologias de controle genético neste importante, mas atualmente subestudado, vetor da doença.

Em experimentos publicados anteriormente, este método foi utilizado para gerar mutações somáticas e germinas de um gene crítico para o desenvolvimento da pigmentação do olho escuro, branco (CPIJ005542)30 (Tabela 1). As mutações somáticas geradas pelo CRISPR/Cas9 foram pontuadas pela triagem para perda de pigmentação nos olhos do estágio pupal de indivíduos injetados (G0). Mutações somáticas estavam geralmente presentes como fenótipos de mosaico onde algumas, mas nem todas as células têm o fenótipo mutante. Por exemplo, mutações somáticas do gene branco resultaram em uma mistura de ommatidia com fenótipos que carecem de pigmentação e aqueles com fenótipo pigmentadoselvagem 30. Quando houve uma mutação germinal do gene branco, no entanto, a próxima geração (G1) herdou o fenótipo de olhos brancos completos. As taxas de mutação germinal foram determinadas por meio de indivíduos do mosaico G0 e pontuação para descendentes de olhos completamente brancos (G1). Esses experimentos resultaram em uma taxa de sobrevivência de 64% a 82% em embriões, bem como uma taxa de mutagênese somática de 37% a 57% e uma taxa de mutagênese germinada de >61%(Tabela 1). Ao multiplexar sgRNAs para atingir múltiplos loci no mesmo gene, as taxas de mutagênese somática e germinal aumentaram para cima para até 86%(Tabela 1). Além disso, por muitas gerações, estoques homozigos viáveis dos mutantes brancos foram mantidos com sucesso no laboratório.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig01.jpg"> Figura 1: Jangada de ovos C. quinquefasciatus e morfologia de ovo único. Dorsal (A), lateral (B), e ventral (C) vistas de jangadas de ovos C quinquefasciatus. C. as fêmeas quinquefasciatus colocam seus ovos com o lado anterior mais bulboso tocando a superfície da água enquanto o posterior mais apontado para longe da superfície da água(D). A- anterior; P-posterior <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61375/61375fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2.jpg"> Figura 2: Linha do tempo para criar mutantes C. quinquefasciatus por microinjeção. Linha do tempo de preparação da colônia C. quinquefasciatus e coleta de embriões para microinjeção(A-D). Os ovos coletados são então separados(E)alinhados na mesma orientação e cobertos com óleo de halocarbono(F). Os ovos são então injetados(G) e permitidos descansar por um mínimo de 5 minutos antes de remover o óleo de halocarboneto(H). Os ovos são então transferidos para uma fonte de água limpa(I) para eclosão(J) e rastreados para fenótipos mutantes(K). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61375/61375fig2v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Sobrevivência</td>
			<td colspan="3">Mosaico somático (G0)</td>
			<td>Mutagênese germinal (G1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>sgRNA</td>
			<td>#injected</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Total (%)</td>
			<td>♂</td>
			<td>♀</td>
			<td>Total (%)</td>
			<td>G1 mutantes (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1</td>
			<td>50</td>
			<td>15</td>
			<td>20</td>
			<td>35(70)</td>
			<td>7(47)</td>
			<td>13(65)</td>
			<td>20(57)</td>
			<td>128(69)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>9</td>
			<td>32</td>
			<td>41(82)</td>
			<td>3(33)</td>
			<td>12(38)</td>
			<td>15(37)</td>
			<td>51(61)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>15</td>
			<td>32(64)</td>
			<td>7(41)</td>
			<td>8(53)</td>
			<td>15(47)</td>
			<td>157(72)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2</td>
			<td>50</td>
			<td>7</td>
			<td>16</td>
			<td>23(46)</td>
			<td>5(71)</td>
			<td>12(75)</td>
			<td>17(74)</td>
			<td>123(79)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>13</td>
			<td>9</td>
			<td>22(44)</td>
			<td>10(77)</td>
			<td>6(67)</td>
			<td>16(73)</td>
			<td>72(81)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>17</td>
			<td>10</td>
			<td>27(54)</td>
			<td>13(76)</td>
			<td>8(80)</td>
			<td>21(78)</td>
			<td>101(85)</td>
		</tr>
<tr>
<td>wsgRNA-1/wsgRNA-2/wsgRNA-3</td>
			<td>50</td>
			<td>11</td>
			<td>10</td>
			<td>21(42)</td>
			<td>9(82)</td>
			<td>9(90)</td>
			<td>18(86)</td>
			<td>149(86)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Taxas de sobrevivência e mutação de embriões injetados com gRNAs únicas e multiplexadas visando o branco. A tabela é reimpressa com permissão de30

Watch this Scientific Journal Video about Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus at JoVE.com

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Este protocolo descreve procedimentos de microinjeção para embriões culex quinquefasciatus que são otimizados para trabalhar com ferramentas de edição de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica pode gerar eficientemente mutações de germes específicas, hereditárias e germinais que podem ser usadas para a construção de tecnologias genéticas neste vetor de doença subestudado.

Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

embryo-microinjection-techniques-for-efficient-site-specific

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

5.4K visualizações.  University of California, San Diego. Este protocolo descreve procedimentos de microinjeção para embriões culex quinquefasciatus que são otimizados para trabalhar com ferramentas de edição de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica pode gerar eficientemente mutações de germes específicas, hereditárias e germinais que podem ser usadas para a construção de tecnologias genéticas neste vetor de doença subestudado.

Vídeo: Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genética

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Biologia

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Microinjeção de embriões e Eletroporação na cordados<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Biologia do Desenvolvimento

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Injeções embrionárias para mutagênese mediada por CRISPR no saltador de formigas Harpegnathos

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA fragments encoding genes of interest as well as favorable traits into the insect germline in a stable and heritable manner. The resulting transgenic strains can be studied for phenotypic changes resulting from the expression of the integrated DNA to answer basic questions or used in practical applications. Although the technology is straightforward, it requires of the investigator patience and practice to achieve a level of skill that maximizes efficiency. Shown here is a method for microinjection of embryos of the African malaria mosquito, Anopheles gambiae. The objective is to deliver by microinjection exogenous DNA to the embryo so that it can be taken up in the developing germline (pole) cells. Expression from the injected DNA of transposases, integrases, recombinases, or other nucleases (for example CRISPR-associated proteins, Cas) can trigger events that lead to its covalent insertion into chromosomes. Transgenic An. gambiae generated from these technologies have been used for basic studies of immune system components, genes involved in blood-feeding, and elements of the olfactory system. In addition, these techniques have been used to produce An. gambiae strains with traits that may help control the transmission of malaria parasites.

Microinjection Method for Anopheles gambiae Embryos

Microinjection techniques are essential to introduce exogenous genes into the genomes of mosquitoes. This protocol explains a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles gambiae embryos to generate transformed mosquitoes.

Método de microinjeção para embriões anofelinos gambiae

Embryo microinjection techniques are essential for many molecular and genetic studies of insect species. They provide a means to introduce exogenous DNA ...

FiC31 Transgênese embrionária mediada por integrase em Drosophila

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

Autor em destaque: Otimizando a microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microinjeção de zigoto para criação de alelos knock-in e flox de gênico em camundongos

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,

Microinjeção de embriões A. aegypti obter mosquitos transgênicos

Microinjeção de embriões e Eletroporação na cordados

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9

Injeções embrionárias para mutagênese mediada por CRISPR no saltador de formigas Harpegnathos

Método de microinjeção para embriões anofelinos gambiae

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Microinjeção de zigoto para criação de alelos knock-in e flox de gênico em camundongos