Name: fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion
Uploaded: 2020-05-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion at JoVE.com

Este trabalho é apoiado financeiramente pelo NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) e Universidade de Connecticut.

1. Síntese de JBNTs
NOTA: O monômero JBNT foi preparado conforme publicado anteriormente11.
<ol><li>Síntese do composto A1<ol>
<li>Prepare uma solução contendo 8,50 g de ácido 2-cianoacético e 9,80 g de etilcarbama em 25 mL de tolueno e 2,5 mL de N, N-dimetilformamida. Adicione 4,90 mL de cloreto de fósforo dropwise. Em seguida, aqueça a mistura a 70 °C e continue mexendo por 1,5 h.</li>
		<li>Esfrie a mistura de reação à temperatura ambiente e despeje 100 g de água gelada. Extrair a camada aquosa com acetato etílico (3 x 250 mL) e lavar com 100 mL de salmoura. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtrar e evaporar voláteis sob vácuo para obter um sólido amarelo-pálido.</li>
		<li>Sujeito o sólido amarelo à cromatografia da coluna flash de sílica (3% de metanol/diclorometano) para produzir 15,61 g de composto A1 como pó branco.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A2<ol>
<li>Misture 3,12 g de composto A1 e 2,75 g de carbonato de potássio em 50 mL de N, N-dimetilformamida. Mexa em temperatura ambiente por 2h.</li>
		<li>Adicione 2,6 mL de dissulfeto de carbono à suspensão de reação. Continue mexendo por 4h.</li>
		<li>Adicione etanol absoluto à mistura de reação a 0 °C. Filtre o amarelo precipitado e lave com éter dietil. Seque sob vácuo durante a noite para produzir 6,18 g de composto A2 como sólido amarelo-pálido.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A3<ol>
<li>Adicione 2,7 mL de iodeto de metila em 15 mL de acetonitrilo. Além disso, prepare separadamente uma solução de composto A2 adicionando 6,18 g de A2 a 80 mL de água/acetonitrilo (proporção 7:3). Misture as soluções e mexa à temperatura ambiente por 30 minutos.</li>
		<li>Aqueça a mistura de reação a 95 °C e continue mexendo por 3h.</li>
		<li>Esfrie a mistura de reação à temperatura ambiente e, em seguida, evaporar os voláteis sob vácuo.</li>
		<li>Extrair o resíduo 3x com 100 mL de acetato de etila e lavar com salmoura. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para obter um sólido amarelo.</li>
		<li>Sujeito o sólido amarelo à cromatografia da coluna flash de gel de sílica (30% de acetato/hexanos etílicos) para produzir 4,52 g do composto A3 como um sólido amarelo-claro.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A4<ol>
<li>Prepare a solução de alilamina adicionando 925 μL de alilamina em 20 mL de etanol. Adicione esta solução dropwise à solução do composto A3, preparado adicionando 3,14 g de A3 em 75 mL de etanol absoluto, mais de 30 min. Em seguida, aqueça a mistura de reação ao refluxo por 16 h.</li>
		<li>Esfrie a mistura de reação à temperatura ambiente e evapore os voláteis para dar um sólido amarelo.</li>
		<li>Sujeito o sólido amarelo à cromatografia da coluna flash de sílica (50% de acetato/hexanos etílico a 2% de metanol/diclorometano) para produzir 1,80 g de composto A4 como cristal branco.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A5<ol>
<li>Adicione 2,05 g de cloridrato de guanidinium e 7,8 mL de etoóxido de sódio (21 wt% no etanol) em 14 mL de etanol absoluto. Aqueça a mistura a 45 °C por 15 min.</li>
		<li>Filtre o material insolúvel e adicione o filtrado diretamente na solução do composto A4, preparado adicionando 2,70 g de A4 em 40 mL de etanol absoluto. Aqueça a mistura de reação ao refluxo por 16 h.</li>
		<li>Filtre o precipitado para obter 2,65 g de composto A5 como um sólido off-white.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A6<ol>
<li>Adicione 24,9 mL de trietilamina lentamente à mistura de chorume obtida adicionando 2,11 g de composto A5 e 1,10 g de 4-Dimethylaminopyridina em 120 mL de tetrahidrofurano acima de 1 min. Mexa em temperatura ambiente por 2 minutos.</li>
		<li>Adicione 20,7 mL de di-tert-butyl dicarbonato dropwise à mistura de reação e continue mexendo à temperatura ambiente por 40 h.</li>
		<li>Adicione 20 mL de água para saciar a reação. Evaporar os voláteis sob vácuo.</li>
		<li>Extrair o resíduo viscoso vermelho com 500 mL de acetato de etila. Em seguida, lave-o com 250 mL de água, 75 mL de ácido cítrico 10%, 2x com 200 mL de água, 200 mL de bicarbonato de sódio saturado e 200 mL de salmoura. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para dar um sólido vermelho/laranja.</li>
		<li>Sujeito o sólido à cromatografia da coluna flash de gel de sílica (0-20% acetato/hexanos) para produzir 3,87 g de composto A6 como espuma branca.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A7<ol>
<li>Adicione N-metilmorpholine N-óxido (50 wt.% em água, 1,64 mL) dropwise à solução do composto A6 (2,93 g) em acetona/água (8:1, 58,5 mL) e mexa à temperatura ambiente por 5 minutos.</li>
		<li>Adicione tetraóxido de ósmio (solução aquosa de 4%) à mistura durante um período de 3 minutos e continue mexendo à temperatura ambiente por 24h.</li>
		<li>Sacia a reação com sulfito de sódio aquoso de 1,0 M até que a solução fique incolor. Remova os voláteis sob vácuo para resultar em um chorume branco na água. Extrair o resíduo com 350 mL de diclorometano e depois lavar com 150 mL de água seguido de uma lavagem com 150 mL de salmoura.</li>
		<li>Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para produzir 2,45 g de composto A7 como um sólido branco.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A8<ol>
<li>Adicione 760 g de periodide de sódio à mistura de 1,36 g de composto A7 em 35 mL de diclorometano/água (6:1, 35 mL) e mexa à temperatura ambiente por 42 h.</li>
		<li>Filtre o material insolúvel e concentre o filtrado sob vácuo. Extrair o resíduo resultante com 250 mL de diclorometano e, em seguida, lavar com 100 mL de água e 100 mL de salmoura. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para dar o produto bruto.</li>
		<li>Sujeito o produto bruto à cromatografia da coluna flash de sílica (5-40% acetato/hexanos etílicos, depois 5% metanol/diclorometano) para produzir 1,08 g de composto A8.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do composto A9<ol>
<li>Prepare uma solução de 830 mg de composto A8 em 15 mL de 1,2-dicloroetano. Adicione a solução de dropwise à mistura de 6-benzyloxycarbonylamino-2-L-amino-hexanoico ácido trimetilsilyl etil ester (649,5 mgs) e N, N-diisopropiltilamina (591 μL) em 24 mL de 1,2-dicloroetano ao longo de 3 min e mexa em temperatura ambiente por 15 minutos.</li>
		<li>Adicione 360,3 mg de triacetoxyboroidride de sódio à solução e continue mexendo à temperatura ambiente por 24 h.</li>
		<li>Sacie a mistura de reação com 6 mL de água. Extrair a mistura de reação 3x com 200 mL de diclorometano e lavar com 200 mL de ácido cítrico de 10% em água, 2x com 200 mL de água, 200 mL de bicarbonato de sódio saturado e 200 mL de salmoura nessa ordem. Seque a camada orgânica sobre sulfato de sódio anidro, filtre e evapore os voláteis sob vácuo para obter o produto bruto.</li>
		<li>Sujeito o produto bruto à cromatografia da coluna flash de gel de sílica (5-30% acetato/hexanos) para produzir 885 mg composto A9.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntese do monômero JBNT<ol>
<li>Dissolva 0,54 g de composto A9 (0,54 g) em 10 mL de solução de ácido/tioanisola trifluoroacética de 94% e mexa à temperatura ambiente por 72 h.</li>
		<li>Adicione éter dietil (80 mL) à mistura de reação e centrífugue o precipitado para baixo. Despeje o ácido trifluoroacético claro contendo supernanato e lave o precipitado branco com éter dietilo e metanol para produzir 168,6 mg de monômero JBNT bruto(Arquivo Suplementar 1).</li>
		<li>Purifique o monômero JBNT bruto por uma cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) com uma coluna de fase inversa. O programa de isolamento está listado abaixo: Solvente A: 100% água; solvente B: 100% acetonitrilo; solvente C: pH=1 Solução hcl de água; fluxo: 3 mL/min (ver Tabela 1).</li>
		<li>Colete o maior pico em cerca de 7,2 min.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fabricação para JBNT/FN
<ol><li>Adicione 80 μL de solução aquosa JBNT de 1 mg/mL a 40 μL de solução aquosa de 1 mg/mL FN e pipeta várias vezes.</li>
	<li>Verifique a presença de suspensão branca sólida após a pipetação por cerca de 10 s. NOTA: Um vídeo foi filmado para capturar o processo de automontagem do NM (Arquivo Suplementar 2).</li>
</ol>3. Observação de espécimes liofilizados
NOTA: Esta etapa é realizada para mostrar a estrutura do andaime de NM feita de JBNTs e FN.
<ol><li>Prepare soluções FN, JBNT e FN/JBNT NM para observação de materiais liofilizados. Diluir 10 μL de 100 μg/mL de FN com 40 μL de água destilada para fazer uma solução de 20 μg/mL de FN.</li>
	<li>Prepare a solução de 100 mg/mL de JBNTs diluindo 5 μL de 1 mg/mL JBNTs em 45 μL de água DI.</li>
	<li>Misture 10 μL de 100 μg/mL FN e 5 μL de 1 mg/mL de JBNTs em 35 μL de água DI para formar a solução NM.</li>
	<li>Cubra três poços de microplacas de fundo redondos de 96 bem claras com a solução FN, JBNT e solução NM, respectivamente. Cada poço recebe 50 μL da solução.</li>
	<li>Realizar a liofilização, como descrito abaixo, para visualizar a estrutura do andaime do NM.<ol>
<li>Congele a placa a -80 °C durante a noite.</li>
		<li>Ligue o instrumento liofilizado e a bomba de vácuo.</li>
		<li>Pressione o botão de desligar para reduzir a temperatura do sistema para -50 °C.</li>
		<li>Coloque a placa congelada no instrumento liofilizado e feche todas as aberturas dos instrumentos.</li>
		<li>Clique no botão iniciar para reduzir a pressão do sistema para 0,9 mbar.</li>
		<li>Depois de 4h, pressione o botão de aerado e abra a válvula para aumentar a pressão do sistema à pressão atmosférica.</li>
		<li>Tire a placa do instrumento liofilizado.</li>
		<li>Use um microscópio para observar o FN, JBNTs e o NM auto-montado resultante. Tire várias fotos com uma câmera para os materiais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Medição de espectro de absorção
NOTA: Use a alteração de espectro para FN e JBNTs para apresentar o auto-montado JBNT/FN NM12.
<ol><li>Misture 30 μL de 100 μg/mL FN com 15 μL de água destilada e 5 μL de 1 mg/mL JBNTs para preparar a solução JBNT/FN NM. A suspensão sólida branca pode ser vista depois de pipetting a solução várias vezes. NOTA: As concentrações finais de JBNTs e FN na solução são de 100 μg/mL e 60 μg/mL, respectivamente. JBNTs e soluções FN na mesma concentração à utilizada na solução NM também foram preparadas como soluções de controle.</li>
	<li>Diluir 5 μL de 1 mg/mL de JBNTs com 45 μL de água destilada para preparar a solução de controle JBNT.</li>
	<li>Diluir 30 μL de 100 μg/mL FN com 20 μL de água destilada para preparar a solução de controle FN.</li>
	<li>Meça o espectro de absorção UV-vis das soluções FN, JBNT e JBNT/FN NM com o espectotômetro (ver Tabela de Materiais) para caracterizar a montagem de NM.<ol>
<li>Clique no botão UV-Vis. Limpe a superfície de teste do espectrofotômetro e solte 2 μL de água destilada sobre ele. Meça-o como em branco de 190-850 nm.</li>
		<li>Limpe a superfície de teste do espectrofotômetro e solte 2 μL de solução FN sobre ele. Meça o espectro de absorção UV-Vis da solução FN de 190 nm a 850 nm.</li>
		<li>Limpe a superfície de teste do espectrofotômetro e solte 2 μL de solução JBNT sobre ele. Meça o espectro de absorção da solução JBNT de 190 nm a 850 nm.</li>
		<li>Limpe a superfície de teste do espectrofotômetro e solte 2 μL da solução JBNT/FN NM sobre ele. Meça os espectros de absorção da solução JBNT/FN NM de 190 nm a 850 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Preparação do JBNT/FN NM para microscopia eletrônica de transmissão (TEM)
<ol><li>Limpe várias grades antes da coloração negativa com um limpador de plasma básico (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Realize a coloração negativa para os espécimes seguindo dois processos diferentes.<ol>
<li>Solte 3 μL de 1 mg/mL de solução aquosa JBNTs e 3 μL de solução JBNT/FN NM em grades separadas e deixe-a por 2 minutos. Em seguida, enxágüe cada grade com 100 μL de solução de acetato de urânl (UA) de 0,5%. Escorra a solução em excesso com papel filtro e o ar seque as grades.</li>
		<li>Misture 9 μL de solução JBNT/FN NM com 3 μL de solução UA de 2,0% e pipeta várias vezes. Pipeta a solução mista nas grades e mantenha-a nas grades por 2 minutos. Use um papel filtro para remover a solução mista das grades e secar as grades à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Por fim, caracterize a amostra para JBNTs, JBNT/FN NM manchada com a etapa 5.2.1, e JBNT/FN NM manchada com a etapa 5.2.2 com o TEM.</li>
</ol>6. Ensaio de função biológica in vitro
<ol><li>Adicione 200 μL de controles negativos (NC, PBS), JBNTs, FN e as soluções JBNT/FN NM em um poço de um slide de câmara de 8 poços, respectivamente.</li>
	<li>Congele a tampa de 8 poços com o instrumento liofilizado para revestir materiais na parte inferior dos poços. O protocolo de secagem congelante é o mesmo do passo 3.5.</li>
	<li>Em seguida, adicione 10.000 células/poços hMSCs (Passagem 3) nos poços e incuba-os por 24h a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Após a incubação, pipeta o meio de cultura celular dos poços e enxágue a cultura com solução 1x PBS.</li>
	<li>Adicione 100 μL da solução fixativa a cada poço com células e deixe por 5 minutos. Enxágüe as células suavemente com 1x PBS duas vezes.</li>
	<li>Diluir 1% Triton-X 100 a 0,1%. Adicione 100 μL de 0,1% Triton-X 100 a cada poço com células e deixe por 10 minutos. Enxágüe as células suavemente com 1x PBS duas vezes.</li>
	<li>Diluir a falooidina de Rhodamina para 1,65 μM. Adicione 100 μL de Rhodamine Phalloidin a cada poço com células e incubar o vidro de cobertura de câmara mantendo-se da luz à temperatura ambiente por 30 minutos. Enxágüe as células suavemente com 1x PBS duas vezes.</li>
	<li>Capture as imagens celulares com um microscópio fluorescente.</li>
	<li>Conte os números de células em imagens fluorescentes para cada grupo. Calcule a densidade de adesão celular por uma média de três áreas aleatórias em cada poço.</li>
	<li>Apresentar todos os dados como desvio padrão ± médio (SD). Realizar análises estatísticas utilizando-se um teste t-cauda-de-cauda, seguido da análise de variância (ANOVA) com p<0,05, que é considerado estatisticamente significante.</li>
</ol>

<ol>
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G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells.">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo.">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li></ol>

Dr. Yupeng Chen é um co-fundador da NanoDe Therapeutics, Inc.

Neste estudo, desenvolvemos um NM biomimético auto-montado, que foi formado com JBNTs inspirados em DNA e FN. Ao preparar a solução JBNT, o pó liofilizado JBNT deve ser dissolvido na água em vez de PBS, pois a PBS causará aglomeração de JBNTs, o que inibe sua montagem. Além disso, o NM também deve ser montado em água se quisermos observar as estruturas nanofibrilas do NM, pois o sal em PBS vai empacotar com fibras NM, o que pode reduzir muito a resolução das imagens.
O NM tem mostrado grande potencial para servir como um novo andaime de engenharia de tecidos, embora muitos esforços tenham sido feitos para fabricar andaimes regenerativos de tecido, que foram usados para facilitar a adesão e diferenciação dos HMSCs. No entanto, a maioria desses materiais são pré-fabricados com uma forma específica, como um andaime impresso em 3D18,19. Como tal, eles não são fáceis de serem implantados em locais feridos que estão no fundo da articulação. No entanto, a solução NM aqui pode ser injetada como um líquido e, em seguida, servir como um andaime para adesão celular.
Uma limitação é que o NM não é mecanicamente forte. Ao contrário dos polímeros, eles são fabricados através da auto-montagem de interações não covalentes, de modo que eles não podem suportar um monte de carga mecânica ou tensão. Por outro lado, a estrutura não covalente também apresenta biodegradabilidade e biocompatibilidade muito boas adequadas para funções biológicas8,20,21.
O NM injetável mostrou grande potencial para fornecer um local alvo e um andaime para o homing MSC para melhorar a cicatrização da fratura óssea no corpo. No entanto, quando injetado no local lesionado, o NM não covalente pode não permanecer no local por muito tempo, o que pode reduzir o efeito terapêutico. No futuro, exploraremos incorporar outros materiais (como hidrogéis) ou alternar as estruturas de NM para otimizar ainda mais as propriedades do andaime NM.

As células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) têm mostrado o potencial de auto-renovação e auto-diferenciação ao longo de diferentes linhagens mesenquimais, o que ajuda na regeneração e manutenção dos tecidos1. Com base no potencial de diferenciação, os HMSCs são considerados candidatos a lesões de tecido mesenquimal e terapia de transtorno hematopoiético2. hMSCs têm mostrado a capacidade de promover a cicatrização de feridas aumentando a reparação de tecidos, angiogênese e reduzindo a inflamação3. No entanto, sem assistência bioquímica ou biomaterial, a eficiência para que os hMSCs atinjam um tecido alvo e funcionem no local desejado é baixa4. Embora vários andaimes projetados tenham sido utilizados para atrair hMSCs para aderir às lesões, alguns locais como a fratura da placa de crescimento, no meio de um osso longo, não são facilmente acessíveis pelos andaimes convencionais pré-fabricados, que podem não se encaixar perfeitamente em um local lesionado de forma irregular.
Aqui, desenvolvemos um nanomaterial biomimético que pode se auto-montar in situ e ser injetado em uma área alvo de difícil acesso. O bioescato injetável NM é composto por nanotubos base janus (JBNTs) e fibronectina (FN). Os JBNTs, também conhecidos como Nanotubos Rosette (RNTs), são derivados de pares de bases de DNA, especificamente timina e adenina, aqui5,6,7. Como visto na Figura 1,os nanotubos são formados quando seis moléculas da base de DNA derivada se auto-montam através de ligações de hidrogênio para formar um plano6. Seis moléculas são então empilhadas uma sobre a outra em um plano através de uma forte interação pi-empilhamento7, que pode ser de até 200-300 μm de comprimento. Os JBNTs são projetados para imitar morfologicamente fibras de colágeno para que a FN reaja com elas.
FN é uma glicoproteína adesiva de alto peso molecular, que pode ser encontrada na matriz extracelular (ECM)9. Estes podem mediar a fixação de células-tronco a outros componentes do ECM, particularmente o colágeno10. Projetamos JBNTs para imitar morfologicamente fibras de colágeno para que a FN possa reagir com eles para formar NM em poucos segundos através de ligação não covalente. Portanto, nm é um promissor bioescato a ser injetado em um local de fratura óssea que não poderia ser acessível pelos andaimes convencionalmente fabricados. Aqui, o NM injetável apresenta uma excelente capacidade de melhorar a ancoragem hMSC in vitro, exibindo seu potencial para servir como um andaime para regeneração tecidual.

<table><tbody><tr><td>1,2-dichloroethane</td><td>Alfa Aesar</td><td>39121</td><td></td></tr><tr><td>2-cyanoacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C88505</td><td></td></tr><tr><td>4-Dimethylaminopyridine</td><td>TCI America</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>8 wells Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>absolute ethanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>allylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>145831</td><td></td></tr><tr><td>Basic Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC32G</td><td></td></tr><tr><td>citric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>concentrated hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Deionized water</td><td>Thermo Fisher</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>dichloromethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Di-tert-butyl dicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>361941</td><td></td></tr><tr><td>ethyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319902</td><td></td></tr><tr><td>ethylcarbamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37814</td><td></td></tr><tr><td>guanidinium hydrochloride</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13543</td><td></td></tr><tr><td>hexanes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227064</td><td></td></tr><tr><td>Human mesenchymal stem cells</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>methyl iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17114</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>N-Methylmorpholine N-oxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>A19802</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>45385</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>phosphoryl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td></td></tr><tr><td>potassium carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>347825</td><td></td></tr><tr><td>reverse phase column</td><td>Thermo Fisher</td><td>25305-154630</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>silica gel</td><td>TCI America</td><td>S0821</td><td></td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>sodium ethoxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13083</td><td></td></tr><tr><td>sodium periodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>sodium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>sodium sulfite</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>sodium triacetoxyborohydride</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22060</td><td></td></tr><tr><td>spectrophotometer(NanoDrop One/One&lt;sup&gt;c&lt;/sup&gt; UV-Vis)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stem Cell Growth Medium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>thioanisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T28002</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>triethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12646</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion

Um NM biomimético foi desenvolvido para servir como um andaime biológico de engenharia tecidual, que pode melhorar a ancoragem de células-tronco. O NM biomimético é formado a partir de JBNTs e FN através de auto-montagem em uma solução aquosa. Os JBNTs medem 200-300 μm de comprimento com canais ocos hidrofóbicos internos e superfícies hidrofílicas externas. Os JBNTs são carregados positivamente e as FNs são cobradas negativamente. Portanto, quando injetados em uma solução aquosa neutra, eles são unidos através de laços não covalentes para formar os feixes NM. O processo de automontagem é concluído dentro de alguns segundos sem qualquer iniciador químico, fonte de calor ou luz UV. Quando o pH da solução NM for inferior ao ponto isoelétrico das FNs (pI 5.5-6.0), os feixes de NM serão auto-liberados devido à presença de FN carregado positivamente.
NM é conhecido por imitar a matriz extracelular (ECM) morfologicamente e, portanto, pode ser usado como um andaime injetável, que fornece uma excelente plataforma para melhorar a adesão do HMSC. A análise da densidade celular e os experimentos de imagem de fluorescência indicaram que os NMs aumentaram significativamente a ancoragem de hMSCs em comparação com o controle negativo.

Nossos estudos descobriram que a formação do NM de JBNTs e FN é rápida, o que aconteceu em 10 segundos. Como mostrado na Figura 2,o flocule branco foi obtido quando a solução JBNT foi misturada com a solução FN e pipetada várias vezes. O processo de formação de NM é completamente biomimético. Não são necessários estímulos externos. O processo de fabricação é muito mais fácil do que o de alguns biomateriais emergentes, que são baseados em luz ultravioleta ou iniciador químico para crosslinking13.
Capturamos e analisamos as imagens das câmeras de FN, JBNTs e NM (Figura 3). Para o grupo FN, com exceção das manchas brancas curtas, não foram observadas fibras longas. Os clusters curtos foram as aglomerações proteicas constituídas por FN, o que indica que a estrutura do andaime não pode ser formada apenas com FN sem JBNTs(Figura 3A). Como mostrado na Figura 3B,as fibras longas e mais finas indicam a existência de JBNTs. A largura dos fios brancos do NM é maior em comparação com os JBNTs, indicando que os JBNTs e FN se cruzaram entre si formando NM. A fibra NM pode crescer até vários centímetros de comprimento(Figura 3C).
Obtivemos o espectro UV-Vis para indicar a montagem entre JBNTs e FN. Como mostrado na Figura 4,os JBNTs exibem dois picos de absorção de 220 nm e 280 nm, respectivamente. Em comparação com os JBNTs, o JBNT/FN NM tem dois picos de absorção no mesmo local com um valor significativamente reduzido, que era de JBNTs, mas afetado pelos JBNTs não covalentes auto-montados e FN no meio.
O TEM foi utilizado para caracterizar a morfologia dos JBNTs e NM. Como mostrado na Figura 5A,os JBNTs são tubos finos com diâmetros uniformes. Em condições neutras, os JBNTs são carregados positivamente enquanto a FN é carregada negativamente. Quando misturados, formaram NM fibroide longo através de interações de carga(Figura 5B). Quando o pH é inferior ao ponto isoelétrico da FN (pI de 5,5-6,0), os feixes de NM apresentam auto-liberação devido à FN positivamente carregada. Como mostrado na Figura 5C,quando preservado em uma solução com pH baixo (4.0), o NM foi dissimurado, e muito de FN foi liberado do NM. A FN distribuída ao lado do nanotubo também é uma forte evidência de que o NM foi fabricado por JBNTs e FN10.
Exploramos o efeito do JBNT/FN NM na adesão celular. Como mostrado na Figura 6,a densidade de adesão celular do grupo NM mostrou diferença significativa (valor p <0,05) em relação ao controle negativo. A diferença pode ser porque o NM foi projetado para imitar morfologicamente o ECM, que fornece um andaime para adesãocelular 14. O ECM era composto por colagens e glicoproteínas adesivas celulares, como a fibronectina15. O colágeno tem sido apresentado com a capacidade de promover maior adesão e proliferação de hMSCs16. Além disso, a fibronectina tem sido demonstrada para aumentar a adesão dos HMSCs no local lesionado, bem como15. A imagem de fluorescência também demonstrou que a adesão dos HMSCs do grupo NM aumentou significativamente em relação ao grupo de controle negativo (Figura 7)15,17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig01.jpg"> Figura 1: Ilustração esquemática da automontagem hierárquica dos JBNTs com uma cadeia lateral de lise. Este valor é reimpresso com permissão da publicação anterior12. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig02.jpg"> Figura 2: Demonstração para o processo auto-montado do NM. (A)Solução FN. (B) JBNTs misturados com FN. Este valor é reimpresso com permissão da publicação anterior12. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig03.jpg"> Figura 3: Fotografias de Brightfield. Fotografias brightfield de (A) FN (B) JBNTs e(C) NM formada por JBNTs e FN. Cada área tem um diâmetro de 2 cm. Este valor é reimpresso com permissão da publicação anterior12. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig04.jpg"> Figura 4: Espectros de absorção de FN, JBNTs e JBNT/FN NM. Este valor é reimpresso da publicação anterior12. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig05.jpg"> Figura 5: Imagens TEM. TEM imagens de (A) JBNTs (B) JBNT/FN NM, e (C) lançou JBNT/FN NM. Este valor é reimpresso com permissão da publicação anterior12. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig06.jpg"> Figura 6: Análise estatística da adesão celular. A densidade de adesão celular foi registrada neste experimento. *p<0,01 em comparação com controles negativos. **p<0,05 em comparação apenas com jbnt. N=3. Este valor é reimpresso com permissão da publicação anterior12. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig07.jpg"> Figura 7: Imagens de fluorescência. Imagens de fluorescência de (A) os hMSCs e (B) o hMSC incubado com os JBNTs. (C) o hMSC incubado com o FN. (D) o hMSC incubado com o JBNT/FN NM. Barra de escala: 100 μm. Este valor é reimpresso com permissão da publicação anterior12. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hora</td>
			<td>A%</td>
			<td>B%</td>
			<td>C%</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,00 min.</td>
			<td>98</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>15:00 min.</td>
			<td>68</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>25,00 min.</td>
			<td>8</td>
			<td>90</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>26.00 min</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Tempo de eluição do gradiente.
Arquivo Suplementar 1: Esquema para a síntese do monômero JBNT. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317supfig01.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar este número.</a>
Arquivo Suplementar 2: Vídeo para automontagem do FN/JBNT NM. <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/Supplemental_File_2.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>

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Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

O objetivo deste protocolo é mostrar a montagem de uma nanomatrix biomimética (NM) com nanotubos base janus (JBNTs) e fibronectina (FN). Quando co-cultivados com células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs), os NMs apresentam excelente bioatividade no incentivo à adesão dos HMSCs.

Fabricação de uma Nano-Matriz Biomimética com Nanotubos base janus e fibronectina para adesão de células-tronco

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K visualizações.  University of Connecticut. O objetivo deste protocolo é mostrar a montagem de uma nanomatrix biomimética (NM) com nanotubos base janus (JBNTs) e fibronectina (FN). Quando co-cultivados com células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs), os NMs apresentam excelente bioatividade no incentivo à adesão dos HMSCs.

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Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Preparação de fibrina Andaimes 3D para aplicações de cultura de células-tronco

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Bioengenharia

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber diameter, composition and organization. In addition to providing structural support, the physical and chemical properties of the ECM play an important role in multiple cellular processes including adhesion, differentiation, and apoptosis. In vivo, the ECM is assembled by exposing cryptic self-assembly (fibrillogenesis) sites within proteins. This process varies for different proteins, but fibronectin (FN) fibrillogenesis is well-characterized and serves as a model system for cell-mediated ECM assembly. Specifically, cells use integrin receptors on the cell membrane to bind FN dimers and actomyosin-generated contractile forces to unfold and expose binding sites for assembly into insoluble fibers. This receptor-mediated process enables cells to assemble and organize the ECM from the cellular to tissue scales. Here, we present a method termed surface-initiated assembly (SIA), which recapitulates cell-mediated matrix assembly using protein-surface interactions to unfold ECM proteins and assemble them into insoluble fibers. First, ECM proteins are adsorbed onto a hydrophobic polydimethylsiloxane (PDMS) surface where they partially denature (unfold) and expose cryptic binding domains. The unfolded proteins are then transferred in well-defined micro- and nanopatterns through microcontact printing onto a thermally responsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) surface. Thermally-triggered dissolution of the PIPAAm leads to final assembly and release of insoluble ECM protein nanofibers and nanostructures with well-defined geometries. Complex architectures are possible by engineering defined patterns on the PDMS stamps used for microcontact printing. In addition to FN, the SIA process can be used with laminin, fibrinogen and collagens type I and IV to create multi-component ECM nanostructures. Thus, SIA can be used to engineer ECM protein-based materials with precise control over the protein composition, fiber geometry and scaffold architecture in order to recapitulate the structure and composition of the ECM in vivo.

A method to obtain nanofibers and complex nanostructures from single or multiple extracellular matrix proteins is described. This method uses protein-surface interactions to create free-standing protein-based materials with tunable composition and architecture for use in a variety of tissue engineering and biotechnology applications.

Nanofibras ECM proteínas e Nanoestruturas Engineered Usando Assembléia iniciou-Surface

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Electrospun nanofibras Andaimes com gradações de Organização Fiber

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Expansão Nanopatterned Substratos usar a técnica do ponto de Nanotopographical modulação do comportamento celular

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations having a major effect. Here we present a method to obtain large-scale uneven nanopatterns of arginine-glycine-aspartic acid (RGD)-functionalized dendrimers that permit the nanoscale control of local RGD surface density. Nanopatterns are formed by surface adsorption of dendrimers from solutions at different initial concentrations and are characterized by water contact angle (CA), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), and scanning probe microscopy techniques such as scanning tunneling microscopy (STM) and atomic force microscopy (AFM). The local surface density of RGD is measured using AFM images by means of probability contour maps of minimum interparticle distances and then correlated with cell adhesion response and differentiation. The nanopatterning method presented here is a simple procedure that can be scaled up in a straightforward manner to large surface areas. It is thus fully compatible with cell culture protocols and can be applied to other ligands that exert concentration-dependent effects on cells.

A method to obtain dendrimer-based uneven nanopatterns that permit the nanoscale control of local arginine-glycine-aspartic acid (RGD) surface density is described and applied for the study of cell adhesion and chondrogenic differentiation.

Baseado em dendrímeros Nanopatterns desigual de adesividade de superfície de controle localmente: um método para direcionar Chondrogenic diferenciação

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Fabricação de poços de Agarose personalizado para a propagação de células e tecido anel Self-assembly usando moldes 3D-impresso

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

Fabricação de gradiente Nanopattern pela técnica de Nanoimprinting térmica e rastreio da resposta das células formadoras endoteliais humanas

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo uses. The addition of growth factors into these biomaterial scaffolds is generally done to provide an optimal cell culture environment, mediating cell differentiation and its subsequent functions. However, the growth factors in a conventional biomaterial scaffold are typically designed to be released upon implantation, which could result in unintended side effects on surrounding tissue or cells. Here, the DNA-inspired Janus base nano-matrix (JBNm) has successfully achieved a highly localized microenvironment with a layer-by-layer structure for self-sustainable cartilage tissue constructs. JBNms are self-assembled from Janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3, and transforming growth factor beta-1 (TGF-&#946;1) via bioaffinity. The JBNm was assembled at a TGF-&#946;1:matrilin-3:JBNt ratio of 1:4:10, as this has been the determined ratio at which proper assembly into the layer-by-layer structure could occur. First, the TGF-&#946;1 solution was added to the matrilin-3 solution. Then, this mixture was pipetted several times to ensure sufficient homogeneity before the addition of the JBNt solution. This formed the layer-by-layer JBNm, after pipetting several times again. A variety of experiments were performed to characterize the layer-by-layer JBNm structure, JBNts alone, matrilin-3 alone, and TGF-&#946;1 alone. The formation of JBNm was studied with UV-Vis absorption spectra, and the structure of the JBNm was observed with transmission electron microscopy (TEM). As the innovative layer-by-layer JBNm scaffold is formed on a molecular scale, the fluorescent dye-labeled JBNm could be observed. The TGF-&#946;1 is confined within the inner layer of the injectable JBNm, which can prevent the release of growth factors to surrounding areas, promote localized chondrogenesis, and promote an anti-hypertrophic microenvironment.

This protocol describes the assembly of a layer-by-layer Janus base nano-matrix (JBNm) scaffold by adding Janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3, and Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-&#946;1) sequentially. The JBNm was fabricated and characterized; additionally, it displayed excellent bioactivity, encouraging cell functions such as adhesion, proliferation, and differentiation.

Fabricação e Caracterização de Nano-Matriz de Base Janus Camada por Camada para Promover a Regeneração da Cartilagem

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo ...

Fabricating Engineered Nanofibrillar Collagen with Directed Patterning

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are designed to emulate the biophysical properties of native tissue, providing cellular phenotypic and morphological guidance that contributes to the restoration of the regenerative tissue niche. Collagen, a prevalent extracellular matrix protein, is a common component of these regenerative biomaterials due to its biocompatibility and other favorable properties. The current study describes a novel and straightforward method for the fabrication of engineered nanofibrillar collagen with directed fibril patterning. Through the manipulation of shear stress, temperature, and pH, collagen fibrillogenesis and alignment are precisely controlled without requiring specialized equipment. This approach allows for the creation of nanofibrillar collagen biomaterials that mimic the native structure of tissues exhibiting either anisotropic or isotropic characteristics. The flexibility in collagen nanofibril patterning not only facilitates the study of nanoscale patterning on cell behavior but also offers diverse possibilities for patterned tissue engineering applications.

The following protocol presents a shear-based extrusion method for the fabrication of collagen hydrogels with nanoscale patterned fibrils, which can be applied to a broad range of tissue engineering applications.

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are ...