Name: fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion
Uploaded: 2020-05-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion at JoVE.com

この作業は、NIH(グランツ1R01AR072027-01、1R03AR069383-01)、NSFキャリアアワード(1653702)、コネチカット大学によって財政的にサポートされています。

1. JBNTの合成
注:JBNTモノマーは、以前に公開された11として準備されました。
<ol><li>化合物A1の合成<ol>
<li>2-シアノー酢酸8.50g、エチルカルバミン酸9.80gを25mLのトルエンと2.5mLのN、N-ジメチルホルムアミドで調製する。4.90 mLの塩化ホスホリルを滴下する。その後、混合物を70°Cに加熱し、1.5時間攪拌し続けます。</li>
		<li>反応混合物を室温まで冷却し、100gの氷水を注ぎます。酢酸エチル(3 x 250 mL)で水層を抽出し、100 mLのブラインで洗浄します。無水硫酸ナトリウムの上に有機層を乾燥させ、真空下で揮発性物質を濾過し、蒸発させて淡黄色の固体を得る。</li>
		<li>黄色の固体をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(3%メタノール/ジクロロメタン)に供し、白色粉末として化合物A1の15.61gを得た。</li>
	</ol></li>
	<li>化合物A2の合成<ol>
<li>化合物A1の3.12gと2.75gの炭酸カリウムを50mLのN、N-ジメチルホルムアミドに混ぜます。室温で2時間かき混ぜます。</li>
		<li>2.6 mLの炭素二硫化物を反応懸濁液に加えます。4時間かき混ぜ続けます。</li>
		<li>0°Cの反応混合物に絶対エタノールを加える。 黄色の沈殿物をろ過し、ジエチルエーテルで洗います。真空下で一晩乾燥し、淡黄色の固体として化合物A2の6.18gを得る。</li>
	</ol></li>
	<li>化合物A3の合成<ol>
<li>15 mLのアセトニトリルにヨウ化メチル2.7 mLを加えます。また、6.18gのA2を80mLの水/アセトニトリル(7:3比)を加えて化合物A2の溶液を別途調製する。両方の溶液を混合し、室温で30分間攪拌します。</li>
		<li>反応混合物を95°Cに加熱し、3時間撹拌し続けます。</li>
		<li>反応混合物を室温まで冷却し、次に真空下で揮発液を蒸発させます。</li>
		<li>残渣3xを酢酸エチル100mLで抽出し、ブラインで洗浄します。無水硫酸ナトリウムの上に有機層を乾燥させ、真空下で揮発物を濾過し、蒸発させて黄色の固体を得る。</li>
		<li>黄色の固体をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(30%酢酸エチル/ヘキサン)に供し、化合物A3の4.52gをライトイエロー固体として得る。</li>
	</ol></li>
	<li>化合物A4の合成<ol>
<li>20 mLのエタノールに925 μLのアライラミンを加えて、アライラミン溶液を調製します。この溶液を化合物A3の溶液に滴下して添加し、30min以上の無水エタノールの75mLに3.14gのA3を加えて調製した。その後、反応混合物を16時間加熱還流する。</li>
		<li>反応混合物を室温まで冷却し、揮発性物質を蒸発させて黄色の固体を与えます。</li>
		<li>黄色の固体をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(50%酢酸エチル/ヘキサン〜2%メタノール/ジクロロメタン)に供し、白色結晶として化合物A4の1.80gを得た。</li>
	</ol></li>
	<li>化合物A5の合成<ol>
<li>14 mLの絶対エタノールに2.05gの塩酸グアニジニウムと7.8mLのナトリウムエトキシド(エタノール中21重量%)を加える。混合物を45°Cに加熱し、15分間加熱します。</li>
		<li>不溶性物質を濾取し、40 mL絶対エタノールに2.70gのA4を加えて調製した化合物A4の溶液に直接濾液を加える。反応混合物を16時間加熱還流する。</li>
		<li>沈殿をろ過し、オフホワイト固体として化合物A5の2.65gを得る。</li>
	</ol></li>
	<li>化合物A6の合成<ol>
<li>24.9 mLのトリエチルアミンを、1分以上のテトラヒドロフランの120 mLに化合物A5の2.11gと4-ジメチルアミノピリジン1.10 gを加えたスラリー混合物にゆっくりと加える。室温で2分間かき混ぜます。</li>
		<li>20.7 mLのジテルブチルジカーボネートを反応混合物に滴下し、室温で40時間撹拌し続けます。</li>
		<li>20mLの水を加える。真空下で揮発性を蒸発させる。</li>
		<li>500mLの酢酸エチルで赤粘性残基を抽出する。その後、250mLの水、10%のクエン酸75mL、200mLの水で2倍、飽和炭酸ナトリウム200mL、ブライン200mLで洗浄します。無水硫酸ナトリウムの上に有機層を乾燥させ、フィルターをかけ、真空下で揮発を蒸発させて、赤/オレンジの固体を与えます。</li>
		<li>固体をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(0-20%酢酸エチル/ヘキサン)に供し、白い泡として化合物A6の3.87gを得た。</li>
	</ol></li>
	<li>化合物A7の合成<ol>
<li>化合物A6(2.93g)の溶液にN-メチルモルフォリンN酸化物(水中50重量%、1.64mL)を加え、室温で5分間攪拌します。</li>
		<li>3分間にわたって混合物に4%水溶液のオスミウム(4%水溶液)を加え、室温で24時間撹拌し続けます。</li>
		<li>溶液が無色になるまで1.0M水性亜硫酸ナトリウムで反応を焼き付けます。真空下で揮発性物質を取り除き、水中に白いスラリーを生じさせます。350mLのジクロロメタンで残留物を抽出し、150mLの水で洗浄し、150mLのブラインで洗浄します。</li>
		<li>有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で揮発性物質を濾過し、蒸発させて、白色固体として化合物A7の2.45gを得る。</li>
	</ol></li>
	<li>化合物A8の合成<ol>
<li>ニクロロメタン/水(6:1、35mL)の化合物A7の1.36gの混合物に760gの歯ごめきナトリウムを加え、室温で42時間攪拌します。</li>
		<li>不溶性物質をろ過し、真空下で濾液を濃縮します。得られた残渣を250mLのジクロロメタンで抽出し、100mLの水と100mLのブラインで洗浄します。無水硫酸ナトリウムの上に有機層を乾燥させ、真空下で揮発物をろ過し、蒸発させて粗生成物を与えます。</li>
		<li>粗生成物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(5-40%酢酸エチル/ヘキサン、5%メタノール/ジクロロメタン)に供し、化合物A8の1.08gを得る。</li>
	</ol></li>
	<li>化合物A9の合成<ol>
<li>1,2-ジクロロエタンの15 mLに830mgの化合物A8の溶液を調製する。6-ベンジルオキシカルボニルアミノミノ-2-L-アミノ-ヘキサノ酸トリメチルシリルエチルエステル(649.5 mg)とN,N-ジイソプロピレチルアミン(591 μL)の混合物に滴下の溶液を1,2-ジクロロエタンの24 mLで加え、15分間室温で攪拌します。</li>
		<li>360.3 mgのトリアセトキシ水素化ナトリウムを溶液に加え、室温で24時間撹拌し続けます。</li>
		<li>反応混合物を6mLの水で焼き付けます。200mLのジクロロメタンで反応混合物3倍を抽出し、水に200mLのクエン酸を200mL、200mLの水で2倍、飽和炭酸ナトリウム200mL、そして200mLのブラインをその順に洗浄します。無水硫酸ナトリウムの上に有機層を乾燥させ、真空下で揮発物をろ過し、蒸発させて粗生成物を得る。</li>
		<li>粗生成物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(5-30%酢酸エチル/ヘキサン)に供し、885mg化合物A9を生成する。</li>
	</ol></li>
	<li>JBNTモノマーの合成<ol>
<li>化合物A9(0.54g)の0.54gを94%トリフルオロ酢酸/チオアニソール溶液の10 mLに溶解し、室温で72時間攪拌します。</li>
		<li>反応混合物にジエチルエーテル(80 mL)を加え、遠心分離機を沈殿に加えます。上清を含む透明なトリフルオロ酢酸を注ぎ出し、ジエチルエーテルとメタノールで白色沈殿物を洗浄し、168.6 mgの粗JBNTモノマーを得る(補足ファイル1)。</li>
		<li>逆相カラムを用いて、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により粗JBNTモノマーを精製します。分離プログラムは以下にリストされています: 溶媒A:100%水;溶媒B:100%アセトニトリル;溶媒C:pH=1 HCl水溶液;流量:3 mL/分( 表1を参照)。</li>
		<li>約7.2分で最大のピークを収集します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. JBNT/FNの製造
<ol><li>80 μLの1 mg/mL JBNT水溶液を40 μLの1 mg/mL FN水溶液とピペットに数回加えます。</li>
	<li>約10sのピペット処理後の白色固体懸濁液の有無を確認してください。 メモ:NM(補足ファイル2)の自己組み立てプロセスをキャプチャするためのビデオが撮影されました。</li>
</ol>3. 凍結乾燥した標本の観察
注: このステップは JBNT および FN から作られた NM の足場構造を示すために実行されます。
<ol><li>凍結乾燥材料観察のためにFN、JBNTおよびFN/JBNT NMの解決を準備しなさい。100 μg/mL の FN を 40 μL の蒸留水で希釈し、FN の 20 μg/mL 溶液を作ります。</li>
	<li>1 mg/mL の JBNT の溶液を 1 mg/mL の 5 μL の DI 水 45 μL に希釈して調製します。</li>
	<li>100 μg/mL FN の 10 μL と 1 mg/mL の JBNT の 5 μL を 35 μL の DI 水に混ぜて NM 溶液を形成します。</li>
	<li>FN、JBNT溶液、NM溶液をそれぞれ備えた96ウェルクリアラウンドボトムマイクロプレートの3つのウェルをコーティングします。各ウェルは、50 μLの溶液を受け取ります。</li>
	<li>凍結乾燥を行い、後述するように、NMの足場構造を可視化する。<ol>
<li>プレートを-80°Cで一晩凍らせます。</li>
		<li>凍結乾燥した器具と真空ポンプをオンにします。</li>
		<li>クールダウンボタンを押して、システムの温度を-50°Cに下げます。</li>
		<li>凍結したプレートを凍結した器具に入れ、器具の開口部をすべて閉じます。</li>
		<li>開始ボタンをクリックして、システムの圧力を 0.9 mbar に減らします。</li>
		<li>4時間後、 気管内 ボタンを押してバルブを開き、大気圧に対するシステム圧力を高めます。</li>
		<li>凍結乾燥した器具からプレートを取り出します。</li>
		<li>顕微鏡を使用して、FN、JBNTおよび得られた自己組み立てNMを観察する。材料のためのカメラでいくつかの写真を撮ります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 吸収スペクトル測定
メモ: FN および JBNT のスペクトルの変更を使用して、自己組み立て型 JBNT/FN NM12を提示します。
<ol><li>30 μL の 100 μg/mL FN と 15 μL の蒸留水と 5 μL の 1 mg/mL JBNT を混合して、JBNT/FN NM 溶液を調製します。白色固体懸濁液は、溶液を数回ピペットした後に見ることができる。 注:溶液中のJBNTとFNの最終濃度はそれぞれ100 μg/mLおよび60 μg/mLです。NM溶液に使用されたものと同じ濃度のJBNTおよびFN溶液も、制御溶液として調製した。</li>
	<li>JBNTコントロール溶液を調製するために、45μLの蒸留水でJBNTの1mg/mLの5μLを希釈します。</li>
	<li>30 μLの100 μg/mL FNを20 μLの蒸留水で希釈し、FN制御溶液を調製します。</li>
	<li>分光光度計( 材料表を参照)を用いて、FN、JBNT、JBNT/FN NM溶液のUV-Vis吸収スペクトルを測定し、NMの組立を特徴付けます。<ol>
<li>[UV-Vis]ボタンをクリックします。分光光度計の試験面を洗浄し、2μLの蒸留水を滴下します。190-850 nm からブランクとして測定します。</li>
		<li>分光光度計の試験面を洗浄し、その上にFN溶液の2μLを落とします。190 nm から 850 nm までの FN 溶液の UV-Vis 吸収スペクトルを測定します。</li>
		<li>分光光度計の試験面を洗浄し、JBNT溶液の2μLを落とします。JBNT溶液の吸収スペクトルを190 nmから850 nmまで測定します。</li>
		<li>分光光度計の試験面を洗浄し、JBNT/FN NM溶液の2μLを落とします。JBNT/FN NM溶液の吸収スペクトルを190 nmから850 nmまで測定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 透過電子顕微鏡(TEM)用JBNT/FN NMの調製
<ol><li>基本的なプラズマクリーナーで負の染色の前にいくつかのグリッドを洗浄します( 材料表を参照)。</li>
	<li>2つの異なるプロセスに従って標本の陰性染色を行う。<ol>
<li>JBNTs水溶液の3mg/mLの3μLを、JBNT/FN NM溶液を3μLの分離されたグリッドに落とし、2分間放置します。その後、0.5%のウラニル酢酸(UA)溶液の100 μLで各グリッドをすすいでください。余分な溶液を濾紙で排出し、空気乾燥グリッド。</li>
		<li>JBNT/FN NM溶液の9 μLを3 μLの2.0%UA溶液と混合し、ピペットを数回混合します。グリッド上の混合溶液をピペットし、2分間グリッド上に保管します。フィルターペーパーを使用して、混合溶液をグリッドから取り除き、常温でグリッドを乾燥させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>最後に、ステップ5.2.1で染色されたJBNT/FN NM、およびTEMでステップ5.2.2で染色されたJBNT/FN NMの試料を特徴付ける。</li>
</ol>6. インビトロ生物学的機能アッセイ
<ol><li>200 μL の陰性制御(NC、PBS)、JBNT、FN、および JBNT/FN NM ソリューションを、それぞれ 8 ウェルチャンバー スライドの 1 つのウェルに追加します。</li>
	<li>凍結乾燥した8ウェルチャンバーカバーグラスを凍結乾燥させ、ウェルの底に材料をコーティングします。凍結乾燥のプロトコルは、ステップ 3.5 と同じです。</li>
	<li>その後、ウェル10,000個(パッセージ3)をウェルに加え、5%CO2で37°Cで24時間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、培養液をウェルからピペットアウトし、1xPBS溶液で培養液をリンスする。</li>
	<li>細胞を持つウェルに100 μLの固定液を加え、5分間放置します。細胞を1倍PBSで穏やかにリンスします。</li>
	<li>1%トリトン-X 100〜0.1%を希釈。0.1%トリトンX 100の100 μLを細胞と共に各ウェルに加え、10分間放置します。細胞を1倍PBSで穏やかにリンスします。</li>
	<li>ローダミンファロイジンを1.65μMに希釈し、ローダミンファロイジン100μLを細胞と共に各ウェルに加え、室温で光から30分間保つチャンバーカバーグラスをインキュベートします。細胞を1倍PBSで穏やかにリンスします。</li>
	<li>蛍光顕微鏡で細胞画像をキャプチャします。</li>
	<li>各グループの蛍光画像のセル数をカウントします。各ウェルの3つのランダムな領域を平均化することによって、細胞の接着密度を計算します。</li>
	<li>すべてのデータを平均±標準偏差(SD)として表示します。片裾t検定を使用して統計分析を実行し、続いてp<0.05を伴う分散分析(ANOVA)を実行します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference.">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li><li>Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+vitronectin+and+collagen+I+promotes+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).</li><li>Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+convergence+of+fracture+repair+and+stem+cells:+interplay+of+genes,+aging,+environmental+factors+and+disease.">The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).</li><li>De Becker, A., Riet, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+migration+of+mesenchymal+stromal+cells:+How+to+improve+the+efficacy+of+cell+therapy.">Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy.</a> World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).</li><li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone.">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li><li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments.">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li><li>Fenniri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+Rosette+Nanotubes:+Design,+Self-Assembly,+and+Characterization.">Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotube/hydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering.">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li><li>Van den Bogaerdt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+cross-linking+by+adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+and+scar-derived+mesenchymal+cells:+Are+mesenchymal+stromal+cells+involved+in+scar+formation.">Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+molecule+visualized+in+electron+microscopy:+a+long,+thin,+flexible+strand.">Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand.</a> Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).</li><li>Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U. S. Patent. , (2017).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+Anchorage.">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).</li><li>Jones, M., Leroux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+micelles+-+a+new+generation+of+colloidal+drug+carriers.">Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).</li><li>Singh, P., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+and+stem+cell+differentiation+-+lessons+from+chondrogenesis.">Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).</li><li>Martino, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+integrin+specificity+and+stem+cell+differentiation+in+2D+and+3D+environments+through+regulation+of+fibronectin+domain+stability.">Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability.</a> Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).</li><li>Somaiah, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+promotes+higher+adhesion,+survival+and+proliferation+of+mesenchymal+stem+cells.">Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells.</a> PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).</li><li>Ogura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow+and+enhancement+of+cell+attachment+by+fibronectin.">Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin.</a> Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).</li><li>Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Printing+of+scaffolds+for+tissue+regeneration+applications.">3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo.">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089 (2017).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells.">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo.">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li></ol>

ユペン・チェン博士は、NanoDeセラピューティクス社の共同創設者です。

本研究では、DNAに触発されたJBNTおよびFNで形成された自己組み立てバイオミメティックNMを開発した。JBNT溶液を調製する際には、JBNT凍結乾燥粉末は、PBSの代わりに水に溶解する必要があります。また、PBSの塩はNM繊維に束ね、画像の解像度を大幅に低下させることができるので、NMのナノフィブリル構造を観察したい場合は、NMも水中に組み立てる必要があります。
NMは、hMSCの接着と分化を促進するために使用された組織再生足場を作製するために多くの努力がなされているが、新しい組織工学足場として役立つ大きな可能性を示している。しかし、これらの材料のほとんどは、3Dプリント足場18、19などの特定の形状で事前に作られています。したがって、関節の奥深くにある負傷した部位に移植することは容易ではありません。しかし、ここでのNM溶液は液体として注入され、次いで細胞接着のための足場として役立つことができる。
1つの制限は、NMが機械的に強くならないということです。ポリマーとは異なり、非共有結合の自己集合によって製造されるため、機械的な荷重や張力に多くを耐えることができません。一方、非共有構造はまた、生物学的機能8,20,21に適した非常に良好な生分解性および生体適合性を示す。
注射可能なNMは、身体の骨折治癒を強化するためにMSCホーミングの標的位置および足場を提供する大きな可能性を示している。しかし、負傷部位に注入すると、非コバレントNMは長期間所定の位置にとどまらない可能性があり、治療効果を低下させる可能性がある。今後は、他の材料(ヒドロゲルなど)を組み込むか、NM構造を交互に使用してNMスキャフォールドの特性をさらに最適化することを検討します。

ヒト間葉系幹細胞(hMCs)は、異なる間葉系に沿った自己再生および自己分化の可能性を示しており、組織の再生および維持に役立つ1。分化ポテンシャルに基づいて、hMCCは間葉組織損傷および造血障害療法2の候補と考えられている。hMSCは、組織修復、血管新生、および炎症を軽減することによって創傷治癒を促進する能力を示した3。しかし、生化学的またはバイオマテリアルの援助がなければ、hMSCが目的の場所で標的組織に到達し、機能する効率は低い4である。様々な設計された足場が病変に付着するhMSCを引き付けるために利用されてきたが、成長板骨折のようないくつかの部位は、長い骨の真ん中に、不規則な形をした傷ついた部位に完全に適合しない可能性がある従来のプレハブ足場によって容易にアクセスできない。
ここでは、その場で自己集合し、標的領域に到達しにくい場所に注入できるバイオミメティックナノ材料を開発しました。注射用バイオ足場NMは、ヤヌスベースナノチューブ(JBNT)およびフィブロネクチン(FN)で構成されています。JBNTは、ロゼットナノチューブ(RNT)とも呼ばれ、DNA塩基対、具体的にはチミンとアデニン、ここでは5、6、7に由来する。図1に示すように、ナノチューブは、6分子の由来DNA塩基が水素結合を介して自己集合して平面6を形成する際に形成される。その後、6つの分子が、最大200〜300μmの強いパイスタッキング相互作用7を介して平面に積み重ねられます。JBNTsは、FNがコラーゲン繊維と反応するように形態学的にコラーゲン繊維を模倣するように設計されています。
FNは、高分子量粘着糖タンパク質であり、これは細胞外マトリックス(ECM)9に見られる。これらは、ECMの他の成分、特にコラーゲン10への幹細胞の付着を媒介することができる。我々は、FNが非共有結合を介して数秒でNMを形成するためにそれらに反応できるように、形態学的にコラーゲン繊維を模倣するようにJBNTを設計しました。したがって、NMは、従来製造された足場ではアクセスできなかった骨折部位に注入される有望なバイオ足場である。ここで、注射可能なNMは、生体外でhMSCのアンカレッジを増強する優れた能力を提示し、組織再生のための足場として役立つ可能性を発揮する。

<table><tbody><tr><td>1,2-dichloroethane</td><td>Alfa Aesar</td><td>39121</td><td></td></tr><tr><td>2-cyanoacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C88505</td><td></td></tr><tr><td>4-Dimethylaminopyridine</td><td>TCI America</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>8 wells Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>absolute ethanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>allylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>145831</td><td></td></tr><tr><td>Basic Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC32G</td><td></td></tr><tr><td>citric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>concentrated hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Deionized water</td><td>Thermo Fisher</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>dichloromethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Di-tert-butyl dicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>361941</td><td></td></tr><tr><td>ethyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319902</td><td></td></tr><tr><td>ethylcarbamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37814</td><td></td></tr><tr><td>guanidinium hydrochloride</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13543</td><td></td></tr><tr><td>hexanes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227064</td><td></td></tr><tr><td>Human mesenchymal stem cells</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>methyl iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17114</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>N-Methylmorpholine N-oxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>A19802</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>45385</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>phosphoryl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td></td></tr><tr><td>potassium carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>347825</td><td></td></tr><tr><td>reverse phase column</td><td>Thermo Fisher</td><td>25305-154630</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>silica gel</td><td>TCI America</td><td>S0821</td><td></td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>sodium ethoxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13083</td><td></td></tr><tr><td>sodium periodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>sodium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>sodium sulfite</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>sodium triacetoxyborohydride</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22060</td><td></td></tr><tr><td>spectrophotometer(NanoDrop One/One&lt;sup&gt;c&lt;/sup&gt; UV-Vis)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stem Cell Growth Medium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>thioanisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T28002</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>triethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12646</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion

バイオミメティックNMは、幹細胞の停泊を高めることができる組織工学的な生物学的足場として機能するように開発されました。バイオミメティックNMは、水溶液中の自己集合体を介してJBNTおよびFNから形成される。JBNTは、内部疎水性中空チャネルおよび外親水性表面で200〜300 μmの長さを測定します。JBNT は正に充電され、FN は負の電荷を受けます。したがって、中性水溶液に注入すると、非共価結合を介して結合してNMバンドルを形成する。自己組立プロセスは、化学イニシエーター、熱源、またはUV光なしで数秒以内に完了します。NM溶液のpHがFNの等電点(pI 5.5-6.0)より低い場合、正に帯電したFNが存在するため、NMバンドルは自己放出します。
NMは、形態学的に細胞外マトリックス(ECM)を模倣することが知られており、したがって、注入スキャフォールドとして使用することができ、これはhMSC接着を強化するための優れたプラットフォームを提供する。細胞密度解析および蛍光イメージング実験は、NMsが陰性対照と比較してhMSCのアンカレッジを有意に増加させたことを示した。

我々の研究は、JBNTsとFNのNMの形成が速く、10秒で起こったことを発見した。 図2に示すように、JBNT溶液をFN溶液と混合し、数回配管した際に白い凝集が得られた。NMの形成プロセスは完全にバイオミメティックである。外部刺激は必要ありません。製造のプロセスは、13を架橋するための紫外線または化学開始剤に基づいているいくつかの新興バイオマテリアルのそれよりもはるかに簡単です。
FN、JBNT、NMのカメラ画像を撮影・解析しました(図3)。FN群については、短い白色の斑点を除いて、長繊維は認められなかった。短いクラスターはFNからなるタンパク質凝集であり、これはJBNTなしでは足場構造がFN単独では形成できないことを示している(図3A)。図3Bに示すように、長い繊維と細い繊維はJBNTsの存在を示す。NMの白鎖の幅はJBNTと比較して広く、JBNTとFNが互いに架橋してNMを形成していることを示している。NMファイバーは、数センチメートルの長さに成長することができます(図3C)。
JBNTとFNの間のアセンブリを示すUV-Visスペクトルを得た。 図4に示すように、JBNTsは、それぞれ220nmおよび280nmで2つの吸収ピークを示す。JBNTと比較して、JBNT/FN NMは、JBNTsからであったが、その間に非共有自己集合JBNTとFNの影響を受けた有意に減少した値を有する同じ場所で2つの吸収ピークを有する。
TEMは、JBNTおよびNMの形態を特徴付けるために使用された。 図5Aに示すように、JBNTは均一な直径の細い管である。中立的な条件下では、JBNTは正に充電され、FNは負の帯電を行います。混合すると、電荷相互作用を介して長い筋腫NMを形成した(図5B)。pHがFNの等電点(5.5-6.0のpI)よりも低い場合、NMバンドルは正に帯電したFNによる自己放出を示す。 図5Cに示すように、低pH(4.0)の溶液中に保存すると、NMは崩壊し、多くのFNがNMから放出された。ナノチューブと一緒に配布されたFNは、NMがJBNTとFN10によって製造されたという強力な証拠でもあります。
細胞接着に対するJBNT/FN NMの効果を検討した。図6に示すように、NM群の細胞接着密度は、負の対照と比較して有意な差(p値<0.05)値を示した。違いは、NMが形態学的にECMを模倣するように設計されているためであり、これは細胞接着14のための足場を提供する。ECMは、フィブロネクチン15などのコラーゲンおよび細胞接着糖タンパク質から構成された。コラーゲンは、hMSCs16の高い接着および増殖を促進する能力を有する。さらに、フィブロネクチンは、同様に15の負傷部位におけるhMSCの接着性を高めることが示されている。蛍光イメージングはまた、NM群のhMSC付着が陰性対照群(図7)15,17と比較して有意に増加することを示した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig01.jpg"> 図1:リジン側鎖を持つJBNTの階層自己集合の概略図。 この図は、前の出版物12からの許可を得て再印刷されます。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig02.jpg"> 図2:NMの自己組み立てプロセスのデモンストレーション。 (A) FNソリューション。(B) JBNTs と FN を混合する。この図は、前の出版物12からの許可を得て再印刷されます。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig03.jpg"> 図3:ブライトフィールド写真 JBNTsとFNによって形成された(A)FN(B)JBNTおよび(C)NMの明視野写真。各エリアの直径は2cmです。この図は、前の出版物12からの許可を得て再印刷されます。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig04.jpg"> 図4:FN、JBNT、およびJBNT/FN NMの吸収スペクトル。 この図は、前の文書12から再印刷されます。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig05.jpg"> 図 5: TEM イメージ。 TEM画像 ( A ) JBNT (B) JBNT/FN NM、 および (C) は JBNT/FN NM をリリースしました。この図は、前の出版物12からの許可を得て再印刷されます。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig06.jpg"> 図6:細胞接着の統計解析 細胞接着密度を本実験で記録した。*p<0.01 と負のコントロール**p<0.05 JBNT単独と比較した。N=3。この図は、前の出版物12からの許可を得て再印刷されます。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61317/61317fig07.jpg"> 図7:蛍光画像 HMSCと(B)の蛍光画像は、JBNTsと共にインキュベートされたhMSCを有する(C)、hMSCをFNと共にインキュベートした(D)HMSCをJBNT/FN NMと共にインキュベートした。スケールバー:100 μm。この図は、前の出版物12からの許可を得て再印刷されます。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>時間</td>
			<td>A%</td>
			<td>B%</td>
			<td>C%</td>
		</tr>
<tr>
<td>0.00分</td>
			<td>98</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>15.00分</td>
			<td>68</td>
			<td>30</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>25.00分</td>
			<td>8</td>
			<td>90</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>26.00分</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:勾配溶出時間
補足ファイル1:JBNTモノマーの合成のためのスキーム。<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/61317supfig01.jpg" target="_blank">こちらをダウンロードしてください。</a>
補足ファイル 2: FN/JBNT NM の自己組み立て用ビデオ。<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61317/Supplemental_File_2.mp4" target="_blank">こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。</a>

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Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

このプロトコルの目的は、ヤヌスベースナノチューブ(JBNT)とフィブロネクチン(FN)を用いたバイオミメティックナノマトリックス(NM)の組み立てを示すものです。ヒト間葉系幹細胞(hMCs)と共培養すると、hMSCの接着を促す優れた生理活性を示します。

ヤヌスベースナノチューブと幹細胞接着のためのフィブロネクチンによるバイオミメティックナノマトリックスの製造

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K ビュー.  University of Connecticut. このプロトコルの目的は、ヤヌスベースナノチューブ(JBNT)とフィブロネクチン(FN)を用いたバイオミメティックナノマトリックス(NM)の組み立てを示すものです。ヒト間葉系幹細胞(hMCs)と共培養すると、hMSCの接着を促す優れた生理活性を示します。

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Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

幹細胞培養アプリケーションのための3Dフィブリン足場の調製

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

生物工学

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

心臓組織工学のためのキャピラリーフォースリソグラフィ

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber diameter, composition and organization. In addition to providing structural support, the physical and chemical properties of the ECM play an important role in multiple cellular processes including adhesion, differentiation, and apoptosis. In vivo, the ECM is assembled by exposing cryptic self-assembly (fibrillogenesis) sites within proteins. This process varies for different proteins, but fibronectin (FN) fibrillogenesis is well-characterized and serves as a model system for cell-mediated ECM assembly. Specifically, cells use integrin receptors on the cell membrane to bind FN dimers and actomyosin-generated contractile forces to unfold and expose binding sites for assembly into insoluble fibers. This receptor-mediated process enables cells to assemble and organize the ECM from the cellular to tissue scales. Here, we present a method termed surface-initiated assembly (SIA), which recapitulates cell-mediated matrix assembly using protein-surface interactions to unfold ECM proteins and assemble them into insoluble fibers. First, ECM proteins are adsorbed onto a hydrophobic polydimethylsiloxane (PDMS) surface where they partially denature (unfold) and expose cryptic binding domains. The unfolded proteins are then transferred in well-defined micro- and nanopatterns through microcontact printing onto a thermally responsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) surface. Thermally-triggered dissolution of the PIPAAm leads to final assembly and release of insoluble ECM protein nanofibers and nanostructures with well-defined geometries. Complex architectures are possible by engineering defined patterns on the PDMS stamps used for microcontact printing. In addition to FN, the SIA process can be used with laminin, fibrinogen and collagens type I and IV to create multi-component ECM nanostructures. Thus, SIA can be used to engineer ECM protein-based materials with precise control over the protein composition, fiber geometry and scaffold architecture in order to recapitulate the structure and composition of the ECM in vivo.

A method to obtain nanofibers and complex nanostructures from single or multiple extracellular matrix proteins is described. This method uses protein-surface interactions to create free-standing protein-based materials with tunable composition and architecture for use in a variety of tissue engineering and biotechnology applications.

表面開始アセンブリの使用ECMタンパク質のナノファイバーおよびナノ構造エンジニア

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

繊維組織における階調の電界紡糸ナノファイバー足場

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

細胞の挙動のNanotopographical変調のステッチ法を用いたナノパターン基板を拡大

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations having a major effect. Here we present a method to obtain large-scale uneven nanopatterns of arginine-glycine-aspartic acid (RGD)-functionalized dendrimers that permit the nanoscale control of local RGD surface density. Nanopatterns are formed by surface adsorption of dendrimers from solutions at different initial concentrations and are characterized by water contact angle (CA), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), and scanning probe microscopy techniques such as scanning tunneling microscopy (STM) and atomic force microscopy (AFM). The local surface density of RGD is measured using AFM images by means of probability contour maps of minimum interparticle distances and then correlated with cell adhesion response and differentiation. The nanopatterning method presented here is a simple procedure that can be scaled up in a straightforward manner to large surface areas. It is thus fully compatible with cell culture protocols and can be applied to other ligands that exert concentration-dependent effects on cells.

A method to obtain dendrimer-based uneven nanopatterns that permit the nanoscale control of local arginine-glycine-aspartic acid (RGD) surface density is described and applied for the study of cell adhesion and chondrogenic differentiation.

ローカル制御表面密着性にデンドリマーを用いた不均一な Nanopatterns: 軟骨細胞分化を指示する方法

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュ リング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

熱ナノイン プリント技術とヒトの内皮細胞コロニー形成細胞の応答のスクリーニングによるグラデーションによるナノパターンの作製

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo uses. The addition of growth factors into these biomaterial scaffolds is generally done to provide an optimal cell culture environment, mediating cell differentiation and its subsequent functions. However, the growth factors in a conventional biomaterial scaffold are typically designed to be released upon implantation, which could result in unintended side effects on surrounding tissue or cells. Here, the DNA-inspired Janus base nano-matrix (JBNm) has successfully achieved a highly localized microenvironment with a layer-by-layer structure for self-sustainable cartilage tissue constructs. JBNms are self-assembled from Janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3, and transforming growth factor beta-1 (TGF-&#946;1) via bioaffinity. The JBNm was assembled at a TGF-&#946;1:matrilin-3:JBNt ratio of 1:4:10, as this has been the determined ratio at which proper assembly into the layer-by-layer structure could occur. First, the TGF-&#946;1 solution was added to the matrilin-3 solution. Then, this mixture was pipetted several times to ensure sufficient homogeneity before the addition of the JBNt solution. This formed the layer-by-layer JBNm, after pipetting several times again. A variety of experiments were performed to characterize the layer-by-layer JBNm structure, JBNts alone, matrilin-3 alone, and TGF-&#946;1 alone. The formation of JBNm was studied with UV-Vis absorption spectra, and the structure of the JBNm was observed with transmission electron microscopy (TEM). As the innovative layer-by-layer JBNm scaffold is formed on a molecular scale, the fluorescent dye-labeled JBNm could be observed. The TGF-&#946;1 is confined within the inner layer of the injectable JBNm, which can prevent the release of growth factors to surrounding areas, promote localized chondrogenesis, and promote an anti-hypertrophic microenvironment.

This protocol describes the assembly of a layer-by-layer Janus base nano-matrix (JBNm) scaffold by adding Janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3, and Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-&#946;1) sequentially. The JBNm was fabricated and characterized; additionally, it displayed excellent bioactivity, encouraging cell functions such as adhesion, proliferation, and differentiation.

軟骨再生を促進するための層ごとのヤヌスベースナノマトリックスの作製とキャラクタリゼーション

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo ...

Fabricating Engineered Nanofibrillar Collagen with Directed Patterning

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are designed to emulate the biophysical properties of native tissue, providing cellular phenotypic and morphological guidance that contributes to the restoration of the regenerative tissue niche. Collagen, a prevalent extracellular matrix protein, is a common component of these regenerative biomaterials due to its biocompatibility and other favorable properties. The current study describes a novel and straightforward method for the fabrication of engineered nanofibrillar collagen with directed fibril patterning. Through the manipulation of shear stress, temperature, and pH, collagen fibrillogenesis and alignment are precisely controlled without requiring specialized equipment. This approach allows for the creation of nanofibrillar collagen biomaterials that mimic the native structure of tissues exhibiting either anisotropic or isotropic characteristics. The flexibility in collagen nanofibril patterning not only facilitates the study of nanoscale patterning on cell behavior but also offers diverse possibilities for patterned tissue engineering applications.

The following protocol presents a shear-based extrusion method for the fabrication of collagen hydrogels with nanoscale patterned fibrils, which can be applied to a broad range of tissue engineering applications.

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are ...

ヤヌスベースナノチューブと幹細胞接着のためのフィブロネクチンによるバイオミメティックナノマトリックスの製造

要約

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この動画の章

幹細胞培養アプリケーションのための3Dフィブリン足場の調製

心臓組織工学のためのキャピラリーフォースリソグラフィ

表面開始アセンブリの使用ECMタンパク質のナノファイバーおよびナノ構造エンジニア

繊維組織における階調の電界紡糸ナノファイバー足場

細胞の挙動のNanotopographical変調のステッチ法を用いたナノパターン基板を拡大

ローカル制御表面密着性にデンドリマーを用いた不均一な Nanopatterns: 軟骨細胞分化を指示する方法

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュリング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

熱ナノインプリント技術とヒトの内皮細胞コロニー形成細胞の応答のスクリーニングによるグラデーションによるナノパターンの作製

軟骨再生を促進するための層ごとのヤヌスベースナノマトリックスの作製とキャラクタリゼーション

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

ヤヌスベースナノチューブと幹細胞接着のためのフィブロネクチンによるバイオミメティックナノマトリックスの製造

要約

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幹細胞培養アプリケーションのための3Dフィブリン足場の調製

心臓組織工学のためのキャピラリーフォースリソグラフィ

表面開始アセンブリの使用ECMタンパク質のナノファイバーおよびナノ構造エンジニア

繊維組織における階調の電界紡糸ナノファイバー足場

細胞の挙動のNanotopographical変調のステッチ法を用いたナノパターン基板を拡大

ローカル制御表面密着性にデンドリマーを用いた不均一な Nanopatterns: 軟骨細胞分化を指示する方法

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュ リング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

熱ナノイン プリント技術とヒトの内皮細胞コロニー形成細胞の応答のスクリーニングによるグラデーションによるナノパターンの作製

軟骨再生を促進するための層ごとのヤヌスベースナノマトリックスの作製とキャラクタリゼーション

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

細胞播種用カスタム Agarose 井戸とティッシュリング自己組織型の 3 D プリントを使用しての作製

熱ナノインプリント技術とヒトの内皮細胞コロニー形成細胞の応答のスクリーニングによるグラデーションによるナノパターンの作製