Este protocolo permite avaliar possíveis alterações morfológicas em neurônios e colunas dendríticas que podem sublinhar anormalidades neuroquímicas e comportamentais. É único e útil para visualizar neurônios em diferentes regiões cerebrais em ratos, o que, em combinação com sofisticados softwares de reconstrução, permite aos pesquisadores elucidar os possíveis mecanismos subjacentes à disfunção neurocognitiva. Comece preparando a solução PVP de acordo com as instruções do manuscrito.
Encha a tubulação com PVP e deixe-a por 20 minutos. E expulsá-lo pela outra extremidade com uma seringa de 10 mililitros. Combine 170 miligramas de contas de microcarrier de tungstênio com 250 microliters de cloreto de metileno.
Em seguida, completamente vórtice a suspensão. Em seguida, adicione 6 miligramas de dilc18 lipofílico(3)corante a 300 microliters de cloreto de metileno e vórtice. Pipet 250 microliters da suspensão do tungstênio em uma lâmina de vidro.
Aguarde a suspensão para secar o ar e adicione 300 microliters da solução de corante. Uma vez seco, use uma navalha para dividir a mistura em dois tubos de centrífugas de 1,5 mililitro e encha os tubos com água. Sonicar a mistura em um banho de água até ficar homogêneo.
Certificando-se de que a ponta do sonicator está diretamente nos tubos. Misture as duas misturas em um tubo cônico de 15 mililitros. E sonicate por mais três minutos, certificando-se de que não restam grandes moitas de contas revestidas de corante.
Após a sônicação, desenhe a mistura na tubulação revestida PVP com uma seringa de 10 mililitros. E alimente a tubulação na estação de preparação. Gire a tubulação por um minuto.
Remova cuidadosamente toda a água usando uma seringa. Ligue o gás nitrogênio e ajuste o fluxo de nitrogênio para aproximadamente 0,5 litros por minuto. Gire a tubulação na estação de preparação e seque-a com nitrogênio por 30 minutos.
Retire a tubulação da estação e corte-a em segmentos de 13 milímetros com um cortador de tubulação. Certifique-se de que o rato não está respondendo a estímulos nocivos e os reflexos estão ausentes. Em seguida, fixá-lo na posição supina.
Faça uma incisão ao longo da linha média torácica. Separe o diafragma e abra o peito com uma tesoura. Em seguida, insira uma agulha de calibre 20 de 25 milímetros no ventrículo esquerdo.
Corte imediatamente o átrio direito com uma tesoura e perfunda 15 mililitros de PBS de 100 mililitros com uma taxa de fluxo de 5 milímetros por minuto. Em seguida, perfuse 100 mililitros de 4%PFA tamponado em PBS. Após a perfusão, remova todo o cérebro de rato.
E postfixá-lo com 4%PFA por 10 minutos. Use uma matriz cerebral de rato para cortar 500 micrômetros de espessura seção coronal. Faça um corte de punho e mantenha a lâmina no lugar.
Em seguida, faça um segundo corte com uma segunda lâmina e remova verticalmente a primeira lâmina, mantendo o tecido na superfície da lâmina. Coloque as fatias cerebrais na placa de 24 poços com 1 mililitro de PBS em cada poço. E repita o processo até que todas as fatias tenham sido cortadas.
Remova o PBS de cada alvo bem. Carregue a cartilagem com um pedaço de tubo de dil/tungstênio e coloque-a no aplicador. Coloque um pedaço de papel filtro entre as duas telas de malha.
E conecte o aplicador à mangueira de hélio. Em seguida, ajuste a pressão de saída do hélio para 90 libras por polegada quadrada. Coloque o aplicador verticalmente no centro do poço direcionado de 1,5 centímetros entre a amostra e a tela de malha.
Em seguida, dispare o tubo dil/tungstênio. Carregue a cartilagem com o tubo seguinte e atire continuamente as contas da tubulação nas fatias restantes. Encha a placa de 24 poços com PBS de 100 mililitros.
E lave as fatias três vezes com 500 microliters de PBS fresco. Certifique-se de que as fatias não se virem durante a lavagem. Quando terminar, adicione 500 microliters de PBS fresco às fatias.
E incuba-los por três horas a quatro graus Celsius no escuro. Após a incubação, use um pincel fino para transferir as fatias cerebrais para lâminas de vidro. E adicione imediatamente um mililitro de meio de montagem antifade a cada seção.
Coloque uma cobertura de 22 por 15 milímetros sobre as seções e seque as lâminas no escuro. Ligue o sistema de microscópio confocal e mude para um objetivo de 60X. Ajuste as configurações de imagem de acordo com as instruções do manuscrito.
E obter imagens de pilha Z para o tipo de neurônio alvo com base nos limites da região cerebral e características morfológicas dos neurônios. Isole o neurônio cortical primário dos ratos F344/N no primeiro dia pós-natal e cultue-os em um prato de fundo de vidro de 35 milímetros por uma semana. Refrescar metade do meio no terceiro dia após o isolamento.
Lave o prato duas vezes com 1 mililitro de 100 mililitros PBS. E conserte as células com 4% de PFA por 15 minutos em temperatura ambiente. Rotular balísticamente as células como descrito anteriormente.
E lave-os mais três vezes com 1 mililitro de PBS. Adicione 500 microliters de PBS às células e incuba-os por três horas a quatro graus Celsius no escuro. Em seguida, adicione 200 microliters de meio de montagem antifade.
E obter imagens de pilha Z para cada neurônio alvo. Neurônios típicos do hipódromo na região hipocampal nas seções cerebrais de ratos foram identificados com tecnologia de rotulagem balística caracterizada por um grande dendrito apical e vários dendritos basais menores ao redor da soma. O software de análise quantitativa de reconstrução neuronal foi utilizado para rastrear ramos dendríticos e detectar colunas.
Posteriormente, o software foi utilizado para avaliar a complexidade dendrítica da ramificação e a complexidade da arbórea neuronal. Alterações morfológicas nas espinhas dendríticas foram avaliadas utilizando-se comprimento, volume e diâmetro da cabeça. Em seguida, as espinhas foram classificadas em espinhos finos, stubby e cogumelos.
E a frequência relativa do número de espinhos entre cada raio foi examinada. Além disso, a técnica de rotulagem balística foi validada em um neurônio piramim primário na cultura celular. Neurônios piramidais foram identificados com base na forma do triângulo da soma e grande dendrite apical.
Em seguida, foi utilizado um software de reconstrução neuronal para analisar a distribuição de espinhos dendráticos finos e comprimento da coluna dendrítica. Ao tentar este protocolo, é importante evitar grandes aglomerados ou aglomerados de contas de tungstênio revestidas de corante balístico iniciando a preparação. Aglomerados não permitiriam que neurônios individuais fossem distinguidos.
Combinado com o software de reconstrução neuronal, este método nos permite examinar a morfologia da coluna neuronal e dendrítica em neurônios piramifetais hipocampais. O software de reconstrução neuronal utiliza um algoritmo para oferecer classificação assistida automática de espinhas dendríticas. A quantificação de múltiplos parâmetros neuronais oferece uma oportunidade para entender melhor o mecanismo subjacente à disfunção cognitiva neuronal.
