이 프로토콜은 형광 현미경 검사를 사용하여 살아있는, 그대로 조직의 맥락에서 세포 분열의 메커니즘을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포의 토착 생리 환경이 보존되는 동시에 오랜 과정을 통해 실시간 이미징을 허용한다는 것입니다. 이 기술의 가장 중요한 부분은 해부 또는 장착 중에 고환이 손상되지 않도록 하는 것입니다.
이것은 약간의 시간과 연습으로 획득 한 기술입니다. 이 방법의 시각적 데모는 고환을 식별하고 격리하는 방법과 조직을 손상시키지 않고 이미징을 위해 장착하는 방법을 보여 주므로 중요합니다. 원고에 설명된 대로 동물, 도구 및 미디어를 준비합니다.
해부를 시작하기 전에 미디어 충전 필터 주사기를 사용하여 유리 슬라이드의 상단, 중간 및 하단에 있는 50마이크로리터마다 3방울의 미디어를 배출합니다. 해부 프로브를 사용하여 5-10세 인스타 애벌레 또는 초기 강아지를 슬라이드에서 미디어 상단 으로 옮기십시오. 해부 프로브로 애벌레와 강아지를 부드럽게 교반하여 음식이나 이물질을 제거합니다.
해부 프로브를 사용하여 단일 애벌레 또는 강아지를 옆으로 돌립니다. 신체의 후방 세 번째에 반투명 타원형 구조로 나타나는 두 가지 양자 고환을 찾습니다. 고환이 부족한 동물은 여성이며 버려야합니다.
남성 애벌레 또는 강아지가 발견되고 깨끗할 때, 미디어의 두 번째 방울로 이동합니다. 3~4개의 수컷 애벌레 또는 푸파가 두 번째 미디어 드롭으로 옮겨질 때까지 반복한다. 그런 다음 미디어의 두 번째 드롭에서 작업, 그 중간 지역에서 집게의 쌍으로 하나의 동물을 잡아, 단지 고환에 전방.
두 번째 집게를 사용하여 동물을 반으로 부드럽게 찢습니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 동물의 뒤쪽 끝을 유리 슬라이드에 누십시오. 집게 바로 옆에서 시작하여 메스 가장자리를 사용하여 큐티클을 누른다.
메스를 동물의 절단 끝으로 이동합니다. 이것은 창 자, 뚱뚱한 바디 및 고환을 포함하는 동물의 내부 기관을 추방할 것입니다. 고환은 무색및 지방 체의 리본에 내장된 거의 투명한 타원형 기관입니다.
나머지 장기에서 고환을 부드럽게 따로 떼어냅니다. 고환을 한 번에 하나씩 옮기려면, 지방 체 아래에 메스의 가장자리를 삽입하고, 미디어에서 조직을 들어 올리고, 신속하게 세 번째 드롭으로 이동합니다. 아직 고환에 부착된 지방체가 충분하지 않으면 메스로 조직을 들어 올릴 수 있는 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 해부 배지로 미리 습식된 유리 파스퇴르 파이펫을 사용한다.
매체의 세 번째 드롭에서 작업, 부드럽게 고환에서 여분의 지방 몸을 슬라이스 메스의 날카로운 끝을 사용하여, 가장자리 주위에 지방 몸의 단지 작은 테두리를 떠나. 먼저 필터 주사기를 사용하여 슈나이더의 배지 한 방울을 약 30마이크로리터를 50mm 가스 투과성 배양 접시의 중앙에 증정합니다. 메스 도구 또는 미리 습식 된 파스퇴르 파이펫을 사용하여 준비 된 고환 의 최대 5 개까지 접시에 드롭합니다.
다음으로 메스 도구를 사용하여 고환을 가스 투과성 멤브레인에 부드럽게 밀어 넣고 중간 낙하의 중심으로 밀어 넣습니다. 1 밀리리터 주사기를 사용하여 중간 크기의 낙하를 둘러싼 가스 투과성 멤브레인에 할로카본 오일 4방울을 놓습니다. 방울의 위치는 22밀리미터 클래스 커버슬립의 네 모서리에 해당해야 합니다.
그런 다음 22mm 유리 커버슬립의 모서리를 할로카본 오일 4방울과 정렬하고 커버슬립을 미디어와 오일에 부드럽게 낮춥춥시게 합니다. 커버슬립이 정착하도록 허용하고, 고환을 포함하는 매체의 경우 오일 방울 사이에 확산을 허용합니다. 배양 접시를 해부 현미경 아래에 놓습니다.
과도한 용지를 제거하려면 커버슬립 아래에 섬세한 작업 지우기의 모서리를 삽입합니다. 유리 커버슬립을 위한 충분한 매체를 멀리 하여 가장 큰 고환표면과 접촉할 수 있습니다. 너무 많은 미디어를 제거하고 커버 슬립을 너무 멀리 낮추지 마십시오.
이것은 고환에 압력을 가하고 파열하는 원인이 될 수 있습니다. 마지막으로, 고환 바로 위에 유리 커버슬립에 침지 오일 한 방울을 놓습니다. 접시를 뒤집어 현미경 단계에 놓습니다.
40 또는 60 X 현미경 목표를 고환 바로 아래에 때까지 오일로 이동합니다. 전송된 빛을 사용하여 단일 고환을 찾아 초점으로 가져옵니다. PBSTx에 8%의 파라포름알데히드의 0.5 밀리리터를 9개의 잘 해부하는 요리 중 한 곳에 놓습니다.
유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 고환 의 10개까지 우물로 옮기. 고환이 우물 바닥에 누워 있는지 확인합니다. 20 분 후, PBSTx의 0.5 밀리리터를 포함하는 우물로 고환을 전송합니다.
5분간 부드럽게 교반하여 고환을 씻으십시오. 신선한 PBSTx로 새로운 우물에서 두 번 더 세척하십시오. 원고에 설명된 바와 같이 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에서 1 차 항체의 희석을 준비한다.
그런 다음 9 개의 잘 유리 해부 접시에서 튜브로 고환을 옮김시합니다. 부드러운 흔들거나 견과류와 함께 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 튜브를 배양하십시오. 이차 항체로 고환을 염색하는 절차는 유사하다.
자세한 내용은 원고를 참조하십시오. 먼저 파스퇴르 파이펫을 사용하여 9개의 웰 플레이트에서 유리 현미경 슬라이드로 고환을 옮김합니다. 필요한 경우 메스 가장자리를 사용하여 고환을 슬라이드 표면으로 밀어 넣습니다.
다음으로, 섬세한 작업 닦기의 모서리를 사용하여 고환에서 여분의 액체를 심지하십시오. 가능한 한 많은 액체를 제거하십시오. 그런 다음 고환에 미세 크기 장착 매체의 30~ 50 마이크로리터 드롭을 적용한다.
마지막으로, 22mm 커버슬립을 장착 매체의 드롭에 놓습니다. 커버슬립이 정착하도록 하고 장착 매체가 커버슬립 아래에 퍼질 수 있습니다. 필요한 경우 커버슬립에 부드러운 압력을 가하여 과도한 장착 매체를 짜내고 커버슬립이 고환 표면에 놓일 수 있도록 하십시오.
이 프로토콜이 성공적으로 실행되면 고환의 셀룰러 조직이 보존되고, 고환의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝으로 세포 분화의 진행이 표시됩니다. 심마세포는 meiosis를 시작하기 위하여 대략 및 메타Phase에 있는 그 확인될 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 준비된 고환에서, 살아있는 화상 진찰 분석은 정자 세포를 분할에 있는 폐장 망상 및 마이크로 tubules의 동적 재구성을 보여줍니다.
프로토콜에 설명된 바와 같이, 고환이 파열되는 압력을 가하지 않도록 주의를 기울여야 합니다. 정자 세포의 낭종은 파열 된 고환에서 급속히 흐르고, 라이브 타임 경과 이미징을 어렵게 만듭니다. 이 프로토콜은 살아있는, 그대로 조직에 있는 정자를 나누는 화상 진찰에 최적화됩니다.
따라서 해부 또는 장착 중에 고환이 손상되지 않는 것이 필수적입니다. 우리의 방법은 또한 세포 분열을 통제하는 동적 세포 프로세스에 새로운 통찰력을 제공하는 구조화된 조명 현미경 검사법과 같은 초해상도 화상 진찰 기술에 적합해야 합니다.
