Mais de um milhão de uniformes das gotículas são produzidos no substrato do tamanho do dedo. E moléculas de DNA simples são distribuídas aleatoriamente em cada gota. O rendimento da proteína é proporcional ao número de moléculas em uma gotícula.
Nossa técnica pode ser usada para uma medição rápida e quantitativa da atividade enzimática sem expressão e purificação de proteínas complicadas. Para começar, coloque um copo de tampa em um rack de coloração e coloque o rack em oito hidróxido de sódio molar. Sonicar o vidro de cobertura e o rack de coloração por 15 minutos em temperatura ambiente.
Remova o rack de coloração do hidróxido de sódio e enxágue o vidro da tampa com água 10 vezes. Seque o vidro da tampa com uma arma de ar. Em seguida, asse e seque o copo de cobertura em uma placa quente a 200 graus Celsius por cinco minutos.
Prepare solução de 0,05% aminosilano. Mergulhe o vidro de cobertura nesta solução e incuba-o por uma hora em temperatura ambiente. Enxágüe o vidro da tampa cinco vezes em água pura.
Em seguida, seque o vidro da tampa usando uma arma de ar. Asse na placa quente a 80 graus Celsius por cinco minutos. Coloque o substrato de vidro de cobertura em um mandril de vácuo personalizado para o revestimento de spin.
Dispense de 70 a 90 microliters de polímero CYTOP tipo A no centro do substrato de vidro. Em seguida, imediatamente gire o polímero. O revestimento inicial do polímero danifica a qualidade da matriz de microcâmara final.
Distribua o polímero no centro do vidro de cobertura sem introduzir bolhas de ar. Pegue o vidro revestido segurando-o nas esquinas e coloque-o em uma folha de alumínio. Asse por 30 minutos a 80 graus Celsius e depois por mais uma hora a 200 graus Celsius.
Dispense 0,2 a 0,3 mililitros de fotoresist no centro do substrato. Imediatamente gire o fotoresist a 6.000 rpm por 60 segundos. Use uma limpeza encharcada de etanol para remover o excesso de fotoresistia das bordas do substrato.
Asse o substrato a 110 graus Celsius por cinco minutos. Para reidratar o fotoresist, deixe o substrato ficar por 30 minutos a uma umidade relativa de 42 a 60% Carregue o substrato no alinhador da máscara e exponha-o por 25 segundos em um modo de contato a vácuo. Em seguida, mergulhe o substrato no desenvolvedor por cinco minutos para dissolver o fotoresist exposto.
Enxágüe o substrato 10 vezes usando água pura. Em seguida, seque o substrato completamente usando a pistola de ar. Coloque o substrato na câmara de reação da máquina de gravura de íons reativos e etch o fotoresist coberto CYTOP com o plasma de oxigênio.
Após a gravação, remova o fotoresist restante sonicando o substrato em acetona por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, sonicar o substrato em propanol por cinco minutos. Enxágüe, sonicato e enxágue o substrato novamente usando água pura como descrito no manuscrito.
Em seguida, seque o substrato com uma arma de ar. Usando um cortador de desktop, corte fita de filme Kapton de revestimento duplo nas formas de microcanal definidas. Coloque os pedaços de fita cortadas no fundo de uma placa de Petri plana para servir como mestre para a moldagem do PDMS.
Despeje a mistura PDMS na placa petri com padrão de fita. Em seguida, coloque a placa de Petri em uma mini câmara de vácuo e desaerar a mistura PDMS por uma a três horas. Em seguida, coloque a placa de Petri em um forno a 60 graus Celsius e deixe-a durante a noite para curar o PDMS.
Depois que o PDMS tiver curado, descasque o elastômero curado da placa de Petri e use um cortador de cabo plano para cortar os blocos microcanais PDMS. Em seguida, faça um buraco em cada extremidade de cada microcanal. O substrato previamente preparado terá uma área para a matriz de microcâmaras.
Posicione o microcanal PDMS nesta parte do substrato. Em seguida, insira uma ponta de tubulação de 200 microliter em um dos orifícios do microcanal PDMS. Primeiro, prepare a solução de reação CFPS em um tubo PCR.
Em seguida, usando uma ponta de tubulação não filtrante de 200 microliteres, elasve 10 microliters da solução. Insira a ponta da tubulação no orifício de entrada do microcanal PDMS e empurre para baixo no êmbolo da tubulação até que a solução transborde da saída do microcanal. Transfira o dispositivo FemDA para um bloco de alumínio pré-refrigerado.
Confirme se a área de matriz de microcâmara passa rapidamente de translúcida para transparente. Desenhe 300 microliters de óleo de descarga pré-refrigerado e transfira imediatamente o óleo para a ponta tubulata do orifício de entrada do microcanal. O óleo de descarga se move para o microcanal e extrude a solução de reação em excesso localizada fora dos microchambers.
Remova simultaneamente as duas pontas de tubulação inseridas do dispositivo. Mova imediatamente o dispositivo do bloco de alumínio para o filme de parafina. Insira a ponta de tubulação preparada contendo o óleo de vedação na entrada do microcanal PDMS e injete o óleo até que ele transborde da tomada.
As gotículas femtoliter são seladas em microchambers individuais pelo óleo. Abra a imagem BF desfocada. Para remover fundos contínuos suaves de cada quadro, selecione Subtrair o fundo do menu Process.
Digite 20 para o raio da bola rolando. Verifique a caixa De visualização e selecione Ok. Selecione Sim quando perguntado se deve processar todas as imagens.
Em seguida, para reduzir o ruído, selecione Processo, Filtros, Mediana. Digite 2.0 para o raio em pixels. Verifique a caixa De visualização e selecione Ok.
Selecione Sim quando perguntado se deve processar todas as imagens. Em seguida, selecione Imagem, Ajuste, Limiar para separar as imagens dos microchambers do fundo da imagem. No menu Plugins, selecione FemDA, Análise FemDA.
Insira o número mínimo e máximo aproximado de pixels de uma única microcâmara. A circularidade mínima e máxima esperada dos microchambers e os números do quadro de início e final, em seguida, selecione Gerar ROI para detectar os microchambers. Os ROIs detectados com sucesso são mostrados no ROITable do menu pop-up.
Na janela Análise FemDA, selecione Aplicar máscara de ROI. Examine a imagem para ver se os microchambers foram detectados corretamente. Abra a imagem da fluorescência e traga-a para a frente.
Clique em Aplicar a máscara ROI novamente para adicionar os ROIs à imagem de fluorescência. Na janela Análise FemDA, selecione One-Shot para analisar dados de ponto final da imagem. Digite N para o número de pixels superiores usar os pixels topo de linha de cada ROI para calcular a intensidade média da gotícula correspondente.
Em seguida, clique em Medir a intensidade para calcular as intensidades médias de todas as gotículas detectadas. O ROITable é atualizado com os novos dados da imagem da fluorescência e o histograma é exibido em uma nova janela. Exporte os dados clicando no botão Salvar como texto.
A solução fluorescente foi encapsulada em microchambers FemDA e a intensidade da fluorescência, que está correlacionada com o tamanho da gotícula, foi medida por meio de microscopia. Verificou-se que as gotículas tinham uma distribuição de tamanho estreito. A imagem 3D reconstruída da microscopia confocal também mostrou o tamanho consistente da gotícula ao longo do tempo.
As gotículas foram estáveis à temperatura ambiente sem perda de evaporação ou contaminação cruzada entre gotículas por pelo menos 24 horas. A proteína fluorescente mNeonGreen foi sintetizada em FemDA. E os dados da imagem da pilha foram analisados com o auxílio da imagem de campo brilhante desfocado concomitante.
Como a intensidade de fluorescência de cada gotícula é medida de seu rendimento proteico, o histograma sugere fortemente números desiguais de moléculas de DNA por gotícula. A probabilidade de gotículas contendo diferentes números de moléculas de DNA foi perfeita para uma distribuição de Poisson. A síntese da enzima fosfattase alcalina também foi realizada em FemDA com imagens capturadas a cada cinco minutos.
A reação mostrou uma distribuição discreta semelhante da intensidade de fluorescência das gotículas em momentos anteriores e os resultados do histograma verificaram que os números desiguais das moléculas de DNA nas gotículas. Uma única molécula de DNA encapsulada em gotículas individuais pode ser ainda mais recuperada, amplificada e sequenciada, torná-la a maior triagem de proteínas possível. Uma técnica de gotícula com volume pequeno e alta estabilidade permite um diagnóstico molecular rápido e preciso de doenças cancerígenas com biomarcadores específicos.
