Più di un milione di uniformi delle goccioline sono prodotte sul substrato delle dimensioni di un dito. E singole molecole di DNA sono distribuite casualmente in ogni goccia. La resa proteica è proporzionale al numero di molecole in una goccia.
La nostra tecnica può essere utilizzata per una misurazione rapida e quantitativa dell'attività enzimatica senza complicate espressioni proteiche e purificazione. Per iniziare, impostare un vetro di copertura su un rack di colorazione e posizionare il rack in otto idrossido di sodio molare. Sonicare il vetro di copertura e il rack di colorazione per 15 minuti a temperatura ambiente.
Rimuovere il rack di colorazione dall'idrossido di sodio e sciacquare il vetro di copertura con acqua 10 volte. Asciugare il vetro di copertura con una pistola ad aria compressa. Quindi cuocere e asciugare il vetro di copertura su una piastra calda a 200 gradi Celsius per cinque minuti.
Preparare la soluzione di aminosilano dello 0,05%. Immergere il vetro di copertura in questa soluzione e incubarlo per un'ora a temperatura ambiente. Risciacquare il vetro di copertura cinque volte in acqua pura.
Quindi asciugare il vetro di copertura usando una pistola ad aria compressa. Cuocerlo sul piatto caldo a 80 gradi Celsius per cinque minuti. Posizionare il substrato di vetro di copertura su un mandrino sottovuoto personalizzato per lo spin coater.
Erogare da 70 a 90 microlitri di polimero CYTOP di tipo A al centro del substrato di vetro. Quindi girare immediatamente il polimero. Il rivestimento polimerico iniziale danneggia la qualità dell'array di microcamera finale.
Erogare il polimero al centro del vetro di copertura senza introdurre bolle d'aria. Raccogliere il vetro rivestito tenendolo agli angoli e posizionarlo su un foglio di alluminio. Cuocerlo per 30 minuti a 80 gradi Celsius e poi per un'altra ora a 200 gradi Celsius.
Distribuire da 0,2 a 0,3 millilitri di fotoresist al centro del substrato. Girare immediatamente il fotoresist a 6.000 giri/min per 60 secondi. Utilizzare una salvietta imbevuta di etanolo per rimuovere il fotoresist in eccesso dai bordi del substrato.
Cuocere il substrato a 110 gradi Celsius per cinque minuti. Per reidratare il fotoresist, lasciare riposare il substrato per 30 minuti con un'umidità relativa dal 42 al 60%Caricare il substrato nell'allineatore della maschera ed esporlo per 25 secondi in modalità di contatto sottovuoto. Quindi immergere il substrato nello sviluppatore per cinque minuti per sciogliere il fotoresist esposto.
Risciacquare il substrato 10 volte utilizzando acqua pura. Quindi asciugare accuratamente il substrato usando la pistola ad aria compressa. Posizionare il substrato nella camera di reazione della macchina di incisione ionica reattiva e incidere il fotoresist coperto CYTOP con il plasma di ossigeno.
Dopo l'incisione, rimuovere il fotoresist rimanente sonicando il substrato in acetone per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi sonicare il substrato in propanolo per cinque minuti. Risciacquare, sonicare e risciacquare nuovamente il substrato usando acqua pura come descritto nel manoscritto.
Quindi asciugare il substrato con una pistola ad aria compressa. Utilizzando una fresa desktop, tagliare il nastro adesivo kapton a doppia rivestita nelle forme a microcanale definite. Attaccare i pezzi di nastro tagliati nella parte inferiore di una piastra di Petri piatta per fungere da maestro per lo stampaggio del PDMS.
Versare la miscela PDMS nella piastra di Petri a nastro. Quindi posizionare la piastra di Petri in una mini camera a vuoto e deaerare la miscela PDMS per una o tre ore. Quindi posizionare la piastra di Petri in un forno a 60 gradi Celsius e lasciarla durante la notte per curare il PDMS.
Dopo che il PDMS si è polimerizzato, sbucciare l'elastomero stagionato dalla piastra di Petri e utilizzare una fresa a cavo piatto per tagliare i blocchi di microcanale PDMS. Quindi fare un buco ad ogni estremità di ogni microcanale. Il substrato precedentemente preparato avrà un'area per l'array di microcamera.
Posizionare il microcanale PDMS su questa parte del substrato. Quindi inserire una punta del pipetto da 200 microliter in uno dei fori nel microcanale PDMS. In primo luogo, preparare la soluzione di reazione CFPS in un tubo PCR.
Quindi, utilizzando una punta del tubo non filtrante a 200 microlitri, redigere 10 microlitri della soluzione. Inserire la punta del tubo nel foro di ingresso del microcanale PDMS e spingere verso il basso sullo stantuffo della pipetta fino a quando la soluzione non trabocca dalla presa del microcanale. Trasferire il dispositivo FemDA in un blocco di alluminio pre-refrigerato.
Verificare che l'area dell'array di microcamera si trasformi rapidamente da traslucida a trasparente. Disegnare 300 microlitri di olio a filo prerimente refrigerato e trasferire immediatamente l'olio nella punta del tubo del foro di ingresso del microcanale. L'olio a filo si muove nel microcanale ed estrude la soluzione di reazione in eccesso situata al di fuori delle microcamera.
Rimuovere contemporaneamente le due punte delle pipetta inserite dal dispositivo. Spostare immediatamente il dispositivo dal blocco di alluminio alla pellicola di paraffina. Inserire la punta della pipetta preparata contenente l'olio di tenuta nell'ingresso del microcanale PDMS e iniettare l'olio fino a quando non trabocca dall'uscita.
Le goccioline del femtolitro sono sigillate in singole microcamera dall'olio. Aprire l'immagine BF sfocata. Per rimuovere sfondi continui smussati da ogni fotogramma, selezionate Sottrai sfondo dal menu Processo.
Immettere 20 per il raggio della palla rotolante. Selezionare la casella Anteprima e selezionare Ok. Selezionare Sì quando viene chiesto se elaborare tutte le immagini.
Quindi, per ridurre il rumore, selezionare Processo, Filtri, Mediana. Immettere 2,0 per il raggio in pixel. Selezionare la casella Anteprima e selezionare Ok.
Selezionare Sì quando viene chiesto se elaborare tutte le immagini. Selezionare Quindi Immagine, Regola, Soglia per separare le immagini delle microcamera dallo sfondo dell'immagine. Scegliere FemDA, FemDA Analysis dal menu Plugins.
Immettere il numero minimo e massimo approssimativo di pixel di una singola microcamera. La circolarità minima e massima prevista delle microcamera e i numeri di fotogramma iniziale e finale, quindi selezionare Genera ROI per rilevare le microcamera. Le ROI rilevate correttamente vengono visualizzate nel menu di scelta rapida ROITable.
Nella finestra Analisi FemDA selezionare Applica maschera ROI. Esaminare l'immagine per verificare se le microcamera sono state rilevate correttamente. Apri l'immagine a fluorescenza e portala davanti.
Fare di nuovo clic su Applica maschera ROI per aggiungere le ROI all'immagine a fluorescenza. Nella finestra Analisi FemDA selezionare One-Shot per analizzare i dati del punto finale dell'immagine. Immettere N per il numero di pixel principali per utilizzare i pixel di fascia alta di ogni ROI per calcolare l'intensità media della goccia corrispondente.
Quindi fare clic su Misura intensità per calcolare le intensità media di tutte le goccioline rilevate. Il ROITable viene aggiornato con i nuovi dati dell'immagine a fluorescenza e l'istogramma viene visualizzato in una nuova finestra. Esportare i dati facendo clic sul pulsante Salva come testo.
La soluzione fluorescente è stata incapsulata nelle microcamera FemDA e l'intensità della fluorescenza, correlata alle dimensioni delle goccioline, è stata misurata mediante microscopia. Le goccioline hanno una distribuzione di dimensioni ridotte. L'immagine 3D ricostruita dalla microscopia confocale mostrava anche la dimensione costante delle goccioline nel tempo.
Le goccioline erano stabili a temperatura ambiente senza perdita di evaporazione o contaminazione incrociata tra goccioline per almeno 24 ore. La proteina fluorescente mNeonGreen è stata sintetizzata in FemDA. E i dati dell'immagine dello stack sono stati analizzati con l'aiuto dell'immagine simultanea del campo luminoso sfocato.
Poiché l'intensità di fluorescenza di ogni goccia viene misurata della sua resa proteica, l'istogramma suggerisce fortemente un numero ineguale di molecole di DNA per goccia. La probabilità di goccioline contenenti un numero diverso di molecole di DNA era perfetta per una distribuzione di Poisson. La sintesi dell'enzima fosfatasi alcalina è stata effettuata anche in FemDA con immagini catturate ogni cinque minuti.
La reazione ha mostrato una distribuzione discreta simile dell'intensità di fluorescenza delle goccioline in un momento precedente e i risultati dell'istogramma hanno verificato che il numero ineguale delle molecole di DNA nelle goccioline. Una singola molecola di DNA incapsulata in singole goccioline può essere ulteriormente recuperata, amplificata e sequenziata per renderlo il più alto screening delle proteine possibile. Una tecnica a goccia con volume ridotto e elevata stabilità consente una diagnosi molecolare rapida e precisa delle malattie tumorali con biomarcatori specifici.
