Este método permite que cada arco faringeal seja compartimentalizado. Os números de células endoteliais podem então ser quantificados em cada arco como um meio de estudar o desenvolvimento da artéria do arco faringeal. As principais vantagens dessa abordagem são a capacidade de visualizar a relação entre diferentes estruturas vasculares e a capacidade de determinar quantitativamente como as estruturas afetaram os mutantes.
Artérias arcadas aórticas são comumente mutadas em doenças cardíacas congênitas. Nosso método permite o estudo de como as mutações alteram o processo fisiológico de formação e remodelação de vasos. Embora usemos este método para obter insights sobre os mecanismos de doença cardíaca congênita, ele pode ser aplicado a outros sistemas particularmente com o advento da microscopia de folha de luz.
Comece usando uma pipeta de vidro para transferir cada embrionário de camundongos dia 9,5 ou 10,5 embriões em dois tubos mililitros individuais contendo um mililitro de PBS. Após a fixação, use fórceps finos para beliscar cuidadosamente o embrião logo acima da plataforma traseira e fazer um corte transversal para remover a metade posterior do embrião. Para permeabilizar os embriões, substitua o PBS por PBST e coloque os embriões a quatro graus Celsius com agitação suave durante a noite.
No dia seguinte, substitua o PBST por 600 microliters de tampão de bloqueio sem tocar nos embriões para uma incubação de 16 a 18 horas a quatro graus Celsius por agitação suave. Na manhã seguinte, substitua o tampão de bloqueio por 600 microliters do anticorpo primário de interesse por tubo para uma incubação de quatro a cinco dias a quatro graus Celsius por agitação suave. No final da incubação, lave os embriões em um mililitro de PBST por quatro a cinco horas com agitação suave à temperatura ambiente mudando o PBS a cada hora, seguido de uma incubação durante a noite em PBST fresco a quatro graus Celsius e quatro a cinco lavagens adicionais de uma hora no dia seguinte.
Após a última lavagem, substitua o PBST em cada tubo por 600 microliters da solução de anticorpos secundários apropriada para uma incubação de quatro a cinco dias a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave os embriões em um mililitro de PBST fresco por lavagem como acabou de demonstrar e use uma pipeta de vidro para transferir suavemente cada embrião em moldes individuais de parafina plástica. Remova cuidadosamente qualquer PBST ao redor de cada embrião e oriente cada embrião em uma posição sagital.
Em seguida, adicione rapidamente cerca de 500 microliters de agarose quente a cada molde até que cada embrião esteja apenas coberto e coloque os moldes no gelo cobertos com papel alumínio até que a ágarose se solidifique. Para a desidratação das amostras embrionárias, use um bisturi limpo para cortar um bloco de agarose em torno de cada embrião e use fórceps para agarrar a agarose para transferência em um tubo de dois mililitros rotulados contendo um mililitro de 25% de metanol. Após uma incubação de uma hora com agitação suave no escuro, substitua 25% de metanol por um mililitro de 50% de metanol por tubo para uma incubação adicional de uma hora no escuro.
Após o fim da desidratação, substitua o metanol de 100% por um mililitro de 50% BABB para uma incubação de uma hora com agitação suave no escuro. Ao final da incubação, substitua o BABB de 50% por um mililitro de 100% BABB por tubo para uma incubação de uma hora com agitação suave no escuro, seguido de uma segunda incubação com 100% BABB como apenas demonstrado. Para montar os embriões para imagem, remova o adesivo de um para-choque rápido e coloque o para-choques em um deslizamento de vidro de 24 por seis mililitros.
Aplique uma pressão suave no adesivo para remover quaisquer bolhas de ar entre o deslizamento de tampa e o para-choque e descarte cuidadosamente o BABB 100% de cada tubo. Em seguida, use fórceps finos para transferir cuidadosamente o embrião para o poço rápido sem tocar no embrião e colocar uma segunda mancha de cobertura no para-choque. Para emergir o endotélio em todo o terceiro arco faringeal, abra a imagem de interesse no software e clique em adicionar nova superfície.
Superfície de duplo clique e renomeie a nova superfície para terceiro arco faringeal. Selecione pular a criação automática, editar manualmente e definir a orientação de superfície para o plano YZ. Use a posição de fatia para colocar o terceiro plano de superfície do arco faringeal para onde o terceiro PAA e a aorta dorsal se conectam.
Gire a imagem para que o terceiro plano de superfície do arco faringeal esteja à vista e desligue o cortador de orto. No modo contorno de saque, selecione a função do modo de desenho de distância e ajuste as configurações do parâmetro conforme necessário. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, pressione a tecla Escape e clique em desenhar para rastrear o perímetro do terceiro arco faringeal com o cursor do mouse.
Em seguida, use a posição de fatia para mover 10 a 25 fatias e traçar o perímetro do arco faringeal. Quando todo o arco tiver sido rastreado, clique em criar superfície para gerar a superfície da região rastreada. Para mascarar as estruturas superficiais, no menu de edição, selecione a seleção de máscaras para o terceiro PAA e DAPI e clique em OK. Em seguida, renomeie o novo canal como PAA DAPI.
Repita esta etapa para os canais restantes. Para visualizar o plexo endotelial separadamente do PAA, selecione a seleção de máscaras para o terceiro PAA e selecione DAPI. Desmarque voxels externos e verifique voxels selecionados dentro da superfície para.
Defina voxels selecionados dentro da superfície para zero e clique em OK. Renomeie o novo canal como DAPI não-PAA. Repita esta etapa para os canais restantes. Selecione a seleção de máscaras para o terceiro PA e selecione o DAPI não-PAA e clique em OK. Renomeie o novo canal como plexus DAPI.
Repita esta etapa para os canais restantes. Para quantificar as células endoteliais individuais dentro de cada estrutura de interesse, no painel de ajustes de exibição, desligue todos os canais, exceto o canal PAA ERG. No menu de propriedades, clique em adicionar novas manchas e clique para renomear manchas de um número total de células endoteliais do PAA.
Clique na seta azul e selecione o canal PAA ERG para o canal de origem. Ajuste o diâmetro XY estimado para quatro micrômetros e clique na seta azul para prosseguir para o próximo painel. Use a escala deslizante para ajustar o número de manchas para garantir que cada núcleo celular endotelial positivo do ERG seja representado por um ponto.
Em seguida, clique na seta dupla verde e desligue o canal PAA ERG no painel de ajuste de exibição. Ligue o canal PAA VEGFR2 para visualizar o endotélio PAA e clique em editar e adicionar/excluir para selecionar a superfície do objeto. Em seguida, pressione Escape e segure Shift para excluir quaisquer pontos que não sejam POSITIVOS VEGFR2 e clique na guia estatísticas para determinar o número total de células endoteliais.
A imunofluorescência de montagem inteira produz resultados claros e limpos permitindo a reconstrução 3D do endotélio do arco faringeal. Nesta imagem, a presença dos grandes pontos brilhantes é o resultado de partículas no anticorpo ou no bloqueio de soluções tampão. Após a coloração do arco faringeal e da superfície paa, o uso da função da máscara permite que as regiões superficiais sejam visualmente separadas e analisadas independentemente.
O mascaramento também permite a análise individual e quantificação dos números de células endoteliais dentro de cada estrutura. Por exemplo, aqui o recurso spot foi usado para quantificar o número total de células endoteliais tanto no PAA quanto no plexo, atribuindo um único ponto para cada núcleo expressando ERG. Nesta imagem, pode-se observar um ponto negativo VEGFR2 positivo do ERG que foi gerado pela função spot.
Portanto, é essencial verificar se cada ponto reconhecido pelo software representa realmente uma única célula endotelial. Para obter imagens limpas e claras, lembre-se de girar todas as soluções e lavar adequadamente e completamente cada embrião após incubações de anticorpos. É importante lembrar que o BABB é corrosivo e tóxico.
Manuseie e descarte o solvente corretamente e certifique-se de selar completamente os embriões derretidos para evitar o vazamento de BABB.
