Complexo de tecidos multicelulares, este protocolo reconstitui a conduta celular de forma simplificada. Uma coisa é essa técnica para estudar as relações diretas entre prótons condutores celulares e resposta celular. Este protocolo usa contas de poliestireno quimicamente funcionais para reconstituir os prótons do condutor celular.
As contas podem ser cortadas com qualquer próton de interesse, para testar seus efeitos na resposta celular. Usamos este método em C-Elegance em embriões de rato. Portanto, este protocolo pode ser vertical aos estudos de organismos amplos.
Como os embriões são frágeis após o tratamento completo de cloríteis, é necessária prática significativa antes que se possa isolar com sucesso a blastomere. A demonstração visual fornecerá uma maior compreensão de como se deve lidar com capilar durante métodos de isolamento de blastomere. Para começar, pese 10 mili gramas de contas de poliestireno modificadas de carboxilato em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mili litro.
Adicione um mili litro de tampão MES no tubo para lavar. Vórtice do tubo para misturar as contas. Gire o tubo por 60 segundos em 2000XG através de centrífuga de bancada.
Dicard o supernatante, cuidadosamente pipetando o buffer. Lave as contas novamente com um mililitro de amortecedor MES. Após a lavagem, adicione um mili litro de tampão MES contendo 10 mili gramas de EDAC no tubo, para ativar os grupos de carboxíl de superfície.
Vórtice do tubo para misturar as contas. Gire e incubar o tubo por 15 minutos em temperatura ambiente. Gire as contas por 60 segundos em 2000XG.
Descarte o supernatante, extravando cuidadosamente o tampão e lave com um mililitro de PBS. Vórtice do tubo para misturar as contas e repetir a lavagem PBS mais uma vez. Prepare uma série de diluição de 0,65 mil litros de um, 10, 100 e mil vezes de rhodamine Red-X da solução de estoque Rhodamine Red-X de 0,65 mili litros.
Pippette 20 microcompactos de contas em cada tubo de diluição serial. Gire e incuba os tubos por cinco minutos em temperatura ambiente. Lave as contas duas vezes com um mililitro de PBS.
Após a lavagem, adicione um mili litro de PBS nos tubos e armazene-os a quatro graus Celsius por até seis semanas. Verifique a intensidade da fluorescência das contas sob um microscópio usado para imagens vivas. Segure cada extremidade de um micro-capilar com capacidade de 10 micro litros com a mão direita e esquerda.
Puxe o micro-capilar para ambas as extremidades para aplicar tensão e traga o centro do capilar sobre um queimador para fazer dois capilares puxados à mão. Sob o microscópio dissecando, corte as pontas dos capilares puxados à mão com fórceps. Faça os dois tamanhos de abertura de ponta aproximadamente duas vezes, e uma vez o curto comprimento de acesso de Embriões C-Elegance para a transferência de embriões e remoção de casca de ovo, respectivamente.
Coloque o capilar puxado em um aparelho de boca-pippetting. Pippette 45 microcompactos de solução de sais de ovo em um poço de um slide multi-welled. Coloque de 5 a 10 adultos C-Elegance no poço.
Para obter os primeiros Embriões C-Elegance cortar os adultos em pedaços, posicionando duas agulhas para a direita e para a esquerda do corpo de C-Elegance, e deslizando as agulhas um pelo outro. Pippette 45 microcomplores de solução de hipoclorito em um poço ao lado do poço contendo solução de sal de ovo e pippette 45 microcomprais do Shelton's Growth Medium para os três poços subsequentes. Transfira um estágio celular e dois embriões de estágio celular inicial para a solução de hipoclorito pela pippette bucal com a abertura de tamanho maior e espere por 40 a 55 segundos.
Lave os embriões transferindo-os para os próximos três poços com o Meio de Crescimento de Shelton. Com um a dois segundos em cada um dos dois primeiros poços. Utilizando o capilar desenhado à mão com a abertura de tamanho menor, repita cuidadosamente o embrião para a remoção da casca de ovo.
Depois disso, pippette continuamente com o capilar desenhado à mão para separar os blastomeres embrionários de duas células. Após a remoção da casca de ovo, minimize a força na pippetação dos embriões para cima e para baixo para evitar a explosão. Prepare uma câmara de imagem colocando uma mancha de cobertura em um suporte de deslizamento de tampa e tape as bordas do tapa de cobertura para stabalizá-la.
Gire o suporte do deslizamento e desenhe um círculo na tampa com uma caneta hidrofóbica. Adicione o meio de crescimento de Shelton dentro do círculo desenhado pelo marcador hidrofóbico, e transfira a blastomere isolada para a câmara de imagem dentro do círculo. Agora, dispense um pequeno volume das contas quimicamente funcionalizadas no deslizamento de tampas usando o capilar desenhado à mão com a abertura maior.
Controle a posição das contas soprando no capilar desenhado à mão até que as contas se conectem à blastomere isolada. Monte a mancha de cobertura para evitar a evaporação do meio e realize imagens ao vivo usando um microscópio invertido. Neste estudo, o sinal fluorescente da conta tratada com 0,005 micro gramas por mililitro Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester para a cepa transgênica expressando miosin-2 e M-cherihistone era muito fraco.
Por outro lado, o sinal fluorescente das contas tratadas com cinco micro gramas por litro de rhodamina Red-X Succinimidyl Ester era muito forte. A concentração de Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester a 0,5 micro gramas por mililitro foi ótima para esta cepa transgênica em particular. Durante a imagem ao vivo foi identificado um avião onde dois centrossomos estavam verticalmente alinhados.
O avião com ângulo de mais ou menos 90 graus deste avião é plano de fuso. O ângulo de orientação do fuso em relação à interface de contato celular/contas após a citocinese mostra que ambas as células filhas foram anexadas à conta em uma linha que passa por ambos os pontos de contato foi usado como orientação de contato. É preciso aprender como embriões e casca de ovo reagem a certas forças externas aplicadas pela pippette bucal.
Teoricamente, qualquer resposta celular pode ser estudada, por exemplo, a especificação sulfato pode ser estudada por células de cultivo e contato com contas adesivas em longo prazo. Esta técnica tem sido usada para entender o mecanismo de orientação da divisão celular dependente de contato. O filtro PTF foi utilizado para evitar a inalação de vapores de solução hipoclorito via pippette bucal.
