Este protocolo é significativo porque nos permite visualizar o microambiente onde as células produzem uma dada citocina, aqui, interferon gama. Admite-se que a amplitude de ação das citocinas é limitada porque os tecidos são tão complexos. É importante caracterizar as células que cercam as células produtoras de gamma de interferon para identificar quais células irão tomá-la.
A principal vantagem da técnica é que ela não interrompe o microambiente presente no tecido de interesse. Além disso, como não repumos artificialmente as células para forçá-las a produzir interferon gama, isso nos dá uma melhor caracterização de se as células estão realmente produzindo interferon gama in situ. Este protocolo poderia ser potencialmente adaptado a outros órgãos e para a visualização de outras citocinas.
A maioria das etapas deste protocolo são simples, mas o manuseio do tecido, congelamento e secção, deve ser realizado com cuidado para preservar a integridade do tecido. Para começar, transfira 300 microliters de LM cultivados geneticamente modificados para expressar OVA para uma infusão cardíaca de caldo a 37 graus Celsius em um frasco. Coloque o frasco em um shaker para agitação suave para crescer LM para uma fase exponencial até que o OD600 atinja 0,08 a 0,1.
Depois de diluir a cultura LM OVA na PBS para uma concentração de 0,1 vezes a dose letal, 50% usam uma seringa de insulina de 29 bitola para injetar intravenosamente 100 microliters em C57 preto 6 receptores de camundongos do tipo selvagem com células OT1 GFP ou OT1 RFP. Para bloquear a secreção de citocinas 6 horas antes do sacrifício do rato, injete 250 microgramas de BFA e 200 microliters de PBS intraperitoneal com a seringa de insulina de 29 bitolas. Após a eutanização de camundongos usando dióxido de carbono e posterior luxação cervical, limpe o abdômen com 70% de etanol.
No flanco esquerdo do rato onde está localizado o baço, corte a pele com uma tesoura para fazer uma incisão de um a dois centímetros. Em seguida, faça cuidadosamente uma incisão no peritônio para expor o baço e tirá-lo com pinças. Tenha cuidado para não espremê-lo com fórceps ou cortá-lo para evitar interromper a arquitetura do baço.
Agora, prepare a solução fixativa misturando 3,75 mililitros de PBS e 3,75 mililitros de 0,2 molar L-lysine. Adicione 21 miligramas de m-periodato de sódio e misture bem. Em seguida, adicione 2,5 mililitros de 4%PFA e 20 microliters de 12 hidróxido de sódio normal.
Corte o baço em três partes. Submergir o baço na fixação em uma placa de seis poços e fixar por um mínimo de quatro horas. Um período de fixação típico é de 16 a 20 horas a quatro graus Celsius sob agitação suave.
Depois disso, descarte a solução fixa e adicione cinco mililitros de PBS por cinco minutos em temperatura ambiente sob suave agitação. Em seguida, substitua o PBS por cinco mililitros de 30% de sacarose e incubar por 12 a 24 horas para manter a morfologia tecidual. Agora, o órgão afunda no fundo da placa.
Para congelar a amostra, coloque gelo seco em um recipiente grande e coloque um recipiente menor dentro contendo cerca de 50 mililitros de metanol puro e alguns pedaços de gelo seco. Seque suavemente o baço em um lenço sem fiapos. Goteie uma gota de composto OCT na parte inferior do molde base e coloque o baço dentro do molde.
Tenha cuidado para não produzir bolhas. Adicione aproximadamente um mililitro de OCT sobre o baço. Com fórceps, deposite o molde base na superfície do metanol no banho de gelo seco, certificando-se de que o metanol não toque no OCT.
O OCT vai engrossar e ficar branco quando congelado. Lembre-se de congelar o tecido o mais rápido possível para minimizar artefatos. Em um crio-microtoma, a temperatura de menos 20 graus Celsius.
Selar o tecido à espessura desejada, em torno de 10 micrômetros. Use um pincel para coletar seções em lâminas de microscópio de vidro e inspecione visualmente. Permita que as seções cheguem à temperatura ambiente.
Desenhe um círculo com bloqueador líquido, por exemplo, uma caneta PAP, ao redor da seção de tecido fora do OCT. Uma vez que o tecido tenha secado, reidrate a amostra pingando 100 microliters de PBS na seção tecidual por cinco minutos. Em seguida, remova o PBS da seção por aspiração e adicione 100 microliters de solução de bloqueio por seção de amostra.
Incubar em uma câmara molhada coberta por pelo menos uma hora em temperatura ambiente. Para coloração com anticorpos primários, substitua a solução de bloqueio pela mistura de anticorpos primários preparada para cada amostra. Incubar por quatro horas em temperatura ambiente ou durante a noite a quatro graus Celsius em uma câmara molhada coberta antes de lavar de acordo com o manuscrito.
Agora, diluir os anticorpos secundários de interesse para uma concentração ideal, geralmente 2,5 microgramas por mililitro, na solução de bloqueio. Remova a solução final de lavagem da seção e adicione a mistura de anticorpos secundários preparadas em cima da seção e incubar por uma a quatro horas em temperatura ambiente em uma câmara molhada coberta. Após lavar com tampão de lavagem de acordo com o manuscrito, remova a solução de lavagem e realize uma lavagem final com PBS.
Aspire a solução salina tamponada com fosfato e permita que o PBS restante evapore sem que a seção seque completamente. Desenhe um círculo ao redor da seção na parte de trás do slide. Em seguida, coloque uma gota do meio de montagem em cima da amostra, certificando-se de que o meio cobre toda a seção e coloque cuidadosamente um copo de cobertura em cima.
Deixe a amostra polimerase durante a noite à temperatura ambiente no escuro. Pela manhã, coloque o slide sob um microscópio de varredura espectral invertido. Ajuste o objetivo para 10x NA 0,40 ou 60x NA 1.4 para análise da localização subcelular de citocinas.
Neste protocolo, as células que produzem interferon gama são visualizadas e localizadas. O marcador F4/80 rotula todos os macrófagos e destaca a polpa vermelha. O marcador B220 rotula células B e destaca folículos de células B ao redor da zona de células T.
O marcador CD169 rotula macrófagos de zona marginal em torno da polpa branca. 24 horas após a infecção, o interferon gama é produzido por múltiplas células, incluindo células OT1 CD8 T e células T específicas de antígeno ativado. Sem o uso de BFA para inibir a secreção de citocinas, a detecção de gamma interferon por células NK foi muito prejudicada.
Células B, macrófagos de zonas marginais e todos os macrófagos foram manchados para delinear a localização de células produtoras de gamma de interferon após a infecção por LM OVA. Curiosamente, células T específicas de antígeno agrupados foram encontradas localizadas em toda a polpa branca do baço, mas produzem gamma interferon apenas em regiões onde as células NK estavam coexistindo com elas. Diferentes localizações subcelulares de células T interferon e NK versus CD8 positivos foram mostrados.
Enquanto a localização de interferon gama em células NK foi difundida no citosol, as células T positivas CD8 frequentemente recrutavam interferon gama para outra célula T. A injeção de brefeldin A é crucial para detectar a citocina in situ. As células muitas vezes se secretam rapidamente e tomam as citocinas e precisamos inibir a secreção de citocinas para deixá-la se acumular nas células.
Este método é uma ferramenta de descoberta que coloca de volta as células produtoras de citocinas em seu ambiente nativo. Decifrar a composição desse ambiente nos permite focar nas células certas ou mediadores imunológicos presentes neste local que podem impactar ou ser impactados por interferon gama. Há uma compreensão crescente de que a localização precisa de uma célula em um tecido é crucial para sua função.
Nosso protocolo nos permite identificar a localização das células produtoras de citocinas e, assim, caracterizar ainda mais sua função.
