Compreender a base física da auto-montagem proteica nas células é limitado pela falta de ferramentas adequadas. Os métodos atuais sofrem de baixa sensibilidade, leituras indiretas, rendimento limitado e/ou resolução de nível populacional. Em contraste, nosso ensaio detecta e quantifica a propensão de uma proteína para auto-montagem in vivo com uma sensível, única célula, leitura de alto rendimento, independentemente da localização ou solubilidade da proteína.
Ao experimentar o ensaio pela primeira vez, obter o direito de conversão de fotos pode exigir alguns testes empíricos para obter condições ideais para obter uma boa leitura em toda a placa. A sensibilidade do ensaio também pode ser comprometida se o cítmetro não tiver filtros de detecção separados para os sinais FRET e acceptor. Demonstrando o procedimento comigo estará Andrew Box, o gerente de laboratório do núcleo de citometria.
Para preparar uma cultura de levedura para dAmFRET, para cada proteína de consulta, inocular as colônias de leveduras transformadas em triplicado em 200 microliters de um meio de crescimento não indutor apropriado em poços individuais de uma placa de cultura de fundo bem redonda de 96. Incubar as células de levedura com agitação com uma órbita de 1,5 milímetros a 1.200 rotações por minuto a 30 graus Celsius por 16 horas. No final da incubação, sedimente as células de levedura por centrifugação e remova os supernantes por inversão forçada.
Adicione 200 microliters de um meio de indução adequado e devolva as células à incubadora por mais 12 horas. No final da incubação, sedimente as células de levedura por centrifugação e inversão forçada, em seguida, adicione 200 microliters de meio de indução fresco. Em seguida, incubar as células com agitação por mais quatro horas para reduzir a auto-fluorescência.
Para converter as amostras, coloque a placa sem a tampa sob uma lâmpada ultravioleta equipada com um filtro de 320 a 500 nanômetros e um collimador de feixe posicionado 45 centímetros acima da placa. Ligue a lâmpada para a foto converta as células por 25 minutos com agitação. Para a coleta de dados DAmFRET, carregue as células convertidas por foto em um citômetro de fluxo de imagem com lasers não colinear 488 e 561 nanômetros e portão quatro células únicas não abominadas por alta circularidade e uma pequena área celular.
Em seguida, colete dados de duas a cinco vezes 10 para as quatro células únicas por amostra dentro de um portão positivo de fluorescência. Ao final da análise, utilize uma amostra mEos3.1 não-foto convertida para o sinal de doador puro e DsRed monomérica dois para o sinal de aceitação pura para definir a compensação. Para maior sensibilidade, certifique-se de que o canal do detector DE FRET também seja considerado como alvo de derramamento no programa de análise.
Calcule o parâmetro AmFRET como a razão do sinal FRET total dividido pelo sinal total de aceitador FRET. Os perfis AmFRET de células de levedura expressando proteína fluorescente por si só exibem AmFRET insignificante, enquanto as células de levedura expressando como homooligomer estável fundido à proteína fluorescente demonstram valores uniformes positivos de AmFRET. Imagens das células adquiridas pela citometria de fluxo de imagem revelam uma fluorescência difusa em todos os canais.
A microscopia confocal de pilhas Z para vários campos de células mostra uma distribuição uniforme da fluorescência em todo o citosol de cada célula sem puncta detectável. As células de levedura que expressam o fluoróforo sozinho ou o fluoróforo mais a forma mutante de uma proteína inflamada humana exibem amFRET insignificante sobre toda a faixa de concentração indicando uma incapacidade de auto-interagir. Em contraste, a proteína inflamamasome tipo selvagem demonstra um perfil DAmFRET com uma população insignificante de AmFRET e uma alta população de AmFRET.
Note que a proteína inflamada tipo selvagem resiste à automontagem mesmo em altas concentrações com a proteína mudando para a forma auto-montada em apenas uma fração das células. Esta é uma clara indicação da existência de uma barreira de nucleação para a auto-montagem. Como confirmado pela imagem de fluorescência, essas populações representam células que contêm apenas proteína solúvel ou principalmente proteína auto-montada, respectivamente.
De fato, o DAmFRET corrobora dados estruturais anteriores de que o mutante de ponto no inflamatório interrompe a nucleação através das concentrações alcançáveis por este sistema de expressão. Note que perfis de expressão proteica em células de mamíferos que não possuem expressão Caspase-1 se assemelham aos observados em células de levedura. O passo mais importante a ser lembrado é a conversão de fotos.
Outras etapas cruciais incluem a coleta de um número suficiente de eventos que não estão saturados para sinal de fluorescência e a obtenção da compensação correta. Acompanhar o ensaio com bioquímica adequada, mutagênese racional e abordagens de biologia estrutural pode ajudar a elucidar totalmente o mecanismo da auto-montagem.
