Siderophores são de baixo peso molecular, biomoléculas metal-quequeantes envolvidas no ciclismo de ferro no ambiente. Este protocolo permite uma rápida avaliação de alta produtividade da atividade siderophore em amostras de solo e plantas. Métodos anteriores para detecção de siderophore eliminaram o ambiente crucial da comunidade microbiana.
Nossa técnica permite a detecção dentro da comunidade microbiana relativamente intacta e no habitat em que se envolveu. Como a disponibilidade de ferro é crucial para a produtividade agrícola, esse protocolo poderia ser usado para investigar o papel dos micróbios na modulação da disponibilidade de ferro para as plantas. Além disso, esse método poderia ser utilizado para avaliar o impacto das práticas de manejo agrícola na saúde do solo e nas comunidades produtoras de siderophore, bem como no desenvolvimento dessas comunidades ao longo do tempo.
Para começar, lave ácida todos os vidros em 100 mililitros de ácido nítrico 100 mililitros por um mínimo de duas horas antes da utilização no ensaio CAS. Prepare uma assadeira de alumínio cheia de areia de nível de laboratório e cubra-a com papel alumínio. Autoclave a 121 graus Celsius por 30 minutos e reserve.
Prepare o HDTMA adicionando 0365 gramas a 20 mililitros de água deionizada dupla, e coloque a solução em um banho de água a 37 graus Celsius para promover a solubilização. Adicione 0302 gramas de CAS a 25 mililitros de água deionizada dupla enquanto mexe suavemente com uma barra de agitação magnética estéril. Em seguida, adicione cinco mililitros de um hexahidrato de cloreto de ferro molar aos 25 mililitros da solução CAS enquanto continua a mexer suavemente.
Agora, adicione lentamente os 20 mililitros da solução HDTMA na solução complexa CAS de ferro enquanto mexe suavemente. Prepare a solução tampão dissolvendo 15,12 gramas de PIPES em 375 mililitros de água deionizada dupla com agitação suave. Ajuste o pH para 6,8 com cinco hidróxido de sódio molar.
Em seguida, adicione água para levar o volume a 450 mililitros. Agora adicione cinco gramas de agarose à solução. Autoclave a solução tampão PIPES e a solução complexa CAS de ferro a 121 graus Celsius por 30 minutos.
Adicione cuidadosamente a totalidade da solução complexa CAS de ferro à totalidade do buffer PIPES no armário de biossegurança depois que cada um deles foi autoclavado. Coloque a solução mista em um banho de água a 50 graus Celsius. Agora coloque um barco reagente estéril na areia estéril dentro do armário de biossegurança e aqueça a 50 graus Celsius.
Transfira o ágar complexo CAS de ferro para o barco, depois alíquota rapidamente de 100 microliters para cada poço de uma microplata estéril de fundo plano claro de 96 poços. Prepare o padrão de 800 pioverdina micromolar em m9 médio modificado previamente preparado. Diluir a solução em 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 soluções de micromolar.
Adicione EDTA a 500 mililitros de meio M9 modificado previamente preparado para preparar o padrão EDTA 3,2 milimiliar. Diluir essa solução em soluções 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 micromolares. Para gerar uma curva padrão, adicione 100 microliters de cada concentração de pyoverdine e EDTA para separar poços de uma microplacão de 96 poços contendo 100 microliters de ferro cas complexo ágar médio.
Faça duplicações técnicas duplicadas de cada concentração. Adicione também poços em branco com apenas M9. Usando um leitor de microplacão, meça a absorvância após uma, seis e 24 horas de incubação a 22 graus Celsius, e use medidas de absorvência para gerar curvas padrão. Lave o equipamento de amostragem com 22 mícrons filtro de água dupla deionizada seguido de 70% de etanol e limpe com toalhas de papel.
Realize a lavagem antes da amostragem e entre as amostras para manter a técnica estéril e reduzir a contaminação cruzada. Depois de extirpar tecidos vegetais e escavar uma pequena bola raiz das plantas no campo, coloque a bola raiz em um saco plástico rotulado separado para separação de amostras no ambiente de laboratório. Coloque todas as amostras diretamente no gelo e mantenha-se a quatro graus Celsius até que as amostras sejam processadas para o ensaio de produção siderophore.
Separar amostras de solo associadas à raiz em massa, solo de rizosfera livremente ligado e solo de rizosfera firmemente ligado. Para isso, tire as bolas de raiz dos sacos e retire suavemente o solo da bola raiz. O solo abalado, juntamente com o solo deixado no saco, compõem o solo a granel.
Este é o solo da rizofera frouxamente ligado. Gere um solo de rizopshere bem amarrado, tomando raízes com a amostra bem ligada e colocando-as em um tubo de centrífuga. Adicione 30 mililitros de água deionizada dupla e vórtice por dois a três minutos.
Remova as raízes para obter a diluição do solo da rizofera firmemente ligada. Homogeneize cada amostra de solo dentro do saco de amostras misturando e girando o solo o máximo possível sem abrir o saco. Após cada amostra ter sido completamente misturada, aliquot e suspender dois gramas de cada amostra de solo em 20 mililitros de meio M9 modificado dentro de um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéreis.
Diluir a amostra e, em seguida, selar o tubo com um plugue de espuma estéril para permitir a aeração. Para amostras de rizosfera bem ligadas, adicione dois mililitros do chorume do solo da rizosfera a 20 mililitros de meio M9 modificado dentro de um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéreis. Diluir a amostra e, em seguida, selar o tubo com um plugue de espuma estéril para permitir a aeração.
Para preparar a amostra de tecido, a superfície esteriliza a raiz, o tiro e o grão com 70% de etanol. Macerar dois gramas de tecido fresco em 20 mililitros de m9 médio modificado usando um liquidificador no alto por 30 segundos. Em seguida, transfira a amostra para um tubo de centrífuga de 50 mililitros estéreis, diluir e selar o tubo com um plugue de espuma estéril.
Para enriquecer a produção de siderophore através da limitação do ferro, incubar os tubos de centrífugas de 50 mililitros à temperatura ambiente e agitar a 160 RPM. Aos 24, 48 e 72 horas após iniciar a cultura do enriquecimento, remova uma subsame de mililitro dos tubos de enriquecimento usando técnica estéril. Centrifugar as subsamtras a 10.000 vezes G por um minuto em dois tubos de centrífuga mililitro para pelotizar as células.
Utilizando técnica estéril, adicione 100 microlitadores do supernatante a uma solução de 100 microlitres de ágar complexo CAS de ferro em duplicado ou triplicado dentro da microplape. Adicione também 100 microliters de meio M9 estéril como espaços em branco. Em seguida, incubar a placa a 28 graus Celsius.
Cada placa deve ser selada e coberta com papel alumínio antes da colocação na incubadora. Suspenda o restante do supernatante e pelota para cada amostra em seu próprio tubo de centrífuga de dois mililitros estéreis. Adicione 400 microliters de glicerol estéril em cada tubo supernacante amostrado e suspenda a pelota para criar estoques de glicerol.
Congele o estoque a menos 80 graus Celsius para análise posterior. Meça a absorvância em seis, 24, 48 e 72 horas em um comprimento de onda de 420 nanômetros. Uma mistura de pyoverdine biossintistritada por Pseudomonas fluorescens foi usada como padrão para interpretar e quantificar a absorção de amostras em amostras de equivalência de pyoverdine em micromolar.
A relação entre a absorvância em 420 nanômetros e a concentração inicial de pyoverdine é mostrada aqui. A atividade siderophore do enriquecimento de 72 horas foi avaliada em incubação de 48 horas para determinar a influência do genótipo e do tipo amostral no isolamento siderophore. A atividade siderophore em amostras de solo a granel foi relativamente baixa e não apresentou diferenças entre o genótipo do trigo do qual o solo a granel foi amostrado.
No entanto, enriquecimentos de solo livremente amarrado isolado do genótipo 725 apresentaram maior produção lateral em comparação com o solo livremente ligado de Madsen e 727, mas não de Lewjain. Por outro lado, a produção de siderophore em enriquecimentos de solo bem amarrado não foi fortemente influenciada pelo genótipo. Culturas de enriquecimento de tecido de grãos produziram produção relativamente baixa de siderophore, independentemente do genótipo.
Os enriquecimentos do tecido de tiro lewjain tiveram uma produção lateral significativamente menor do que os outros genótipos, e 725 culturas de tecido de tiro resultaram em uma produção mais variável siderophore. A maior diferença na atividade siderophore foi observada nas culturas de enriquecimento de tecidos radiculares, onde 725 tinham mais de 200% mais atividade siderophore do que todos os outros genótipos. Um dos aspectos mais tributantes da execução do protocolo é manter as condições assépticas, enquanto completa as muitas etapas para gerar a microplacão cas de ferro ágar e testar amostras para atividade siderophore.
Uma ampla gama de técnicas baseadas em cultura cromatográfica ou baseadas em DNA podem ser aplicadas tanto ao poço real do microtúrtero quanto à cultura preservada do glicerol para novos testes bioquímicos ou caracterização genética e modelagem metabólica. Usando este protocolo, a atividade siderophore pode mais tarde ser ligada a organismos específicos responsáveis por essa atividade ou, posteriormente, visados como um mecanismo para impactos ecológicos maiores. Este protocolo poderia ser facilmente modificado para avaliar a produção de siderophore em culturas de enriquecimento geradas a partir de amostras coletadas de outros compartimentos ambientais, incluindo ar, água e sedimentos.
