Siderophore sind niedermolekulare, metallchelatierende Biomoleküle, die am Eisenkreislauf in der Umwelt beteiligt sind. Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle Bewertung der Siderophoraktivität in Boden- und Pflanzenproben mit hohem Durchsatz. Frühere Methoden zur Siderophor-Detektion haben die entscheidende Umgebung der mikrobiellen Gemeinschaft beseitigt.
Unsere Technik ermöglicht den Nachweis innerhalb der relativ intakten mikrobiellen Gemeinschaft und des Lebensraums, in dem sie beteiligt war. Da die Verfügbarkeit von Eisen für die Produktivität der Landwirtschaft von entscheidender Bedeutung ist, könnte in diesem Protokoll die Rolle von Mikroben bei der Modulation der Verfügbarkeit von Eisen für Pflanzen untersucht werden. Darüber hinaus könnte diese Methode verwendet werden, um die Auswirkungen von Landbewirtschaftungspraktiken auf die Bodengesundheit und Siderophor produzierende Gemeinschaften sowie die Entwicklung solcher Gemeinschaften im Laufe der Zeit zu bewerten.
Zunächst waschen Sie alle Glaswaren in 100 Millimolar Salzchlorsäure 100 Millimolar Salpetersäure für mindestens zwei Stunden vor der Verwendung in der CAS-Assay. Bereiten Sie eine Aluminiumbackform mit Laborsand gefüllt und bedecken Sie sie mit Aluminiumfolie. Autoklav bei 121 Grad Celsius für 30 Minuten und beiseite stellen.
Bereiten Sie HDTMA vor, indem Sie 0365 Gramm zu 20 Milliliter doppelt entionisiertem Wasser hinzufügen, und legen Sie die Lösung in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius, um die Löslichkeit zu fördern. Fügen Sie 0302 Gramm CAS zu 25 Milliliter doppelt entionisiertem Wasser hinzu, während Sie sanft mit einem sterilen magnetischen Rührstab rühren. Dann fügen Sie fünf Milliliter eines Molaren-Eisenchlorid-Hexahydrat summieren, um die 25 Milliliter der CAS-Lösung zu bewegen, während sie weiterhin sanft rühren.
Fügen Sie nun langsam die 20 Milliliter HDTMA-Lösung in die eisenige CAS-Komplexlösung unter sanftem Rühren ein. Bereiten Sie die Pufferlösung vor, indem Sie 15,12 Gramm PIPES unter sanftem Rühren in 375 Milliliter doppelt entionisiertes Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert mit fünf Mol-Natriumhydroxid auf 6,8 ein.
Dann Wasser hinzufügen, um das Volumen auf 450 Milliliter zu bringen. Nun fügen Sie fünf Gramm Agarose in die Lösung. Autoklaven Sie die PIPES-Pufferlösung und die Eisen-CAS-Komplexlösung bei 121 Grad Celsius für 30 Minuten.
Fügen Sie die gesamte Lösung der eisenigen CAS-Komplexlösung sorgfältig in den gesamten PIPES-Puffer im Biosicherheitsschrank ein, nachdem jeder von ihnen autoklaviert wurde. Die Mischlösung bei 50 Grad Celsius in ein Wasserbad geben. Legen Sie nun ein steriles Reagenzboot in den sterilen Sand im Biosicherheitsschrank und erhitzen Sie sich auf 50 Grad Celsius.
Übertragen Sie den eisernen CAS-Komplex-Agar auf das Boot, dann schnell aliquot 100 Mikroliter zu jedem Brunnen einer klaren flachen sterilen 96-Well-Mikroplatte. Bereiten Sie 800 Mikromolar Pyoverdin Standard in zuvor vorbereitet modifizierten M9 Medium. Verdünnen Sie die Lösung in 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 mikromolare Lösungen.
Fügen Sie EDTA zu 500 Millilitern zuvor vorbereitetem modifiziertem M9-Medium hinzu, um den 3,2 Millimolaren-EDTA-Standard vorzubereiten. Verdünnen Sie diese Lösung in 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 und 6,25 Mikromolar-Lösungen. Um eine Standardkurve zu erzeugen, fügen Sie 100 Mikroliter jeder Konzentration von Pyoverdin und EDTA zu getrennten Brunnen einer 96-Well-Mikroplatte hinzu, die 100 Mikroliter Eisen CAS-Komplex-Agarmedium enthält.
Erstellen Sie doppelte technische Replikationen jeder Konzentration. Fügen Sie auch leere Brunnen mit nur M9 hinzu. Messen Sie mit einem Mikroplattenleser die Absorption nach einer, sechs und 24 Stunden Inkubation bei 22 Grad Celsius und verwenden Sie Absorptionsmessungen, um Standardkurven zu erzeugen. Waschen Sie die Probenahmegeräte mit 22 Mikron Filter doppelt entionisiertem Wasser gefolgt von 70% Ethanol und wischen Sie mit Papiertüchern.
Führen Sie die Wäsche vor der Probenahme und zwischen den Proben durch, um die sterile Technik aufrechtzuerhalten und die Kreuzkontamination zu reduzieren. Nachdem Sie Pflanzengewebe ausgehoben und eine kleine Wurzelkugel von Pflanzen im Feld ausgegraben haben, legen Sie die Wurzelkugel in eine separate beschriftete Plastiktüte zur Probentrennung im Labor. Legen Sie alle Proben direkt auf Eis und halten Sie bei vier Grad Celsius, bis Proben für den Siderophor-Produktionstest verarbeitet werden.
Trennen Sie wurzelassoziierte Bodenproben in Massen, lose gebundene Rhizosphärenböden und eng gebundene Rhizosphärenböden. Nehmen Sie dazu die Wurzelkugeln aus den Säcken und schütteln Sie den Boden sanft von der Wurzelkugel ab. Abgeschüttelter Boden, zusammen mit dem Boden im Beutel, umfassen die Masse Boden.
Dies ist der lose gebundene Rhizosphärenboden. Generieren Sie eng gebundene Rhizopshere-Boden, indem Sie Wurzeln mit der eng gebundenen Probe nehmen und in ein Zentrifugenrohr geben. Fügen Sie 30 Milliliter doppelt entionisiertes Wasser und Wirbel für zwei bis drei Minuten hinzu.
Entfernen Sie die Wurzeln, um die eng gebundene Rhizosphäre Boden Verdünnung zu erhalten. Homogenisieren Sie jede Bodenprobe innerhalb des Probenbeutels, indem Sie den Boden so weit wie möglich mischen und drehen, ohne den Beutel zu öffnen. Nachdem jede Probe gründlich gemischt wurde, aliquot und hängen zwei Gramm jeder Bodenprobe in 20 Milliliter modifiziertem M9-Medium in einem sterilen 50 Milliliter Zentrifugenrohr.
Verdünnen Sie die Probe und versiegeln Sie das Rohr dann mit einem sterilen Schaumstoffstecker, um die Belüftung zu ermöglichen. Für eng gebundene Rhizosphärenproben zwei Milliliter der Rhizosphäre-Bodenschlämme zu 20 Milliliter modifiziertem M9-Medium in einem sterilen 50 Milliliter Zentrifugenrohr hinzufügen. Verdünnen Sie die Probe und versiegeln Sie das Rohr dann mit einem sterilen Schaumstoffstecker, um die Belüftung zu ermöglichen.
Um die Gewebeprobe vorzubereiten, sterilisieren Sie die Wurzel, schießen und körnen Sie mit 70% Ethanol. Mazeration zwei Gramm frisches Gewebe in 20 Milliliter modifiziertem M9-Medium mit einem Mixer auf hoch für 30 Sekunden. Dann die Probe in ein steriles 50-Milliliter-Zentrifugenrohr geben, verdünnen und versiegeln Sie das Rohr mit einem sterilen Schaumstoffstopfen.
Um die Siderophorproduktion durch Eisenbegrenzung anzureichern, brüten die 50 Milliliter Zentrifugenrohre bei Raumtemperatur und schütteln bei 160 U/min. Bei 24, 48 und 72 Stunden nach Beginn der Anreicherungskultur, entfernen Sie eine Milliliter-Subsamples aus den Anreicherungsrinnen mit steriler Technik. Zentrifugieren Sie die Subsamples bei 10.000 mal G für eine Minute in zwei Milliliter-Zentrifugenröhren, um die Zellen zu pelletisieren.
Mit steriler Technik, fügen Sie 100 Mikroliter des Überstandes zu einer 100-Mikroliter-Lösung aus Eisen CAS-Komplex Agar in doppelter oder dreifacher Injektion innerhalb der Mikroplatte. Fügen Sie auch 100 Mikroliter steriles M9 Medium als Rohlinge hinzu. Dann bebrüten die Platte bei 28 Grad Celsius.
Jede Platte sollte vor der Platzierung im Inkubator versiegelt und mit Folie bedeckt werden. Den restlichen Überstand und das Pellet für jede Probe in sein eigenes steriles Zwei-Milliliter-Zentrifugenrohr aussetzen. Fügen Sie 400 Mikroliter steriles Glycerin in jede Probe Überstandrohr und wieder aufhängen das Pellet, um Glyzerinbestände zu schaffen.
Einfrieren Sie den Bestand bei minus 80 Grad Celsius für eine spätere Analyse. Messen Sie die Absorption bei sechs, 24, 48 und 72 Stunden bei einer Wellenlänge von 420 Nanometern. Ein von Pseudomonas fluorescens biosynthetisiertes Pyoverdingemisch wurde als Standard zur Interpretation und Quantifizierung der Absorption von Proben in Proben der Pyoverdinäquivalenz in Mikromolaren verwendet.
Hier wird der Zusammenhang zwischen der Absorption bei 420 Nanometern und der Anfangskonzentration von Pyoverdin gezeigt. Die Siderophoraktivität der 72-Stunden-Anreicherung wurde bei einer Inkubation von 48 Stunden bewertet, um den Einfluss des Genotyps und des Probentyps auf die Siderophor-Isolierung zu bestimmen. Die Siderophoraktivität in Massenbodenproben war relativ gering und zeigte keine Unterschiede zwischen dem Weizengenotyp, aus dem der Massenboden entnommen wurde.
Die Anreicherungen von lose gebundenem Boden, der vom Genotyp 725 isoliert wurde, wiesen jedoch eine größere Siderophorproduktion auf als die lose gebundenen Böden aus Madsen und 727, aber nicht aus Lewjain. Umgekehrt wurde die Siderophorproduktion in Anreicherungen aus eng gebundenem Boden nicht stark vom Genotyp beeinflusst. Anreicherungskulturen des Getreidegewebes ergaben unabhängig vom Genotyp eine relativ geringe Siderophorproduktion.
Anreicherungen von Lewjain-Triebgewebe hatten eine signifikant niedrigere Siderophorproduktion als die anderen Genotypen, und 725 Triebgewebekulturen führten zu einer variableren Siderophorproduktion. Der größte Unterschied in der Siderophoraktivität wurde in Wurzelgewebeanreicherungskulturen beobachtet, wo 725 mehr als 200% größere Siderophoraktivität aufwiesen als alle anderen Genotypen. Einer der belastendsten Aspekte bei der Ausführung des Protokolls ist die Aufrechterhaltung aseptischer Bedingungen, während die vielen Schritte zur Erzeugung der CAS-Eisen-Agar-Mikroplatte und die Prüfung von Proben für Siderophor-Aktivität abgeschlossen werden.
Eine breite Palette chromatographischer oder DNA-basierter Techniken kann entweder auf den eigentlichen Mikrotiterbrunnen oder die Glycerinkonservenkultur für weitere biochemische Tests oder genetische Charakterisierung und metabolische Modellierung angewendet werden. Durch die Verwendung dieses Protokolls kann die Siderophoraktivität später mit bestimmten Organismen in Verbindung gebracht werden, die für diese Aktivität verantwortlich sind, oder anschließend als Mechanismus für größere ökologische Auswirkungen ins Visier genommen werden. Dieses Protokoll könnte leicht geändert werden, um die Siderophorproduktion in Anreicherungskulturen zu bewerten, die aus Proben aus anderen Umweltkompartimenten wie Luft, Wasser und Sedimenten gewonnen werden.
