Proteases são um dos grupos mais investigados de suportes biomoleculares em pesquisas acadêmicas e industriais. Seu papel poderoso em vários processos fisiológicos e patológicos faz deles um alvo proeminente no campo da descoberta de drogas também. Em relação à sua pesquisa intensiva, há uma grande e contínua demanda para o desenvolvimento de plataformas de ensaios de teste de fluorescência protease compatíveis com o tempo e economia de custos.
Aqui, gostaríamos de introduzir um protocolo para a aplicação de uma plataforma de ensaio de fluorescência compatível com triagem de alta throughput baseada em separação usando substratos de fusão recombinante fundidos de mTurquoise2 e mApple. Além disso, gostaríamos de demonstrar um método para a renaturação em gel dos substratos e os fragmentos de decote das amostras de ensaio após a desnaturação do SDS-PAGE também. Todos os experimentos são realizados no exemplo do vírus HIV-1 protease.
A expressão plasmídeo carrega a sequência de codificação de uma tag de afinidade hexa histadina e uma proteína de fusão de ligação maltosa seguida por um local de controle de cálcio protease vírus de gravação, um de clonagem, e uma proteína fluorescente terminal C. Linearizar a expressão plasmid por endonucleases de restrição de PacI e NheI. Realize o ressarcimento do codon Escherichia coli otimizado para frente e para trás primers oligonucleotídeos que codificam para a sequência substrato de interesse e flanco por extremidades coesas paci e nhei.
Realize a inserção dos primers resalados na expressão linearizada plasmid por ligadura. Para expressão proteica, transforme células competentes BL21(DE3)pela mistura de ligadura. As proteínas fluorescentes estarão no mesmo quadro de leitura aberta com as etiquetas de fusão n-terminal somente após uma ligadura bem sucedida.
Poucos dias após a transformação, as colônias contendo a expressão plasmid codificando o local de interesse inserido do decote mostrarão fluorescência visível com ou mesmo sem o uso de um transilluminator azul Dark Reader. Adicione 10 microliters glicerol estoque das células BL21(DE3)carregando a expressão codificação plasmida para a sequência de perfil de decote de interesse a cinco mililitros LB médio contendo 100 microgramas por ampicillina mililitro em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Incubar a suspensão a 37 graus durante 15 horas enquanto treme constantemente.
Transfira cinco mililitros de cultura bacteriana para 50 mililitros frescos lb contendo 100 microgramas por ampicillina mililitro. Cresça as células a 37 graus a uma absorção de 0,6 a 0,8 a 600 comprimentos de onda de nanômetros. Neste ponto, induzir a expressão proteica pela adição de IPTG.
Daqui em diante, incubar a cultura por três horas a 37 graus enquanto treme continuamente. Após a incubação, transfira 25 mililitros da cultura em tubos limpos de centrífugas de 50 mililitros, e colmeia as células por centrifugação. Descarte o supernasce e armazene as pelotas de células bacterianas a menos 70 graus por pelo menos uma hora.
As pelotas celulares contendo as proteínas fluorescentes expressas com sucesso mostram claramente uma fluorescência com ou mesmo sem o uso de um transilluminator azul Dark Reader. Coloque a pelota de célula congelada no gelo e deixe descongelar por 15 minutos. Adicione dois tampão de lise mililitros à pelota e suspenda as células.
A seguir, adicione o inibidor de protease, liberte a suspensão por lyzozyme e DNase, suspenda as células e incuba a suspensão no gelo por 15 minutos. Transfira duas vezes uma suspensão mililitro em tubos de microcentrifuge de 1,5 mililitro e sonicize as suspensões por três minutos em rodadas de 10 segundos de sônica e cinco segundos de quebra. Centrifugar os tubos a 10.000 g por 20 minutos em temperatura ambiente.
As células bacterianas limpas contendo o substrato fluorescente de interesse mostram fluorescência visível com ou mesmo sem o uso de um transilluminator azul Dark Reader. O procedimento do ensaio de protease desenvolvido começa com a preparação das amostras de ensaio. Em primeiro lugar, os substratos recombinantes são incubados com as contas magnéticas de afinidade, e as contas magnéticas anexadas ao substrato, abreviadas como SAMBs, são formadas.
Os SAMBs são lavados várias vezes, e finalmente a solução de estoque SAMB é preparada pela alíquota da qual as amostras de ensaio são criadas. As reações são iniciadas pela adição da solução protease. Após o decote pela protease, os fragmentos protelíticos são liberados no supernatante.
A reação é interrompida pela separação das contas magnéticas do tampão de reação que contém os produtos fluorescentes de decote e a enzima. Os supernantes são aplicados nos poços de uma placa de microtiter e a fluorescência é determinada pela fluormetria. As curvas de calibração são geradas usando substratos fluorescentes purificados resolvidos em cada amortecedor de ensaio.
A concentração dos produtos de decote fluorescente do terminal C e também do substrato aplicado nas amostras de ensaio são determinadas com base na inclinação das curvas de calibração. Coloque o tubo contendo contas de níquel-NPA magnéticas novas ou recicladas em um concentrador de partículas magnéticas. As contas podem grudar na parede e/ou na tampa do tubo de microcentrífuga.
Portanto, vire o concentrador de cabeça para baixo em todas as direções para garantir que todas as contas sejam coletadas. Remova o supernaspe e descarte-o. Adicione 1,8 mililitros de tampão de lise às contas e remova os tubos fechados do concentrador.
Suspenda as contas no tubo tremendo e/ou virando o tubo de cabeça para baixo até que as contas fiquem completamente homogêneas. Coloque os tubos de volta no concentrador e vire-os de cabeça para baixo em todas as direções para garantir que todas as contas sejam coletadas. Abra o tubo e descarte o supernasal.
Adicione o lise estéril de bactérias limpas contendo o substrato de interesse e remova o tubo fechado do concentrador. Vire os tubos de cabeça para baixo até que as contas fiquem completamente homogêneas e gire os tubos por rotador, lentamente, em temperatura ambiente por 30 minutos. Os SAMBs mostram fluorescência visível com ou mesmo sem usar um transilluminator azul Dark Reader.
Lave os SAMBs três vezes por 1,8 mililitro 1%Tween 20, tampão de lavagem e tampão de decote. Adicione tampão de decote aos SAMBs lavados para criar uma solução de estoque SAMB. Se usar tubos de microcentrifuge de proteína de dois mililitros de baixa ligação, o volume do tampão de decote aplicado é de até 1,9 mililitros.
Após a adição do buffer, não agite ou vire o tubo de cabeça para baixo. Feche o tubo e remova-o do concentrador. Prepare tubos de microcentrifuge de proteína de dois mililitros para as amostras de ensaio.
Suspenda a solução de estoque SAMB até que seja completamente homogênea e meça a quantidade de substrato a ser analisada nas reações, transferindo imediatamente a solução de estoque SAMB para os frascos de amostra. Recomenda-se que o volume da solução de estoque SAMB seja transferida para 25 a 300 microliters, mas deve ser definido de acordo com o projeto experimental individual. Coloque os tubos de amostra contendo as suspensões SAMB aliquoted no concentrador.
Remova cuidadosamente o supernatante dos SAMBs e descarte-o. Remova os tubos do concentrador e adicione cuidadosamente o tampão de reação aos SAMBs. O volume do buffer de reação adicionado deve ser calculado de acordo com o design experimental individual, mas recomenda-se definir o volume final da mistura de reação entre 50 e 150 microliters se forem usados tubos de dois mililitros.
Feche as tampas dos tubos. Agora, as amostras estão prontas para serem iniciadas. Adicione a solução enzimática às amostras de reação.
Misture as contas cuidadosamente movendo os tubos e coloque os tubos imediatamente no termoshaker já tremendo. No caso de amostras em branco de substrato e amostras de controle de substrato, adicione tampão de decote e tampão de elução, respectivamente. Trinta segundos antes do fim da incubação, retire a amostra do termoshaker e gire-a prontamente.
Coloque o tubo sobre o concentrador e deixe o tubo ficar em pé por 15 segundos. A coleta dos SAMBs pode ser facilitada movendo ligeiramente o concentrador para frente e para trás. Abra a tampa e transfira cuidadosamente o sobrenante para uma placa ou um novo tubo.
Não toque nas contas concentradas pela ponta da pipeta. O supernatante coletado das amostras de controle do substrato e as amostras de reação com alto grau de decote podem mostrar fluorescência visível com ou mesmo sem o uso de um transilluminator azul Dark Reader. Transfira duas vezes 30 microliters dos supernantes de amostra separados em uma microplacão preto de meia área.
Meça a fluorescência por fluorímetro usando os filtros apropriados de acordo com a proteína fluorescente aplicada. Para a purificação dos substratos fluorescentes, prepare a mesma solução descrita anteriormente e descarte o sobrenante. Adicione 400 a 600 tampão de eluição de microliters aos SAMBs e gire os tubos por rotador lentamente à temperatura ambiente por cinco minutos.
Transfira o eluato para novos tubos de microcentrifuuge de baixa ligação de proteínas. Ele mostra fluorescência claramente visível com ou sem o uso de um transilluminator azul Dark Reader. Após a purificação, troca de buffer e a medição do teor de proteína, prepare uma diluição serial dupla em pelo menos oito etapas, tanto a partir das soluções de substrato resolvidos com tampão de decote e tampo- tampão, utilizando elução ou tampão de decote para diluição, respectivamente.
Transfira 30 microliters de cada ponto de diluição para uma microplacão preta de meia área. Meça a fluorescência por fluorímetro utilizando as mesmas configurações que foram aplicadas na medição dos supernacantes da amostra de ensaio. Como exemplo para o processamento de dados, as medidas cinéticas dependentes do substrato da protease hiv-1 foram realizadas em uma forma fundida de mTurquoise2 do substrato recombinante codificando o local do decote entre a matriz e as proteínas capsid no precursor natural da proteína gapic.
Plote os valores de intensidade de fluorescência relativa corrigida contra a concentração molar dos substratos purificados, resolva o tampão de decote ou eluição e realize a regressão linear. Calcule a concentração molar dos produtos de decote terminal C nas amostras de reação usando a inclinação da curva de calibração baseada em tampão de decote. Calcule também a concentração de substrato aplicado nas amostras de reação com base na concentração molar do substrato elucido nas amostras de controle do substrato usando a inclinação da curva de calibração baseada em tampão de eluição.
Os valores de velocidade iniciais foram calculados a partir da quantidade dos fragmentos de decote terminal C e, em seguida, plotados contra a concentração de substrato aplicado. Também os parâmetros cinéticos foram determinados pela análise de regressão não linear de Michaelis-Menten. Depois de realizar o ensaio baseado em contas magnéticas níquel-NTA, os supernantes de ensaio podem ser analisados por eletroforese de gel de poliacrilamida também.
No entanto, além da análise das amostras de ensaio, também é possível analisar os substratos fluorescentes purificados e/ou os fragmentos de decote após a digestão em solução. Para digestão em solução, aliquo os substratos fluorescentes purificados a serem digeridos dissolvidos em tampão de decote em tubos de microcentrífa de 1,5 mililitro, e adicione a solução enzimácica às amostras. Incubar as amostras de acordo com o desenho experimental e terminar as reações pelo procedimento da preparação da amostra para PAGE.
Para a preparação da amostra não desabitado, misture as amostras a serem analisadas com tampão de carga de amostra não dedesnaturação que não contenha nenhum agente redutor. No caso da preparação da amostra desnaturada, misture as amostras a serem analisadas com tampão de carga de amostra desnaturação e exponha as amostras ao tratamento térmico a 95 graus por 10 minutos. Aplique as amostras não desnaturadas e desnaturadas nos poços do gel de poliacrilamida SDS e realize a eletroforese.
Remova o de gel do módulo de execução. Amostras não desnaturadas já são visíveis no gel mesmo a olho nu ou com o transilluminator azul Dark Reader. Para detectar os componentes fluorescentes das amostras desnaturadas no transilluminador, realize a renaturação em gel lavando o SDS do gel.
Adicione 100 mililitros de água destilada ao gel e enxágue pelo menos por 30 minutos. Visualize as proteínas fluorescentes colocando o gel não manchado no transilluminador azul Dark Reader. As proteínas de fusão fluorescente recombinantes foram projetadas para serem usadas como substratos em ensaios proteolíticos.
Após o decote pela protease no local específico do decote, o fragmento de decote fluorescente terminal C é liberado e sua fluorescência pode ser detectada. Seu uso em ensaios baseados em contas magnéticas níquel-NTA e a detecção fluorescente pela análise PAGE foram otimizados usando protease HIV-1. No entanto, a plataforma de ensaio desenvolvida também pode ser adequada para outros proteases.
As curvas de calibração dos substratos purificados resolvidos em tampão de decote ou eluição são ilustradas nos exemplos da forma fundida mTurquoise2 e mEYFP do substrato recombinante codificando o lado do decote entre a matriz e as proteínas capsidas da proteína anecóica natural do HIV. O ensaio baseado em contas magnéticas níquel-NTA é uma ferramenta útil para examinar o efeito da concentração de substrato na velocidade de reação e, assim, também torna possível a determinação dos parâmetros cinéticos enzimáticos como Vmax e Km. O diagrama A mostra um resultado ideal obtido após uma análise realizada com sucesso da atividade dependente de substrato em um substrato fundido por mApple.
Em contraste, o diagrama B apresenta um resultado sub-ideal onde a homogeneização insuficiente da solução de estoque SAMB causa problemas na configuração das concentrações adequadas de substrato, enquanto o término inadequado das amostras de reação resulta em erros relativamente altos. O ensaio também fornece uma ferramenta adequada para a realização de estudos de tempo-curso e inibitórios. O diagrama A demonstra a dependência do tempo do decote proteolítico da protease HIV-1 em um substrato fundido por mEYFP, enquanto o diagrama B representa o efeito inibidor do amprenavir na reação do decote.
A partir dos dados obtidos pelo estudo inibidor, tanto a concentração enzimática ativa quanto a constante inibitória podem ser determinadas. O ensaio também pode ser otimizado para estudar a dependência da atividade enzimápica no pH, pois é representado pelo diagrama A no exemplo da protease do vírus da etch do tabaco. O diagrama B indica uma limitação do ensaio por pH e mostra que o pH neutro ou ligeiramente alcalino é totalmente compatível com as medidas, enquanto o pH ácido facilita a dissociação espontânea dos substratos da superfície das contas magnéticas.
A presente figura mostra os substratos fluorescentes intactos purificados, os fragmentos fluorescentes de decote terminal C, gerados pela digestão em solução pelo HIV-1 protease. Os componentes fluorescentes podem ser detectados no gel de poliacrilamida contendo SDS por transilluminação de luz azul logo após a eletroforese se as condições de não desnaturação foram aplicadas durante a preparação da amostra. As diferentes proteínas fluorescentes podem ser diferenciadas com base em sua cor.
Após o ensaio à base de contas magnéticas, as proteínas fluorescentes não desnaturadas na amostra de supernantes também podem ser detectadas no gel pela iluminação UV. Em contraste, se as condições de desnaturação forem aplicadas durante a preparação da amostra, as proteínas desnaturadas não podem ser detectadas no gel imediatamente após a PÁGINA do SDS. No entanto, as proteínas fluorescentes desnaturadas podem ser parcialmente renaturadas pela remoção do SDS do gel e se tornam detectáveis.
Portanto, a PÁGINA SDS é seguida pelo procedimento de renaturação em gel. A capacidade de renaturação das proteínas fluorescentes torna sua identificação possível não apenas com base em sua fluorescência, mas também com base em seu peso molecular. Aqui demonstramos o protocolo para o uso de nossa plataforma de ensaios fluorescentes de protease fluorescentes recentemente desenvolvida.
Demonstramos o uso desse sistema no exemplo de estudos cinéticos enzimáticos sobre protease do HIV-1. Usamos formas fundidas de mTurquoise e mApple do substrato de ensaio recombinante, que continha a sequência do local de decote do protease. Além da análise fluormétrica, as amostras de ensaio também foram posteriormente analisadas pela SDS PAGE.
Demonstramos que as proteínas fluorescentes desnaturadas podem ser parcialmente renaturadas no gel após a PÁGINA da SDS, que fornece identificação baseada em peso molecular e fluorescente do substrato e dos fragmentos proteolíticos.
