Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em biologia química e descoberta de drogas. Como, seu composto se liga à proteína alvo? As principais vantagens para esta técnica são que não há necessidade de desprendimento das células aderentes.
E a localização espacial pode ser determinada por imagens. Embora tenhamos aplicado este método em linhas celulares, também é possível aplicar este método a outros sistemas celulares, como culturas primárias e coculturas. Antes de semear as células, coloque placas de ensaio de imagem pretas de 384 poços em uma capa de cultura de tecido, e cubra as placas com papel alumínio antes de usar uma broca padrão para fazer três furos de 3,5 milímetros de diâmetro em ambas as extremidades de cada placa.
Quando as placas estiverem prontas, use técnica asséptica para lavar uma cultura celular A-431 com 5 a 10 mililitros de PBS. E incubar as células com dois mililitros de trippsina a 37 graus Celsius até que as células se desprendem. Após a contagem, dilui as células para 5 vezes 10 a 4ª células por mililitro em meio de cultura, e semeou 40 microliters de células para cada poço de cada placa de ensaio.
Agitando suavemente cada placa de um lado para o outro após a semeadura para garantir uma distribuição homogênea das células através dos fundos do poço. Para minimizar os efeitos da borda da placa, permita que as células se instalem na parte inferior das placas de ensaio por 20 minutos à temperatura ambiente na parte de trás do capô de fluxo laminar antes de colocar as placas em uma câmara umidificada personalizada por dois a três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia do experimento, use uma arruela de placa para aspirar o meio de cada poço.
E adicionar 30 microliters do composto de interesse na concentração experimental apropriada aos poços experimentais apropriados. Sele as placas de ensaio tratadas com compostos com vedações de placa respiráveis. E devolva as placas à incubadora de cultura celular por 30 minutos.
Para expor as células a um desafio de calor, primeiro coloque o banho de água à temperatura experimental apropriada, e coloque uma placa fictícia não selada contendo o mesmo volume de médio por bem como a placa de ensaio no banho, juntamente com um termômetro termopar para monitorar a temperatura dentro dos poços. Quando a temperatura experimental apropriada for atingida, remova o selo respirável de cada placa de ensaio e resseque as placas com uma folha de alumínio adesiva apertada para garantir que nenhuma água vaze nos poços durante seu aquecimento subsequente no banho de água. Mantendo os furos perfurados dentro da moldura da placa acessíveis.
Coloque as placas de ensaio e uma nova placa falsa no banho de água, com os fundos das placas inclinadas em direção à superfície da água para forçar qualquer ar restante sob as placas, e comece a monitorar a temperatura da nova placa falsa. Um aquecimento uniforme da placa é fundamental para o desempenho do ensaio. Tome cuidado para colocar o prato no banho de água de tal forma que não há bolhas de ar presas por baixo.
Após três minutos, esfrie imediatamente os pratos em um segundo banho de água de água em temperatura ambiente por cinco minutos antes de sua análise. Para a imagem das células, adicione primeiro 10 microlitradores de 16% de paraformaldeído diretamente às placas de ensaio para uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente. Ao final do período de fixação, lave as células com 300 microliters de PBS na lavadora de placas e adicione 20 microliters de 0,1%NP40 para uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente.
No final da incubação, lave as células como demonstrado. E bloqueie as células com 15 microliters de 1%de albumina de soro bovino, ou BSA, por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, use a arruela de placa para aspirar o soro de bloqueio, e adicione 10 microliters do anticorpo primário de interesse aos poços apropriados para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente.
No final da incubação, lave cada poço com 300 microliters de PBS, e rotule as células com 10 microliters do anticorpo secundário apropriado por uma hora à temperatura ambiente protegida da luz. Para a coloração nuclear das células, adicione 10 microliters de um corante nuclear apropriado a cada poço por 10 minutos à temperatura ambiente. E lave as células em PBS como demonstrado.
Rotule as células com 10 microliters de máscara celular por poço por 30 minutos à temperatura ambiente. Seguido por uma última lavagem com PBS. Em seguida, distribua 60 microliters de PBS frescos para cada poço, e sele as placas com papel alumínio até a imagem.
Para visualizar as células, capture quatro imagens por poço em um imager de alto conteúdo usando os canais fluorescentes apropriados sob o objetivo de 10 vezes usando foco automático a laser automatizado e aplique binning durante a aquisição. Em seguida, armazene as imagens como arquivos de ponto-tiff de escala de cinza de 16 bits, juntamente com os metadados. O reconhecimento de anticorpos não deve ser interrompido por alterações conformais na proteína alvo que podem ser induzidas pela ligação de ligante.
Por exemplo, BIRB796 tem uma taxa de longo desconto, e a quantificação do engajamento de destino só é possível aplicando uma etapa de recuperação de antígeno. Este experimento representativo da curva de agregação térmica para células tratadas com compostos de controle positivos e negativos ilustra faixas típicas de estabilização proteica após o tratamento das células com os compostos em várias temperaturas. Aqui, um típico experimento de impressão digital de dose isthermal é mostrado para demonstrar faixas representativas de estabilização proteica em resposta a diferentes doses de composto experimental.
A aplicação de desafios térmicos isotérmicos para triagem composta para identificar novos aglutinantes da proteína alvo permite a análise de um grande número de compostos em uma única concentração ao mesmo tempo, antes da impressão digital de dose isotérmica dos hits para confirmar a estabilização proteica alvo. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as condições experimentais exatas, como o comprimento e a temperatura do desafio térmico, afetam a potência observada dos compostos. Não se esqueça que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso.
E precauções, como seguir as diretrizes institucionais de segurança, devem ser sempre tomadas durante a realização desse procedimento.
