Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der chemischen Biologie und Arzneimittelforschung zu beantworten. Wie, bindet Ihre Verbindung an das Zielprotein? Die Hauptvorteile für diese Technik sind, dass es keine Anforderung der Ablösung der anhaftenden Zellen gibt.
Und die räumliche Lokalisierung kann durch Bildgebung bestimmt werden. Obwohl wir diese Methode in Zelllinien angewendet haben, ist es auch möglich, diese Methode auf andere Zellsysteme wie Primärkulturen und Kokulturen anzuwenden. Bevor Sie die Zellen säen, legen Sie schwarze 384-Well-Bild-Assay-Platten in eine Gewebekulturhaube und bedecken die Platten mit Aluminiumfolie, bevor Sie mit einem Standardbohrer drei Löcher mit 3,5 MillimeterDurchmesser an beiden Enden jeder Platte herstellen.
Wenn die Platten fertig sind, verwenden Sie aseptische Technik, um eine A-431-Zellkultur mit 5 bis 10 Milliliter PBS zu waschen. Und die Zellen mit zwei Milliliter Ntrypsin bei 37 Grad Celsius bebrüten, bis sich die Zellen lösen. Nach dem Zählen, verdünnen Sie die Zellen auf 5 mal 10 bis die 4. Zellen pro Milliliter in Kulturmedium, und säen 40 Mikroliter Zellen zu jedem Brunnen jeder Assayplatte.
Sanft schütteln jede Platte von Seite zu Seite nach der Aussaat, um eine homogene Verteilung der Zellen über die Brunnenböden zu gewährleisten. Um Plattenkanteneffekte zu minimieren, lassen Sie die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur im hinteren Teil der laminaren Strömungshaube an der Unterseite der Assayplatten absetzen, bevor sie die Platten zwei bis drei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in eine benutzerdefinierte Befeuchtungskammer legen. Verwenden Sie am Tag des Experiments eine Plattenscheibe, um das Medium aus jedem Brunnen zu aspirieren.
Und fügen Sie 30 Mikroliter der Verbindung von Interesse in der entsprechenden experimentellen Konzentration zu den entsprechenden experimentellen Brunnen. Versiegeln Sie die compoundbehandelten Assayplatten mit atmungsaktiven Plattendichtungen. Und geben Sie die Platten für 30 Minuten an den Zellkultur-Inkubator zurück.
Um die Zellen einer Hitzeherausforderung auszusetzen, stellen Sie zunächst das Wasserbad auf die entsprechende Versuchstemperatur und legen Sie eine unversiegelte Dummyplatte mit dem gleichen Mediumvolumen sowie die Assayplatte in das Bad, zusammen mit einem Thermoelementthermometer zur Überwachung der Temperatur in den Brunnen. Wenn die entsprechende Versuchstemperatur erreicht ist, entfernen Sie die atmungsaktive Dichtung von jeder Assayplatte und verschließen Sie die Platten mit einer dichten Klebe-Aluminiumfolie, um sicherzustellen, dass bei der anschließenden Erwärmung im Wasserbad kein Wasser in die Brunnen austritt. Halten Sie die gebohrten Löcher innerhalb des Plattenrahmens zugänglich.
Legen Sie die Assay-Platten und eine neue Dummy-Platte in das Wasserbad, wobei die Böden der Platten zur Wasseroberfläche gewinkelt sind, um die verbleibende Luft unter den Platten zu erzwingen, und beginnen Sie, die Temperatur der neuen Dummyplatte zu überwachen. Eine gleichmäßige Erwärmung der Platte ist entscheidend für die Assay-Leistung. Achten Sie darauf, die Platte in das Wasserbad zu legen, so dass keine Luftblasen darunter eingeschlossen sind.
Nach drei Minuten die Platten sofort in einem zweiten Wasserbad mit Raumtemperaturwasser für fünf Minuten vor ihrer Analyse abkühlen. Um die Zellen abzubilden, fügen Sie zunächst 10 Mikroliter 16% Paraformaldehyd direkt zu den Assayplatten für eine 20-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Am Ende der Fixierungsphase die Zellen mit 300 MikroliterPBS auf der Plattenscheibe waschen und 20 Mikroliter 0,1%NP40 für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur hinzufügen.
Waschen Sie am Ende der Inkubation die Zellen, wie gezeigt. Und blockieren Sie die Zellen mit 15 Mikrolitern 1%Rinderserumalbumin, oder BSA, für eine Stunde bei Raumtemperatur. Als nächstes verwenden Sie die Plattenscheibe, um das blockierende Serum zu aspirieren, und fügen Sie 10 Mikroliter des primären Antikörpers von Interesse zu den entsprechenden Brunnen für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu.
Am Ende der Inkubation jeden Brunnen mit 300 Mikroliter PBS waschen und die Zellen mit 10 Mikrolitern des entsprechenden Sekundärantikörpers für eine Stunde bei Lichtschutz beschriften. Für die kerntechnische Färbung der Zellen 10 Mikroliter eines geeigneten Kernfarbstoffs für 10 Minuten bei Raumtemperatur zu jedem Brunnen hinzufügen. Und waschen Sie die Zellen in PBS, wie gezeigt.
Beschriften Sie die Zellen mit 10 Mikrolitern Zellmaske pro Brunnen für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Gefolgt von einer letzten Wäsche mit PBS. Dann geben Sie 60 Mikroliter frische PBS an jeden Brunnen und versiegeln Sie die Platten mit Aluminiumfolie bis zur Bildgebung.
Um die Zellen abzubilden, erfassen Sie vier Bilder pro Brunnen auf einem hochauflösenden Imager mit den entsprechenden Fluoreszenzkanälen unter dem 10-fachen Ziel mithilfe des automatisierten Laser-Autofokus und wenden Sie während der Erfassung Binning an. Speichern Sie dann die Bilder zusammen mit den Metadaten als 16-Bit-Graustufen-Dot-Tiff-Dateien. Die Antikörpererkennung sollte nicht durch konforme Veränderungen des Zielproteins gestört werden, die durch Ligandenbindung induziert werden können.
Beispielsweise hat BIRB796 eine Long-Off-Rate, und die Quantifizierung des Zielengagements ist nur durch Anwenden eines Antigen-Abrufschritts möglich. Dieses repräsentative thermische Aggregationskurvenexperiment für Zellen, die mit positiven und negativen Kontrollverbindungen behandelt werden, veranschaulicht typische Proteinstabilisierungsbereiche nach der Behandlung der Zellen mit den Verbindungen bei verschiedenen Temperaturen. Hier zeigt ein typisches isothermes Dosis-Wirkungs-Fingerabdruckexperiment repräsentative Bereiche der Proteinstabilisierung als Reaktion auf verschiedene Dosen experimenteller Wirkstoffe.
Die Anwendung von isothermen Wärmeherausforderungen für das zusammengesetzte Screening zur Identifizierung neuartiger Bindemittel des Zielproteins ermöglicht die Analyse einer großen Anzahl von Verbindungen in einer einzigen Konzentration gleichzeitig, bevor isotherme Dosis-Antwort-Fingerabdrücke der Treffer zur Bestätigung der Zielproteinstabilisierung durchgeführt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die genauen experimentellen Bedingungen, wie die Länge und Temperatur der Hitzeherausforderung, die beobachtete Potenz der Verbindungen beeinflussen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd extrem gefährlich sein kann.
Und bei der Durchführung dieses Verfahrens sollten stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie z. B. die Befolgung institutioneller Sicherheitsrichtlinien.
