Este método pode ter resposta a perguntas rápidas na construção de técnicas planejadas de fenotipagem em escala de micron. Como partículas de varredura micro-CT, e o método de análise fenotípica para feixes vasculares de milho. A principal vantagem dessa técnica é fornecer novas e eficazes formas de investigar traços fenotípicos do feixe vascular de milho por preparação de amostras, tomografia computadorizada e análise de protocolos.
As implicações dessa técnica ampliam as aplicações da microcsagem ordinária e outras ciências vegetais. Este protocolo pode ser facilmente modificado para acomodar outros materiais vegetais, como a desidratação do procedimento de secagem. Para começar, colete o caule, a folha e a raiz de plantas de milho frescos.
E dividi-los em três grupos de amostras. Em seguida, use uma lâmina cirúrgica para cortar um segmento de um a 1,5 centímetros da haste média internade. Usando a mesma lâmina cirúrgica, corte um segmento de 1/2 a dois centímetros da largura máxima da folha ao longo da direção vertical com a veia principal.
Use a lâmina cirúrgica para cortar um segmento de 1/2 centímetro da raiz do solo. Depois disso, mergulhe os segmentos amostrais na solução FAA por pelo menos três dias. Desidratar os segmentos amostrais por 30 minutos em seis gradientes sequenciais de etanol.
Em seguida, coloque os materiais da planta nas cestas de amostra correspondentes. Transfira rapidamente as cestas para a célula amostral de um sistema de secagem de ponto crítico de dióxido de carbono. Coloque os materiais secos da planta em um tubo de centrífuga de 50 mililitros com dois gramas de iodo sólido.
Em seguida, coloque os tubos em um quarto à prova de luz por quatro a cinco horas. Primeiro, defina os parâmetros de varredura da tomografia de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, defina as faixas de digitalização de acordo com os diferentes tamanhos e volumes dos materiais da planta utilizados.
Em seguida, ajuste os tamanhos dos pixels de imagem da seguinte forma: Dois micrômetros para a raiz. 6,77 micrômetros para a haste. E 10 micrômetros para a folha.
Para reconstruir imagens fatiadas, use o software de construção de imagens para converter os dados de CT brutos em imagens de corte ct com resolução 2K. Primeiro, especifique o tipo de órgão para inicializar diferentes pipelines de algoritmos no software de imagem automática. Em seguida, clique no botão parâmetros do método e selecione a haste de milho, ou folha de milho, na primeira caixa de goteamento.
Clique no botão de gerenciamento de dados, defina o diretório de trabalho e importe todas as imagens fatiadas no diretório. Em seguida, selecione imagens únicas ou multi-fatias nos pipelines de imagem. Em seguida, determine o tamanho do pixel da imagem.
Escolha o botão parâmetros do método e digite o tamanho do pixel da imagem no item de edição apropriado. Depois disso, clique no botão de computação fenotipagem para extrair automaticamente traços fenotípicos dos feixes vasculares para todas as imagens de fatia selecionadas. Clique no botão de análise estatística para produzir os resultados dessas análises como um texto ou arquivo CSV.
Importe as imagens reconstruídas das raízes do milho e determine os parâmetros de espaço precisos. Em seguida, use a ferramenta gaussiana recursiva para suavizar as imagens e melhorar a qualidade da imagem. Ajuste os parâmetros limiares para realizar a segmentação 3D de vasos metaxilem.
Isso criará um rótulo de cor uniforme para cada recipiente metaxylem conectado. Em seguida, melhore e identifique os vasos de metaxílem interativamente usando morfologia bitwise, e operações de enchimento de inundações. Em seguida, realize uma visualização de volume e reconstrução superficial dos vasos.
Por fim, use a ferramenta de estatísticas da máscara para contar e medir os traços fenotípicos de um vaso nos níveis 2D e 3D. Utilizando a análise descrita no protocolo, foram computados os traços fenotípicos dos feixes vasculares em hastes de milho, folhas e raízes. Foi criada uma visualização 3D gerada dos vasos raiz e metaxíleo, utilizando-se os resultados de segmentação, reconstrução e visualização de volumes.
O protocolo adequado de preparação da amostra melhora significativamente a qualidade de emissão de microCs para haste de milho, folha e raiz. Com o gasoduto automático emitir para extrair rapidamente os traços fenotípicos dos feixes vasculares para o caule de milho e folha. E a configuração e emite varredura de processamento para analisar os traços fenotípicos 3D dos feixes vasculares para raiz de milho.
Esta técnica fornece uma maneira prática para a qualificação precisa e rápida fenotípica e identificação de feixes vasculares de milho.
