Name: protocol for producing three-dimensional infrared video of freezing in plants
Uploaded: 2018-09-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela USDA financiamento in-house.

1. preparação
<ol><li>Reunir os equipamentos, materiais e software para gravar e processar o vídeo da planta congelando.<ol>
<li>Começar um congelador programável, definindo o interruptor de alimentação para nae definir a temperatura de 0 ° C. Programa do freezer para chegar-8 ° C a 1 ° C/h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloca um 6 semanas de idade morango planta com flores de 2-5 que foi cultivada em um recipiente de 1 L para o congelador.</li>
	<li>Configurar 2 câmeras IR (por exemplo, as câmeras FLIR T620) usando as cintas de fixação e um pequeno bloco de madeira para produzir o ângulo correto de convergência das lentes. Nota: A distância ideal para o espaço do centro das lentes das 2 câmeras é considerada para ser o mesmo que a distância entre os olhos1 ou cerca de 7 cm.</li>
	<li>Monte as duas câmeras para um jack de laboratório de 10 x 10 cm e posição do jack no freezer perto o suficiente para a planta, para permitir que a imagem a ser focado. Ajustar as câmeras na vertical e na horizontal para que a mesma parte da planta é visível de ambas as câmaras. Use o jack para a posição de ambas as câmaras verticalmente de modo que as 2 imagens contêm uma porção do solo e toda a planta.</li>
	<li>Conecte as 2 câmeras usando um conector USB para as saídas de USB no computador.</li>
	<li>Ligue as 2 saídas de ar condicionado em ambas as câmaras para permitir um monitoramento contínuo das plantas.</li>
</ol>2. computador e configuração do Software para gravação
<ol><li>Abrir 2 janelas (1 janela para cada câmera) do software, clicando duas vezes no ícone para o software da câmera IR 2 x. Siga as instruções no menu de ajuda para conectar a câmera à esquerda na janela da esquerda e a câmera bem na janela da direita. Nota: Os detalhes para utilizar o software podem ser acessados através do menu ajuda. Uma paleta monocromática é o mais adequada para este exemplo, devido a necessidade de utilizar a matiz de vermelho e azul para a renderização em 3D.</li>
	<li>Abra o software de captura de tela clicando duas vezes no ícone para o programa. Ajuste o quadro de captura clicando e arrastando o quadro então inclui ambas as câmeras para permitir que uma captura de tela de ambas as câmeras simultaneamente. Nota: A tela, capturando o fluxo de vídeo de ambas as câmeras simultaneamente é crucial, porque permite uma sincronização perfeita de pontos de vista de esquerda e direita.</li>
	<li>Grave o vídeo em incrementos de 3-h para um processamento mais fácil no software de processamento de vídeo. Nota: É impossível saber exatamente quando a planta irá congelar, então é importante para registro, por algum tempo antes do evento de congelamento. A opção de gravar em segmentos é uma característica deste software, por isso é recomendado que este está definido para gravar para 3h. O software irá automaticamente salvar a gravação de 3-h e então começar uma nova gravação. O arquivo para cada gravação 3-h automaticamente será dada uma sequência numérica após o nome. Cada arquivo de vídeo será de 10 a 20 GB, então certifique-se de que o espaço suficiente está disponível em um disco rígido para múltiplos arquivos deste tamanho.</li>
	<li>Inicie o programa de congelador, selecionando executar no menu de controlador e começar a captura de tela. Em seguida, pressione o botão Rec na janela. Certifique-se de que o contorno mostrando a região da tela sendo capturada fica vermelho.</li>
	<li>Gravar a planta de morango congelamento até-8 ° C e mantenha a temperatura do congelador por 1h.</li>
	<li>Elevar a temperatura do congelador a 2 ° C/h até o congelador é a + 2 ° C. Pare a gravação. Nota: O total de tempo de congelamento é 14 h.</li>
	<li>Converta o arquivo (s) de interesse do. MP4 formato. mov usando um software de conversão de arquivo. Nota: neste caso, um arquivo único 3h contendo 1 ou mais eventos de congelamento será usado.</li>
</ol>3. processamento de vídeo usando um Software de imagem de vídeo
Nota: Software de imagem de vídeo será usado neste exemplo. Tutoriais sobre como usar o software estão disponíveis online. Este exemplo irá assumir um conhecimento básico do software. A compreensão de termos como "composição", "camada" e "render queue", bem como os vários painéis e como manipulá-los, presume-se.
<ol><li>Clique duas vezes em qualquer lugar dentro do painel de projeto para importar o arquivo. mov de interesse para o software de imagem e arraste o arquivo para a composição ícone na parte inferior do painel do projeto. Em seguida, salve o projeto para a mesma pasta que contém os vídeos originais. Nota: O vídeo gravado será visível no painel de visualização.</li>
	<li>Clique no ícone na parte inferior da janela de visualização da Região de interesse e, usando o cursor, delinear apenas a gravação da câmera à esquerda.</li>
	<li>Arraste o mesmo vídeo. MOV para o ícone de composição para criar uma segunda composição do vídeo mesmo. Repita a etapa 3.3, mas desta vez, utilize o cursor para selecionar apenas a câmera direita.</li>
	<li>Selecione a composição > Crop Comp a região de interesse para a vista esquerda. Repita isto para a vista direita. Renomeie cada composição para indicar o que é esquerda e direita.</li>
	<li>Destacar a composição à esquerda clicando sobre ele e, no menu principal no topo, selecionando composição > Add para processar a fila.</li>
	<li>Na fila de render, clique no Módulo de saída e verifique se que o vídeo será processado como um vídeo (por exemplo, um vídeo do QuickTime). Clique no botão Configurações de renderização , para reduzir a resolução para permitir um processamento mais rápido. Clique em saída para, nome a Esquerda de morangoe salve-o na mesma pasta como a gravação original e o projeto. Clique em salvare, em seguida, clique no botão processar na parte superior direita do painel de render.</li>
	<li>Repita a etapa 3.6 para a composição de Morango direito .</li>
	<li>Clique duas vezes no painel de projeto e importar os vídeos Morango esquerda e Direita de morango que só eram prestados.</li>
	<li>Destacar os dois vídeos e arraste-os para o ícone de composição na parte inferior do painel do projeto. Na tela pop-up pedindo a Duração ainda, insira 3 com 5 zeros para uma duração de 3-h. Nota: Ambos os vídeos, precisamente sincronizados, será no painel de projeto, mas apenas o vídeo de nível superior no painel composição será visível.</li>
	<li>Para ver a outra imagem, clique no globo ocular pouco para desativar a camada. Pressione Control/W para permitir um controle rotacional das imagens no painel de visualização, usando o cursor. Usando o cursor e a camada superior, clicando em ligar e desligar, ajuste o aspecto rotacional de topo ou a vista inferior para certificar-se de que ambas as imagens estão no mesmo plano rotacional. Em seguida, ajuste o X - e Y-plano diretamente dentro da sub-rotina de óculos 3D.</li>
	<li>Destacar a camada superior do painel composição e selecione efeito > perspectiva > óculos 3D no menu no topo. Nota: Os parâmetros para o 3D óculos efeito irá aparecer dentro do painel de controle.</li>
	<li>No painel de controle, clique na caixa à direita da "esquerda vista" — se o painel de controle não é separado do painel de projeto, clique na guia painel de controle na parte superior do painel do projeto. Lista os 2 vídeos no painel composição em um menu drop-down, destacar o vídeo na lista para a exibição de"esquerda". Repita este passo para "vista direita".</li>
	<li>Na caixa à direita da vista 3D, selecione Vermelho azul LR.</li>
	<li>Usando óculos vermelho e azul, inspecione a exibição no painel de projeto. Se vista 3D parece ser incorreta, tente clicar em Trocar esquerda-direita. Ajuste a convergência de cena e o Alinhamento Vertical para eliminar qualquer tensão os fantasmas e olho.</li>
	<li>Quando o aspecto 3D do vídeo é aceitável, destaque a composição, clicando sobre ela e selecione a composição > Add para processar a fila como foi feito na etapa 3.7. Processar o vídeo para a mesma pasta que os outros arquivos no projeto. Nota: Este arquivo será bastante grande. Uma vez que o arquivo foi processado, pode ser re-processado para um tamanho de arquivo menor, usando o software de processamento de vídeo.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Geng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+display+technologies.">Three-dimensional display technologies.</a> Advances in Optics and Photonics. 5, 456-535 (2013).</li><li>Ceccardi, T. L., Heath, R. L., Ting, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-temperature+exotherm+measurement+using+infrared+thermography.">Low-temperature exotherm measurement using infrared thermography.</a> HortScience. 30, 140-142 (1995).</li><li>Wimmer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> History of thermal imaging, Security Sales and Integration. , (2011).</li><li>Wisniewski, M., Lindow, S. E., Ashworth, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+of+ice+nucleation+and+propagation+in+plants+using+infrared+video+thermography.">Observations of ice nucleation and propagation in plants using infrared video thermography.</a> Plant Physiology. 113, 327-334 (1997).</li><li>Kuprian, E., Tuong, T., Pfaller, K., Livingston, D. P., Neuner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+supercooling+of+reproductive+shoots+is+enabled+by+structural+ice+barriers+being+active+despite+an+intact+xylem+connection.">Persistent supercooling of reproductive shoots is enabled by structural ice barriers being active despite an intact xylem connection.</a> Public Library of Science ONE. 11, e0163160 (2016).</li><li>Livingston, D. P., Tuong, T. D., Murphy, J. P., Gusta, L., Wisniewski, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-definition+infrared+thermography+of+ice+nucleation+and+propagation+in+wheat+under+natural+frost+conditions+and+controlled+freezing.">High-definition infrared thermography of ice nucleation and propagation in wheat under natural frost conditions and controlled freezing.</a> Planta. 247, 791-806 (2017).</li><li>Boyles, R. P., Raman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+climate+patterns+and+trends+in+North+Carolina+(1949-1998).">Analysis of climate patterns and trends in North Carolina (1949-1998).</a> Environment International. 29 (2-3), 263-275 (2003).</li><li>Poling, E. B., Poling, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+Cold+Events.">Managing Cold Events.</a> A Growers' Guide to Production, Economics and Marketing. , 75-97 (2015).</li><li>Hacker, J., Neuner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice+porpagaion+in+plants+visualized+at+the+tissue+level+by+infrared+differential+thermal+analysis+(IDTA).">Ice porpagaion in plants visualized at the tissue level by infrared differential thermal analysis (IDTA).</a> Tree Physiology. 27, 1661-1670 (2007).</li><li>He, J. Q., Harrison, R. J., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+3D+imaging+system+for+strawberry+phenotyping.">A novel 3D imaging system for strawberry phenotyping.</a> Plant Methods. 13, 93-101 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Duas câmeras IR são necessárias para este protocolo, e eles devem visar o assunto de ângulos ligeiramente diferentes1. Isso exigirá que as lentes para ser de 5 a 8 cm de distância, mas ambos devem visar o mesmo lugar sobre o assunto a ser filmado. Acho que as lentes de câmera de 2 como uma espécie de substituto para os olhos do observador. A câmera esquerda é análoga do olho esquerdo e a direito câmera no olho direito. O software de pós-processamento vai matizar a imagem à esquerda p...

Apesar de viver em um mundo de três dimensões físicas, pesquisadores muitas vezes são limitados a relatar observações visuais em 2D. Embora imagens 2D são geralmente suficientes para transmitir informações importantes, esta falta de informação sobre profundidade restringe nossa capacidade de perceber e compreender a complexidade dos objetos do mundo real. 1
Esta deficiência em informações sobre a profundidade fornecido um incentivo para produzir vídeos 3D principalmente na indústria cinematográfica comercial desde o início dos anos 19001. No entanto, gerando informações claras 3D em ainda imagens e vídeo é prejudicada pelas complexidades envolvidas na produção dessas imagens. A abordagem mais simples para gerar o filme em 3D baseia-se em princípios utilizados em fotografia estereoscópica. Fotografia estereoscópica utiliza duas imagens do mesmo objeto de ângulos ligeiramente diferentes que transmite uma imagem 3D no cérebro. Para que isso seja possível, cada olho deve olhar apenas para sua respectiva imagem (ou seja, o olho esquerdo na imagem à esquerda e o olho direito na imagem à direita). Desde que os olhos não naturalmente o fará, arnês estereoscópico foi concebido para tornar este possível1. Vários estereoscópico visualização técnicas, bem como polarização entrelaçado, tempo-multiplexados e técnicas de cabeça-montagem de exposição, têm sido utilizados durante o desenvolvimento de filmes 3D, mas o método de entrelaçamento de cor ou anaglyph usando vermelho e verde (ou ciano) óculos é uma das técnicas mais simples e menos caras. Para uma revisão abrangente da imagem em 3D e as diversas técnicas envolvidas, consulte a revisão por Geng1.
Monitoramento de congelamento em plantas usando a termografia IR é baseado no princípio que quando a água congela, ele deve desistir de energia interna2. Esta energia é sob a forma de calor, que é detectável na região do espectro eletromagnético de IR. Câmeras capazes de gravar a energia IR estiveram no uso desde 19293. O primeiro relatório publicado usando tecnologia IR ao filme congelando em plantas é de Cecardi et al . 2, mas a resolução da câmera usada torna difícil determinar com precisão o tecido onde o congelamento é iniciado. Wisniewski et al 4 determinados sites mais precisos de nucleação de gelo em várias espécies de plantas, usando uma câmera de resolução mais alta. Como a tecnologia usada em Termografia IR melhorada, imagens de alta resolução levaram a descobertas como entraves ao congelamento5 e a exacta localização celular de formação de gelo6.
Uma dificuldade em filmar temas em IR é causada por pequenas diferenças nas temperaturas. Isso fará com que a maioria dos objetos no campo de visão de ser uma cor semelhante, tornando-se difícil determinar precisamente qual objeto (s) é (é) congelamento. Isso pode ser importante quando determinar a ordem de congelar-se em tecidos específicos, tais como folhas ou raízes em trigo6. Se o vídeo IR de plantas congelamento poderia ser fotografado em 3D, a precisão de determinar qual parte da planta está frio em um certo ponto no tempo poderia ser melhorada.
Morango é das culturas em determinadas áreas dos Estados Unidos em que as temperaturas de congelação são de considerável preocupação para os produtores. Em algumas condições de crescimento, é comum para as flores de morango aparecer 2-3 semanas antes da média na primavera passada congelar. Um evento de congelamento pode ocorrer tão tarde quanto junho em algumas áreas dos Apalaches7 e geralmente resultados na morte da flor. Anti-gelo, portanto, é crítico para congelam de produtores de morango em áreas sujeitas a estes eventos. Produtores de morango na Carolina do Norte, por exemplo, geadam-proteger, em média, entre 4-6 eventos de geada antes de florescer e 1-2 difícil congela durante o início florescem período8. Para ajudar a desenvolver genótipos morangos que são mais tolerantes a congelar, é importante compreender os vários aspectos do congelamento, como os sítios de nucleação de gelo e propagação para outras partes da planta. Termografia IR fornece meios eficazes para solucioná-los.
Aqui, usamos o morango para ilustrar uma técnica para gravação de eventos de congelação em 3D usando o método anáglifo. Morango é adequado para este exemplo, porque as folhas e flores são amplamente distribuídas no espaço 3D e podem ser difícil diferenciar quando visto em vídeos 2D de infravermelhos.

<table><tbody><tr><td>T620 Infrared Camera and software</td><td>FLIR</td><td>55903-5122</td><td>2 cameras are needed. Software works only on a Windows-based computer</td></tr><tr><td>After Effects</td><td>Adobe</td><td>15.0.1.73</td><td>Post-Production Video Editing Software</td></tr><tr><td>Bandicam</td><td>Bandisoft</td><td>4.1.2.1385</td><td>Screen Capture Software</td></tr><tr><td>Laboratory Scissor Jack&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Eisco</td><td>CH0642A</td><td>Steel Platform 13X15 cm</td></tr><tr><td>Fastening Strap</td><td>Velcro</td><td>90441</td><td>To hold camera on jack.&amp;nbsp; Should be at least 60cm long by 2cm wide</td></tr><tr><td>Media Converter</td><td>iSkysoft</td><td>10.0.6</td><td>Software to convert mp4 files to .mov&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

protocol for producing three-dimensional infrared video of freezing in plants

Congelamento em plantas pode ser monitorado usando termografia infravermelha de (IR), porque quando a água congela, desprende calor. No entanto, problemas com contraste de cor fazem 2-dimensões (2D) infravermelhas imagens um pouco difícil de interpretar. Visualização de uma imagem de IR ou o vídeo de plantas congelando em 3 dimensões (3D) permitiria uma identificação mais rigorosa dos sítios para nucleação de gelo, bem como a progressão de congelamento. Neste artigo, vamos demonstrar um meio relativamente simples para produzir um vídeo 3D infravermelho de uma planta de morango gelada. Morango é uma cultura economicamente importante que está sujeita a inesperada Primavera congelar eventos em muitas áreas do mundo. Uma compreensão precisa do congelamento em morango irá fornecer as criadores e produtores com formas mais econômicos para evitar qualquer dano às plantas durante condições de congelamento.
A técnica envolve um posicionamento de duas câmeras IR em ângulos ligeiramente diferentes para filmar o gelado de morango. Os dois fluxos de vídeo serão precisamente sincronizados usando um software de captura de tela que os registros de ambas as câmeras simultaneamente. As gravações serão importadas para o software de imagem e processadas utilizando uma técnica anaglyph. Usando óculos vermelho e azul, o vídeo 3D será mais fácil para determinar o local exato da nucleação de gelo nas superfícies da folha.

Surpreendentemente, o vídeo de IR da planta de morango gelada (Supplemental vídeo 1) indicou que nem todas as folhas/flores congelou ao mesmo tempo. Ambas as folhas e flores individualmente congelaram em temperaturas diferentes, mas as folhas congelaram mais cedo do que as flores e a uma temperatura mais elevada. Além disso, o congelamento começou nas folhas, mas não necessariamente na mesma posição em cada folha. Enquanto estes resultados não têm sido descritos ...

Watch this Scientific Journal Video about Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants at JoVE.com

Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

Aqui, apresentamos um protocolo para uma planta de morango gelada em 3 dimensões de imagem. Duas câmeras de infravermelhas, posicionadas em ângulos ligeiramente diferentes são usadas para produzir um vídeo de anaglyph azul e vermelho para observar o congelamento da planta em 3 dimensões.

Protocolo para a produção de vídeo infravermelho tridimensional de congelamento em plantas

Freezing in plants can be monitored using infrared (IR) thermography, because when water freezes, it gives off heat. However, problems with color contrast ...

protocol-for-producing-three-dimensional-infrared-video-freezing

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Environment

6.1K visualizações.  United States Department of Agriculture and North Carolina State University. Aqui, apresentamos um protocolo para uma planta de morango gelada em 3 dimensões de imagem. Duas câmeras de infravermelhas, posicionadas em ângulos ligeiramente diferentes são usadas para produzir um vídeo de anaglyph azul e vermelho para observar o congelamento da planta em 3 dimensões.

Vídeo: Protocol for Producing Three-Dimensional Infrared Video of Freezing in Plants

High-resolution, High-speed, Three-dimensional Video Imaging with Digital Fringe Projection Techniques

Digital fringe projection (DFP) techniques provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;Like the human eyes and brain, DFP uses triangulation between matching points in two views of the same scene at different angles to compute depth.&#160;However, unlike a stereo-based method, DFP uses a digital video projector to replace one of the cameras1. The projector rapidly projects a known sinusoidal pattern onto the subject, and the surface of the subject distorts these patterns in the camera&#8217;s field of view. Three distorted patterns (fringe images) from the camera can be used to compute the depth using triangulation.
Unlike other 3D measurement methods, DFP techniques lead to systems that tend to be faster, lower in equipment cost, more flexible, and easier to develop.&#160;DFP systems can also achieve the same measurement resolution as the camera.&#160;For this reason, DFP and other digital structured light techniques have recently been the focus of intense research (as summarized in1-5). Taking advantage of DFP, the graphics processing unit, and optimized algorithms, we have developed a system capable of 30&#160;Hz 3D video data acquisition, reconstruction, and display for over 300,000 measurement points per frame6,7.&#160;Binary defocusing DFP methods can achieve even greater speeds8.
Diverse applications can benefit from DFP techniques. Our collaborators have used our systems for facial function analysis9, facial animation10, cardiac mechanics studies11, and fluid surface measurements, but many other potential applications exist.&#160;This video will teach the fundamentals of DFP techniques and illustrate the design and operation of a binary defocusing DFP system.

This video describes the fundamentals of digital fringe projection techniques, which provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;It also demonstrates the design and operation of a high-speed binary defocusing system based on these techniques.

De alta resolução, de alta velocidade, de imagens de vídeo tridimensional com Franja Digital Técnicas de Projeção

Digital fringe projection (DFP) techniques provide dense 3D measurements of dynamically changing surfaces.&#160;Like the human eyes and brain, DFP uses ...

Engenharia

The Use of High-resolution Infrared Thermography (HRIT) for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

The Use of High-resolution Infrared Thermography HRIT for the Study of Ice Nucleation and Ice Propagation in Plants

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

O uso de alta resolução Termografia Infravermelha (Hrit) para o Estudo da Ice Ice nucleação e propagação de plantas

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events ...

Ambiente

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop cultivars against environmental stresses. An experimental protocol is presented for RGB and hyperspectral imaging of root systems. The approach uses rhizoboxes where plants grow in natural soil over a longer time to observe fully developed root systems. Experimental settings are exemplified for assessing rhizobox plants under water stress and studying the role of roots. An RGB imaging setup is described for cheap and quick quantification of root development over time. Hyperspectral imaging improves root segmentation from the soil background compared to RGB color based thresholding. The particular strength of hyperspectral imaging is the acquisition of chemometric information on the root-soil system for functional understanding. This is demonstrated with high resolution water content mapping. Spectral imaging however is more complex in image acquisition, processing and analysis compared to the RGB approach. A combination of both methods can optimize a comprehensive assessment of the root system. Application examples integrating root and aboveground traits are given for the context of plant phenotyping and plant physiological research. Further improvement of root imaging can be obtained by optimizing RGB image quality with better illumination using different light sources and by extension of image analysis methods to infer on root zone properties from spectral data.

An experimental protocol is presented for assessment of soil grown plant root systems with RGB and hyperspectral imaging. Combination of RGB image time series with chemometric information from hyperspectral scans optimizes insights into plant root dynamics.

RGB e raiz Spectral Imaging para fenotipagem de planta e pesquisa fisiológica: instalação Experimental imagem e protocolos

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

Um método simples para criação de imagens Arabidopsis Folhas Usando Perfluorodecalin como um meio de imagem infiltrativas

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Biologia

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Longo prazo, de alta resolução de imagem Lapse Confocal Tempo de<em&gt; Cotilédone Arabidopsis</em&gt; Epiderme durante a germinação

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ binding proteins that initiate Ca2+ signaling cascades. However, we still know little about how stimulus specific Ca2+ signals are generated. The specificity of a Ca2+ signal may be attributed to the sophisticated regulation of the activities of Ca2+ channels and/or transporters in response to a given stimulus. To identify these cellular components and understand their functions, it is crucial to use systems that allow a sensitive and robust recording of Ca2+ signals at both the tissue and cellular levels. Genetically encoded Ca2+ indicators that are targeted to different cellular compartments have provided a platform for live cell confocal imaging of cellular Ca2+ signals. Here we describe instructions for the use of two Ca2+ detection systems: aequorin based FAS (film adhesive seedlings) luminescence Ca2+ imaging and case12 based live cell confocal fluorescence Ca2+ imaging. Luminescence imaging using the FAS system provides a simple, robust and sensitive detection of spatial and temporal Ca2+ signals at the tissue level, while live cell confocal imaging using Case12 provides simultaneous detection of cytosolic and nuclear Ca2+ signals at a high resolution.

Measuring Spatial and Temporal Ca2+ Signals in Arabidopsis Plants

Ca2+ signaling regulates diverse biological processes in plants. Here we present approaches for monitoring abiotic stress induced spatial and temporal Ca2+ signals in Arabidopsis cells and tissues using the genetically encoded Ca2+ indicators Aequorin or Case12.

Medindo espacial e temporal Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sinais em Arabidopsis Plantas

Developmental and environmental cues induce Ca2+ fluctuations in plant cells. Stimulus-specific spatial-temporal Ca2+ patterns are sensed by cellular Ca2+ ...

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.

This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.

Microscopia de Luz Folha de fluorescência das raízes das plantas que crescem na superfície de um gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

Um método versátil para a montagem de Arabidopsis deixa para Intravital imagem de lapso de tempo

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

Identificação de novos reguladores de transpiração vegetal por triagem de imagens térmicas em larga escala em Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In addition, autofluorescence attributed to chlorophyll hampers the observation of fluorescent proteins in plants. For a long time, various clearing reagents have been used to make plants transparent. However, conventional clearing reagents diminish fluorescent signals; therefore, it has not been possible to observe the cellular and intracellular structures with fluorescent proteins. Reagents were developed that can clear plant tissues by removing chlorophyll while maintaining fluorescent protein stability. A detailed protocol is provided here for the optical clearing of plant tissues using clearing reagents, ClearSee (CS) or ClearSeeAlpha (CSA). The preparation of cleared plant tissues involves three steps: fixation, washing, and clearing. Fixation is a crucial step in maintaining the cellular structures and intracellular stability of fluorescent proteins. The incubation time for clearing depends on the tissue type and species. In Arabidopsis thaliana, the time required for clearing with CS was 4 days for leaves and roots, 7 days for seedlings, and 1 month for pistils. CS also required a relatively short time of 4 days to make the gametophytic leaves of Physcomitrium patens transparent. In contrast, pistils in tobacco and torenia produced brown pigment due to oxidation during CS treatment. CSA reduced the brown pigment by preventing oxidation and could make tobacco and torenia pistils transparent, although it took a relatively long time (1 or 2 months). CS and CSA were also compatible with staining using chemical dyes, such as DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) and Hoechst 33342 for DNA and Calcofluor White, SR2200, and Direct Red 23 for the cell wall. This method can be useful for whole-plant imaging to reveal intact morphology, developmental processes, plant-microbe interactions, and nematode infections.

Here, a method is described for making plant tissues transparent while maintaining the stability of fluorescent proteins. This technique facilitates deep imaging of cleared plant tissues without physical sectioning.

Limpeza Óptica de Tecidos Vegetais para Imagem de Fluorescência

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Protocolo para a produção de vídeo infravermelho tridimensional de congelamento em plantas

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo