Name: spectral reflectometric microscopy on myelinated axons in situ
Uploaded: 2018-07-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo Instituto de ciência básica (IBS-R015-D1) e pelo programa de pesquisa de ciência básica através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da educação (2017R1A6A1A03015642).

Todos os procedimentos cirúrgicos foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Sungkyunkwan e institucional Cuidado Animal.
1. preparação da amostra
Nota: Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes de manipulação de animais. Realizar todo o desempenho cirúrgico em uma sala dedicada para procedimentos cirúrgicos. Luvas e batas cirúrgicas estéreis devem ser usadas por todo o pessoal na sala cirúrgica em todos os momentos.
<ol><li>
Fixação de tecidos
	<ol>
<li>Prepare duas seringas de 10 mL que cada um preenchido com tampão fosfato salino (PBS) e paraformaldeído 4% (PFA) em PBS.</li>
		<li>Anestesiar um rato de 7-12-semanas, (C57BL/6J ou quaisquer linhas de rato com ambos os sexos) através da administração de uma mistura de zoletil e xilazina (1:1, 20 mg/kg cada) ou um regime alternativo de anestesia adequada (por exemplo, mistura de 80 mg/kg de ketamina e 10 mg/kg xilazina) com uma injeção intraperitoneal.</li>
		<li>Uma vez que o mouse alcançou um plano cirúrgico da anestesia (use o método de pitada-resposta do dedo do pé), expor o coração cortando a pele e a caixa torácica com uma tesoura.</li>
		<li>Cortar o átrio direito com uma tesoura pequena para drenar o sangue e perfundir a solução de PBS e PFA sequencialmente através do ventrículo esquerdo com uma agulha (taxa de perfusão = 4 mL/min, volume = 10 mL de cada solução). Nota: O rato torna-se duro, se o procedimento for concluído com êxito. O uso de pomada ou esterilização não é necessário que o procedimento é terminal. O procedimento de fixação pode ser ignorado. No entanto, esta etapa é recomendada para minimizar deformações estruturais, incluindo danos nos tecidos mecânicos e inchaço axonal isquêmico. Para mais detalhes sobre a fixação de tecidos, consulte o artigo de Gage, et al . G. J. 10
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação da fatia cerebral
	<ol>
<li>Decapitar o mouse com uma tesoura cirúrgica através da ventral do tórax e abdômen.</li>
		<li>Remova o periósteo usando uma tesoura devidamente pequena até expor totalmente o crânio e o couro cabeludo.</li>
		<li>Quebrar o osso frontal e cortar o crânio ao longo da sutura sagital do osso occipital usando tesouras pequenas com cuidado para não danificar o cérebro.</li>
		<li>Remova cuidadosamente o crânio e a dura-máter sequencialmente utilizando pinça fina.</li>
		<li>Extraia o cérebro usando uma colher de plástico macia, tomando cuidado para não danificar o tecido.</li>
		<li>Lave e mergulhe o cérebro extraído em uma solução PFA 4% durante 30 min a 4 ° C.</li>
		<li>Corte o cérebro fixo em 100-150 µm seções usando um vibratome. Nota: Para obter mais detalhes sobre a preparação do tecido, consulte o artigo por Segev et al 11. para os procedimentos subsequentes, o tecido deve ser cortado em seções mais fino que a espessura do espaçador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montagem da fatia cerebral
	<ol>
<li>Prepare lâmina de 1 vidro e 2 copos de tampa quadrados (22 × 22 × 0,17 mm) para cada pedaço de tecido.</li>
		<li>Cortar um dos copos de tampa quadrados em meia (duas peças retangulares) usando um cortador de vidro.</li>
		<li>Anexe os dois dos copos de capa cortados ao meio, usando uma super cola no vidro do slide. Nota: O espaço entre os dois copos cortados ao meio deve ser ligeiramente maior que o tamanho da fatia do tecido.</li>
		<li>Colher a fatia do cérebro usando um pincel ou uma pipeta e colocar o tecido no vidro entre o espaçador do slide. Tome cuidado para não dobrar o tecido.</li>
		<li>Dispense 100 μL de PBS sobre a superfície do tecido.</li>
		<li>Coloque o outro vidro tampa quadrado em cima do tecido. Evite a inclusão de bolhas de ar durante esta fase.</li>
		<li>Selo em torno do vidro tampa usando um esmalte (ou alternativamente apropriados adesivos) para evitar a evaporação de PBS e contaminação por poeira durante a sessão de imagens subsequente. Nota: O experimentador pode fazer uma pausa nesta fase.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. calibração
<ol><li>Ligue o microscópio pelo menos 1h antes da imagem latente para permitir a estabilização térmica do laser de origem (ver Tabela de materiais). Em seguida, ativar o software para fazer a varredura espectral (ver Tabela de materiais) e clique no botão adquirir no topo do GUI (Figura 3a).
</li>
	<li>Ative o obturador de software para o laser de luz branca (WLL) e tubo fotomultiplicador (PMT) (Figura 3a).</li>
	<li>Selecione o modo de xyΛ na lista drop-down no Modo de aquisição, em seguida, o modo de entrada de laser é automaticamente alterado de % constante para Poder constante. Desmarque a caixa de seleção do Movimento automático SP. E em seguida, defina a janela espectral do laser entrada para 470 – 670 nm e o tamanho de etapa espectral a 4 nm na Λ-excitação Lambda Scan configurações (Figura 3b).</li>
	<li>Defina o intervalo espectral de PGTO para 450-690 clicando duas vezes ou movendo a barra de ajuste para a faixa espectral (Figura 3C). Nota: Esta faixa espectral deve incluir a largura de banda completa da fonte de entrada.</li>
	<li>Seleccione uma lente objetiva de imersão de água, devidamente com uma abertura numérica elevada (at > 0,7) e dar qualquer valor ao poder de PGTO e laser para ativar o botão configuração AOBS e Live Scan . Mude o caminho óptico, verificando o reflexo na Configuração AOBS (Figura 3d).</li>
	<li>Montar um espelho de referência (ver Tabela de materiais) na fase de microscópio. A superfície do espelho deve ser enfrentada contra a lente objetiva. Se não é fácil de colocar o espelho no palco microscópio, vínculo um espelho na chapa plana (por exemplo, vidro de slide).</li>
	<li>Controle a fase de microscópio para alinhar o plano focal para a superfície do espelho.</li>
	<li>Ajustar o ganho de PGTO e a potência do laser, tendo em conta a gama dinâmica do detector e altere o modo de entrada de laser de constante por cento para Poder constante. Nota: Como é típico, um PGTO ganho de 500 (V) e um poder relativo do laser de 0.1% são utilizados em 570 nm.</li>
	<li>Confirme em um modo de cor pseudo para verificar que não há nenhuma saturação em toda a gama de comprimento de onda. Se for observada a saturação, reduzir a potência do laser (Figura 3a).</li>
	<li>Execute a aquisição de Lambda Scan .</li>
	<li>Retire o espelho do palco e repetir a mesma aquisição sem uma amostra para obter a referência escura (ou seja, deslocamento escuro).</li>
	<li>Salve os dados em um formato TIF Multistacked .</li>
</ol>3. aquisição de imagens provador
<ol><li>Coloque o tecido montado no palco do microscópio. Para aproximadamente alinhar o tecido para o plano focal da lente da objetiva, use o modo de fluorescência de campo amplo através de uma parte do olho.</li>
	<li>Com a Varredura de viver lá, controle a fase de microscópio para alinhar o plano focal para a região de interesse no tecido. Para evitar o ruído de fundo da lamínula, selecione a região alvo de pelo menos 15 μm de profundidade a partir da interface de vidro-tecido.</li>
	<li>Adquira a pilha de imagem espectral para a região de destino usando o mesmo procedimento como descrito nos passos 2.1 – 2.10.</li>
	<li>Salve os dados para o tecido e o deslocamento escuro em formato TIF Multistacked . Nota: O experimentador pode fazer uma pausa nesta fase.</li>
</ol>4. processamento e análise de imagem
<ol><li>Abra os dados espectrais (multistacked TIF) para o espelho de referência e o tecido cerebral no ImageJ.</li>
	<li>Selecione o ROIs (regiões de interesse) para as pilhas de imagem aberto — a área central para o segmento de uma fibra do axônio para o tecido cerebral e o espelho de referência.</li>
	<li>Adquirir os espectros brutos para o ROIs selecionado pela execução imagem → pilhas → eixo z traçar perfil no menu ImageJ.</li>
	<li>Abra os dados de deslocamento escuros, uma tomada para o espelho de referência e os outros que eram levados para o tecido cerebral.</li>
	<li>Adquirir os espectros para os deslocamentos escuros por execução imagem → pilhas → eixo z traçar perfil no menu ImageJ.</li>
	<li>Salve todos os espectros adquiridos usando as opções copiar e colar . Nota: Para a imagem latente do provador, uso do campo de imagem central para minimizar as aberrações ópticas fora do eixo é recomendado. As fibras de axônio podem ser estruturalmente heterogêneas ao longo de seu comprimento. Daí, selecionando o ROI em um segmento do axônio pequenos, tipicamente < 5 µm, para minimizar o volume parcial artefato é recomendado.</li>
</ol>5. linha de base correção e análise de sinal de provador
<ol><li>Subtrai os deslocamento espectros dos espectros do espelho de referência e os tecidos do cérebro.</li>
	<li>Normalize cada espectro dividindo-se a intensidade máxima do espectro.</li>
	<li>Dividir o espectro normalizado do axônio pelo espectro normalizado do espelho de referência e subtrair deslocamento DC do espectro normalizado.</li>
	<li>Medir a frequência de wavenumber encaixando o espectro adquirido para um sinusoidal curva (ver Tabela de materiais) e em seguida, converter o wavenumber adquirida a periodicidade por tomar recíproca.</li>
	<li>Converta a periodicidade wavenumber ao diâmetro do axônio, usando a equação na Figura 4C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+and+low-angle+x-ray+diffraction+studies+of+the+nerve+myelin+sheath.">Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath.</a> Journal of Cell Biology. 3, (1957).</li><li>Blaurock, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spaces+between+membrane+bilayers+within+PNS+myelin+as+characterized+by+X-ray+diffraction.">The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction.</a> Brain Research. 210, 383-387 (1981).</li><li>Shim, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes.">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).</li><li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., N&#228;gerl, U. 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L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+properties+of+the+myelin+sheath.">Anisotropic properties of the myelin sheath.</a> Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+nanoscale+optical+metrology+on+myelinated+axons+in+vivo.">Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo.</a> Nature Communication. 8, 1832 (2017).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> JoVE. (112), e54024 (2016).</li><li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Chang, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+expansion+microscopy.">Iterative expansion microscopy.</a> Nature Methods. 14, 593-599 (2017).</li><li>Polishchuk, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light-electron+microscopy+reveals+the+tubular-saccular+ultrastructure+of+carriers+operating+between+Golgi+apparatus+and+plasma+membrane.">Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane.</a> Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).</li></ol>

Os autores declaram interesses financeiros concorrentes: J. Kwon e M. Choi são inventores da patente pendente tecnologia descrito neste artigo.

Provador é uma nova modalidade de imagem livre de rótulo baseada na interferometria espectral, que pela primeira vez, oferece a informação de nanoescala em axônios mielinizadas ao vivo. No actual protocolo de aquisição, a resolução espacial para o diâmetro do axônio é da ordem de 10 nm. Além disso, o provador utiliza ordens de magnitude menor dose leve em comparação com outros microscopies de super-resolução; assim, é livre de fototoxicidade e fotobranqueamento. Provador forneceria uma nova avenida para estudar a dinâmica de nanoescala de axônios mielinizadas.
O protocolo descrito neste documento baseia-se na varredura espectral mediada pelo óptico e um detector de ponto (ou seja, pgto). Esta abordagem é vantajosa para aquisição de imagens espectrais do campo de visão total. No entanto, o tempo de resolução é limitado pela varredura espectral, que é tipicamente > 15 s em nossa configuração atual. Como alternativa, um espectroscópio de alta velocidade pode ser incorporado para permitir a observação em tempo real de um pequeno campo de visão de9. Este sistema pode ser construído simplesmente de um sistema convencional confocal comutando o pgto em um espectroscópio e adicionando um laser de luz branca. Para software de aquisição, a posição do galvanômetro precisa ser sincronizado com a execução do espectroscópio. No caso de uma único ponto de medição, a resolução temporal é determinada pela taxa de quadros do espectroscópio, que pode ser > 10 kHz para recentes espectroscópios ultra rápidos. Esta resolução temporal de milissegundo sub deve ser suficiente para a observação da dinâmica fisiológica os dendritos vivo namaioria. Provador baseia-se na reflexão da luz; Portanto, a luz detectada tem o mesmo comprimento de onda, como a luz de entrada. Pelo contrário, fluorescência envolve deslocamento espectral (ou seja, deslocamento de Stokes); assim, a luz detectada é espectralmente separável da luz de entrada. Esse recurso é útil para aquisição simultânea do provador e fluorescência na mesma amostra (como demonstrado na Figura 4). Absorção da luz entrada por um fluoróforo pode afetar a medição do provador, mas a absorção de coloração fluorescente típica é insignificante baixa (< 1%).
Digno de nota, provador tem uma limitada detecção angular gama-somente que os axônios quase paralelos ao plano de imagem podem ser detectados. Este limite angular do provador é em torno de 13,5 ° ± 9. Para adquirir a orientação específica de interesse, a amostra pode ser inclinada. No caso de espécimes transparentes como o embrião de zebrafish, a aquisição completa volumétrica pode ser possível, girando o espécime. Uma limitação prática adicional é que uma lamela montada numa amostra produz forte reflexão volta levando para a geração do sinal de fundo elevado, como mostrado na Figura 5; recomenda-se que esta região superficial deve ser evitada. Provador com base na luz visível tem comprimento de atenuação a 1/e de ~ 20 µm nos tecidos cerebrais. A profundidade de penetração de tecido típico para adquirir informações fiáveis espectrais é limitado a ~ 100 µm. mais profunda de imagem pode ser possível se for utilizada uma fonte de entrada mais. No final, a validação do provador é mostrada, comparando-o com microscopia de fluorescência de difração limitada. Aparentemente, isto tem sido insuficiente para avaliar a precisão de escala nanométrica (Figura 4). Técnicas recentes, como correlativa microscopia de luz e microscopia de expansão, que oferecem uma forma de validar o provador em nanoescala regime13,14.

No sistema nervoso dos mamíferos, mielina fornece condução nervosa rápida e integridade axonal por enwrapping as fibras de axônio com bainhas membranosas em várias camadas. É composta por sua estrutura várias camada alternando nanoescala fino-filmes compostas por membranas de plasma (~ 5 nm), citoplasma (~ 3 nm) e espaços extracelulares (~ 7 nm)1,2. Microscopia ótica, incluindo a recente microscopia de super-resolução, não são adequados para observar a dinâmica de mielina nanoescala devido a sua resolução insuficiente devido à difração óptica3,4,5. Apesar de microscopia eletrônica pode fornecer detalhes de nanostructure a mielina, não é compatível com os sistemas biológicos vivos devido a preparações altamente invasivo amostra envolvendo fixação química e,ultrasectioning67 . Até recentemente, não houve nenhuma técnica aplicável para observar a dinâmica de nanoescala de dendritos em situ.
Schain et al relataram anteriormente que dendritos exibem refletância de luz colorido8. Adotando a análise espectroscópica da luz refletida, criámos uma nova modalidade de imagem para a imagem latente de nanoescala de axônios mielinizados, chamado reflectometria espectral (provador)9. Provador baseia-se a interferência de filme fino que ocorrem na estrutura multi-camadas da bainha de mielina (Figura 1). Por simulação óptica em vários axônios, revelamos que o espectro de refletância é uma função periódica do número de onda e sua periodicidade (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq1.jpg">) é inversamente proporcional ao diâmetro do axônio (d). Esta relação simples (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57965/57965eq2.jpg">) oferece fácil quantificação do diâmetro do axônio a partir dos dados do provador. Utilizando este, revelamos o axônio prevalente abaulamento sob leve traumatismo crânio-encefálico em nosso relatório prévio.
O sistema de provador baseia-se na microscopia confocal e consiste de uma fonte de laser especializado e filtros (Figura 2). A fonte de entrada é um laser de luz branca, fornecendo banda larga saída espectral visível para regiões de infravermelhas. Para a varredura espectral, o sistema é equipado com dois dispositivos óptico-acústico: um filtro sintonizável Acusto-óptica (AOTF) para a entrega de um comprimento de onda selecionado de fonte entrada de banda larga e um divisor de feixe óptico-acústico (AOBS) para guiar o selecionado refletido comprimento de onda do detector. O software para a microscopia confocal hiperespectral (ver Tabela de materiais) oferece uma opção de varredura espectral personalizável para adquirir sequencialmente as imagens de reflectância em vários comprimentos de onda de entrada. Além disso, a aberração cromática criticamente pode interferir na medição espectral; Portanto, recomenda-se uso de uma lente objetiva de apochromat.
Digno de nota, lasers de luz branca produzir uma saída espectral desigual e componentes ópticos também afetam o perfil espectral. Portanto, os espectros adquiridos precisam ser calibrados para posterior análise quantitativa. Um espelho de prata protegido é geralmente usado como uma referência, que fornece uma reflectância quase constante (> 97%) sobre a região completamente visível. Os espectros adquiridos dividem-se em seguida pelos espectros de referência do espelho.
O tamanho de etapa espectral para a varredura espectral determina a velocidade de aquisição; assim, ele precisa ser otimizado. Como um axónio maior tem um período maior de espectral, requer mais fino amostragem espectral. Por exemplo, um axônio com um diâmetro de 10 µm, dentre os axônios fisiológicos maiores, tem um período espectral de ~ 8 nm. Aplicando os critérios de amostragem de Nyquist, utilizamos o intervalo de amostragem espectral de 4 nm para cobrir todos os axônios fisiológicos nos tecidos nervosos do mouse. Esta abordagem geralmente leva vários segundos para uma varredura espectral completa e, portanto, não é adequada para aplicações na vivo , onde o movimento fisiológico (por exemplo, respiração e batimentos cardíacos) interfere aquisição espectral estável. Anteriormente, resolvemos esse problema por instrumentação um microscópio vertical personalizado, concebido para adquirir todo o espectro para cada ponto usando um espectrômetro de matriz (aquisição velocidade ≈ 30 ms por pixel).
Neste relatório, descrevemos um protocolo detalhado do provador de imagens sobre uma fatia de cérebro fixa, que pode ser executada em um microscópio hiperespectrais comercial (ver Tabela de materiais). Assim, o protocolo pode ser concluído por experimentadores sem especialização em instrumentação óptica. Também abordamos os problemas potenciais e solução de problemas para a aquisição e análise de dados do provador.

<table><tbody><tr><td>Glass cutter</td><td>-</td><td>-</td><td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>-</td><td>-</td><td>Can be purchased in a local convenience store or online stores.</td></tr><tr><td>Apochromat objective 40&amp;times;, NA 1.1</td><td>Leica Microsystems</td><td>15506357</td><td>Water-immersion type</td></tr><tr><td>Fluoromyelin Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>F34651</td><td>Alternatively, Fluoromyelin Red (F34652) can be used.</td></tr><tr><td>Leica SP8 TCS microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP8</td><td>Refer to the &quot;Configuration of microscope&quot; in Introduction Section for details.</td></tr><tr><td>Imaging software</td><td>Leica Microsystems</td><td>LAS-X</td><td>-</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Mirror</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>Coated with protected silver.</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Life technologies</td><td>14190-136</td><td>-</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Biosolution</td><td>BP031a</td><td>4% v/v in PBS</td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Thermo Fisher</td><td>3306</td><td>Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm)</td></tr><tr><td>Slide glass</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>5116-20F</td><td>Thickness: ~1 mm</td></tr><tr><td>Super glue</td><td>Henkel</td><td>Loctite 406</td><td>Use a dispensing equipment to avoid skin or eye contact.</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Brainetree Scientific</td><td>BS-8000 DUAL</td><td>-</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td>-</td></tr><tr><td>White-light laser</td><td>NKT photonics</td><td>EXB-6</td><td>EXB-6 was discontinued and replaced by EXU-6.</td></tr></tbody></table>

spectral reflectometric microscopy on myelinated axons in situ

Em um sistema nervoso de mamíferos, mielina fornece um isolamento eléctrico por enwrapping as fibras de axônio em uma espiral de várias camada. Inspirado por sua arquitetura subcellular altamente organizado, desenvolvemos recentemente uma nova modalidade de imagem, chamada reflectometria espectral (provador), que permite que a imagem latente de nanoescala rótulo livre sem precedentes dos axônios mielinizadas ao vivo em situ. O princípio subjacente é obter informações nanoestrutural, analisando o espectro de refletância da estrutura subcelular várias camada. Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado passo a passo para a realização de uma imagem de provador básica dos tecidos nervosos usando um sistema comercial microscópico confocal, equipado com um laser de luz branca e um filtro sintonizável. Cobrimos os procedimentos de preparação da amostra, aquisição de dados espectrais e processamento de imagem para obtenção de informações nanoestrutural.

De acordo com o protocolo, uma fatia do cérebro fixa foi preparada com coloração exógenos, um fluoróforo mielina-direcionamento (ver Tabela de materiais). Imagem de provador foi realizada na fatia cérebro usando um microscópio confocal hiperespectrais comercial em conjunto com fluorescência confocal de imagem (figura 4a). Para provador, entrada intensidade óptica foi definida como 5 µW/µm2 com um tempo de interrupção de pixel ~ 1 µs. Esta dose de luz é sobre uma ordem de magnitude inferior a microscopia confocal de fluorescência convencional12. Demora ~ 17 s para varredura espectral mais de 470-670 nm, com um intervalo de 4 nm (51 imagens).
O sinal de provador era localizado ao longo do centro dos axônios mielinizados como esperado pela geometria da reflexão ótica. Do espectro de refletância de um segmento do axônio, obteve-se a periodicidade do wavenumber, que posteriormente se converteu ao diâmetro do axônio (figura 4b, c). O diâmetro medido pelo provador foi encontrado para ser bom de acordo com a medição baseada em fluorescência (Figura 4D). O erro residual menor poderia ter se originado ou na resolução de difração limitada do método baseado em fluorescência ou o incompleto geométricas modelo para o provador.
A imagem do provador baseia-se na reflexão óptica, assim, uma lamela com base em sílica pode introduzir um ruído de fundo significativo. Em nossa configuração óptica, o ruído de fundo era considerável quando a profundidade da imagem latente da lamela é inferior a 5 µm, mas foi evitada quando a profundidade de imagem é maior que 15 µm (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57965/57965fig1.jpg"> Figura 1 : Princípio de provador. Mielinizadas axônio tem uma estrutura multicamada de película fina. A luz incidente é parcialmente refletida nas interfaces, conforme descrito pela lei de Fresnel. Estas refletidas as ondas de luz interferem uns com os outros; Portanto, a luz refletida resultante codifica as informações nanoestrutural. Reflectometria espectral (provador) Obtém as informações de nanoestrutural pela luz refletida do axônio mielinizada de decodificação. Esta figura foi reimpresso de Kwon, J. et al. 9 <a href="/files/ftp_upload/57965/57965fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57965/57965fig2.jpg"> Figura 2 : Layout do sistema de provador. O sistema de provador é baseado em um microscópio confocal de reflectância. Para fazer a varredura espectral, três componentes adicionais são necessários ao longo do caminho de excitação: (1) um laser supercontinuum, (2) óptico-acústico sintonizável filtro (AOTF) e (3) Acusto-óptica feixe divisor (AOBS). A fonte de laser banda larga espectralmente é filtrada pelo AOTF para transmitir um comprimento de onda selecionado com uma largura de banda estreita. AOBS funciona como um divisor de feixe para o comprimento de onda selecionado guiar a luz de excitação para a amostra. A luz é então incidente sobre a amostra através de um scanner reológicas e uma lente objetiva. A luz refletida da amostra é descanned, filtrada espacialmente por uma pinhole confocal e coletada pelo tubo fotomultiplicador (PMT). <a href="/files/ftp_upload/57965/57965fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57965/57965fig3.jpg"> Figura 3 : Instalação de software. (uma) interface de usuário gráfica (GUI). Na janela principal, há principalmente cinco sub-painéis: imagem de instalação, instalação do laser, óptica instalação, instalação do detector e visualizador de imagens. (b) o menu drop-down para selecionar o modo de imagem. Para provador, xyλ está selecionada. (c) o painel para ajustar a janela espectral para o detector. (d) o painel de configuração do divisor de feixe óptico-acústico (AOBS). 'Reflexão' é selecionado para orientar a luz refletida para o detector. <a href="/files/ftp_upload/57965/57965fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57965/57965fig4.jpg"> Figura 4 : Provador em um tecido de cérebro. (um) provador A imagem de um tecido de cérebro murino manchada com um counterstaining fluorescente da mielina (fluoromyelin). (b) um espectro de refletância representante obtidos a partir da caixa branca tracejada na alínea a. (c) uma curva de referência simulado para estimar o diâmetro do axónio de periodicidade espectral. Asterisco azul é o ponto de dados obtido de (b). (d), o perfil Transversal da intensidade de fluorescência da região Box na alínea a. O diâmetro externo de mielina, estimado por meio do sinal de fluorescência é ~ 760 nm, que concorda com a medição do provador. O erro residual é concebível de erro de difração da medição baseada em fluorescência. Scalebar, 5 µm. <a href="/files/ftp_upload/57965/57965fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57965/57965fig5.jpg"> Figura 5 : Efeito de uma lamela. (a, b) Imagens de reflectância de um tecido cerebral na mesma posição lateral são adquiridas em diferentes profundidades da interface tecido-Lamela: 3 µm (um) e 15 µm (b). Scalebar, 10 µm. <a href="/files/ftp_upload/57965/57965fig5large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Microscopia de reflectométrica espectral em dendritos In Situ

Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo para imagem mielinizados axônios em uma fatia do cérebro fixo usando uma rótulo livre nanoescala imagem técnica baseada na reflectometria espectral.

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

7.3K visualizações.  Sungkyunkwan University. Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo para imagem mielinizados axônios em uma fatia do cérebro fixo usando uma rótulo livre nanoescala imagem técnica baseada na reflectometria espectral.

Vídeo: Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Aguda dissociação de lampreia reticulospinais axônios para permitir a gravação do lançamento Rosto Membrana de terminais pré-sinápticos funcionais individuais

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Neurociência

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Um<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Induzida por laser Lesão Medular modelo para avaliar mecanismos de axonal Degeneration em tempo real

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Experimental desmielinização e remielinização de Medula Espinhal Murino por Injeção Focal de lisolecitina

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in vertebrates. Thus, it is critical to uncover the molecular mechanisms of how motor axons navigate to, arborize, and innervate their peripheral muscle targets during development and degeneration. Although transgenic Hb9::GFP mouse lines have long served to visualize motor axon trajectories during embryonic development, detailed descriptions of the full spectrum of axon terminal arborization remain incomplete due to the pattern complexity and limitations of current optical microscopy. Here, we describe an improved protocol that combines light sheet fluorescence microscopy (LSFM) and robust image analysis to qualitatively and quantitatively visualize developing motor axons. This system can be easily adopted to cross genetic mutants or MN disease models with Hb9::GFP lines, revealing novel molecular mechanisms that lead to defects in motor axon navigation and arborization.

Here, we describe a protocol for visualizing motor neuron projection and axon arborization in transgenic Hb9::GFP mouse embryos. After immunostaining for motor neurons, we used light sheet fluorescence microscopy to image embryos for subsequent quantitative analysis. This protocol is applicable to other neuron navigation processes in the central nervous system.

Visualização do axônio Motor navegação e quantificação do axônio arborização em embriões de rato usando microscopia de fluorescência folha de luz

Spinal motor neurons (MNs) extend their axons to communicate with their innervating targets, thereby controlling movement and complex tasks in ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

In vivo Imagem de tecidos biológicos com fluorescência combinada de dois fótons e microscopia de dispersão de Raman estimulada

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Bioengenharia

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical conduction. Myelin alteration has been shown to occur in various neurological diseases, where it is associated with functional deficits. Here, we provide a detailed description of an ex vivo model consisting of mouse organotypic cerebellar slices, which can be maintained in culture for several weeks and further be labeled to visualize myelin.

Here we present a method to prepare organotypic slice cultures from mouse cerebellum and myelin sheath staining by immunohistochemistry suitable for investigating mechanisms of myelination and remyelination in the central nervous system.

Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy (3D-SIM)

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to the maintenance of neuronal polarity by sorting somato-dendritic cargo. A membrane periodic skeleton (MPS) comprising periodic actin rings provides a scaffold for anchoring various AIS proteins, including structural proteins and different ion channels. Although recent proteomic approaches have identified a considerable number of novel AIS components, details of the structure of the MPS and the roles of its individual components are lacking. The distance between individual actin rings in the MPS (~190 nm) necessitates the employment of super-resolution microscopy techniques to resolve the structural details of the MPS. This protocol describes a method for using cultured rat hippocampal neurons to examine the precise localization of an AIS protein in the MPS relative to sub-membranous actin rings using 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM). In addition, an analytical approach to quantitively assess the periodicity of individual components and their position relative to actin rings is also described.

Measuring Properties of the Membrane Periodic Skeleton of the Axon Initial Segment using 3D-Structured Illumination Microscopy 3D-SIM

The present protocol describes a method to visualize and measure actin rings and other components of the membrane periodic skeleton of the axon initial segment using cultured rat hippocampal neurons and 3D-structured illumination microscopy (3D-SIM).

Propriedades de medição do esqueleto periódico da membrana do segmento inicial de axônio usando microscopia de iluminação estruturada em 3D (3D-SIM)

The axon initial segment (AIS) is the site at which action potentials initiate and constitutes a transport filter and diffusion barrier that contribute to ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

Aplicação coerente de espectroscopia Raman anti-Stokes (CARS) para mielinização por imagem em fatias cerebrais

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...