Gostaríamos de agradecer o dia de Brittany e Jessica Onyak para sua assistência técnica e Dr. Liu por amavelmente nos deixar usar seu microscópio de epifluorescente. Agradecimentos de apoio: NIH R15EY026255-01 e a Fundação de Kirchgessner de Karl.

<ol>
	<li>Applebury, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+A+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).</li><li>Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonuniform+distribution+and+spectral+tuning+of+photosensitive+retinal+ganglion+cells+of+the+mouse+retina.">Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina.</a> Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).</li><li>Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+anatomical+and+visual+space+for+the+mouse+retina:+Computational+reconstruction+and+transformation+of+flattened+retinae+with+the+Retistruct+package.">Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package.</a> PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Não houve nenhum protocolo abrangente, padronizado para a determinação e a orientação da retina do rato isolado no espaço anatômico de rotulagem. O protocolo detalhada aqui tenta preencher esse vazio com a padronização e detalhando como usar pontos anatômicos profundos como referência pontos para confiantemente identificar a orientação da retina. Tem sido demonstrado que os marcos anatômicos profundos no presente protocolo fornecem um método mais preciso e confiável para orientar a retina do rato do que Marcos superficiais tais como queimaduras da córnea22. Assim, estudos que têm confiado em queimaduras da córnea para orientação da retina podem ter tido erros maiores na orientação de estudos que têm contado com marcos históricos, como os músculos retos e fissura coroide. Esta discrepância destaca a necessidade e a importância do presente protocolo padronizado com relação a interpretar os resultados e fazer comparações entre os estudos que dependem da orientação da retina precisa. Em geral, um protocolo padronizado irá fornecer um método comum para pesquisadores de visão a seguir, eliminando assim a presença de uma variável de confundimento em aquisição de dados que pode ocorrer com o uso de métodos não-padronizados para a identificação de retina orientação.
Os métodos apresentados aqui são facilmente reproduzíveis e aplicável a muitos tipos de protocolos experimentais. Na verdade, uma das maiores vantagens desse protocolo é sua adaptabilidade. Porque a fissura coroide, expressão de s-opsin e Marcos de músculo reto todos foram encontrados para identificar confiantemente orientação da retina22 o Marco que melhor se adapte os parâmetros experimentais pode ser escolhido para otimizar a aquisição de dados (tabela de 1). Além disso, métodos de dissecação podem ser combinados por forma a esclarecer a orientação da retina. Por exemplo, fissura coroide cortes podem ser combinados com s-opsin imuno-histoquímica para orientar todos os quatro polos da retina: hemisférios nasais e temporais podem ser identificados pelas cortes fissura coroide, e s-opsin imuno-histoquímica pode identificar hemisférios dorsais e ventrais. Ainda, a capacidade de adaptação do presente protocolo pode ser restringida pela natureza dos experimentos de Fisiologia com tempo-sensível. Porque o tempo que demora para identificar um ponto de referência, fazer uma queimadura da córnea e executar um alívio corte pode resultar em morte do tecido significativa em ex vivo experimentos, alguns desses métodos de dissecação podem ser menos do que ideal. Felizmente, uma vez que um Dissecador tornou-se familiarizado com a fissura coroide ou método de dissecação do músculo reto superior, identificando os marcos profundos e tornando a aliviar cortes rapidamente tornar-se parte da rotina de dissecação e não adicionar significativamente para o comprimento de dissecação. Embora reconheçamos que as etapas detalhadas aqui podem adicionar em vez de experiências extremamente sensíveis ao tempo, nós sugerimos o uso do gradiente s-opsina para orientação da retina post hoc quando a viabilidade do tecido não é mais uma questão (Figura 3 ). Coloração da retina para s-opsina é uma maneira eficaz para orientar a retina, como ele pode identificar todos os quatro polos: s-opsin manchando a retina se divide em polos dorsais e ventrais e permite a identificação da nasal e temporal polos dependendo se a retina é um direito ou esquerdo do olho (Figura 3). Portanto, acreditamos que este protocolo oferece um conjunto confiável e reproduzível de métodos para orientação da retina preciso que podem cumprir quaisquer parâmetros experimentais.
Como com qualquer modificada dissecação da retina, a validade do método dissecação é limitada pela precisão do Dissecador e a qualidade do tecido que foi isolado. Se qualquer tecido é perdido durante a dissecção ou uma retina também é desconfigurado para reconstrução precisa, Retistruct e o programa MATLAB não será capazes de forma confiável reconstruir ou orientar a retina. Portanto, é importante praticar o método de dissecação antes de usá-lo para a coleta de dados de experiências. Enquanto os tipos de dissecações explicaram aqui não são difíceis, eles devem ser praticados para garantir a repetibilidade de identificar a orientação da retina com um marco especial. Além disso, é essencial que a prática do Dissecador visualmente, identificando os pontos anatômicos antes de iniciar a coleta de dados para garantir que o Marco correto está sendo usada. Uma maneira de verificar a exatidão de um particular Dissecador é tornar qualquer fissura coroide cortes ou músculo reto superior cortes e em seguida, comparar a localização dos cortes ao gradiente s-opsina, já que é um marcador fixo e, portanto, não é dependente da exactidão dos dissectio s. potenciais dissectors também podem comparar suas retinas reconstruídos para os exemplos de retina reconstruído com Marco preciso cortes são mostrados na Figura 1 e a Figura 2. Essencialmente, um Dissecador potencial deve executar as etapas descritas neste protocolo para um tipo particular de dissecação, quer seja o músculo reto superior ou a coroide fissura método e comparar os resultados com o gradiente s-opsina para estabelecer a validade de um Dissecador particular. Porque se não tiver certo sobre a localização do landmark o Dissecador, pode resultar em uma orientação imprecisa da retina que irá, por padrão, afetam interpretação e coleta de dados.

Um aspecto importante e às vezes negligenciado da neurociência da retina é a orientação correta e a análise da retina toda montagem isolada, seja a orientação de uma retina em uma câmara de gravação de eletrofisiologia ou sobre lâmina histológica. Isto é particularmente importante para os estudos envolvendo a retina do rato, que é atualmente o modelo mais amplamente utilizado para investigações do sistema visual de mamíferos. Descobertas recentes revelam que a retina do rato não é espacialmente uniforme mas tem gradientes de densidade e tamanho dos tipos de células da retina funcionalmente distintos, tais como células ganglionares de melanopsina, transientes células ganglionares de OFF-alfa e opsins cone1,2 ,3,4,5. Por conseguinte, o método utilizado para determinar a orientação da retina pode afetar os resultados experimentais envolvendo a célula tipo ou opsina distribuições2,3,6, direção ajuste de direção-seletivo gânglio células7,8,9e padrões topográficos de degeneração da retina10,11,12,13,14 . Na verdade, não relatório orientação como da retina é relatada pode causar discrepâncias na literatura e confusão ao tentar comparar os dados entre os estudos. Portanto, é vital que os investigadores relatam o método para identificar a orientação da retina para que os resultados de tais estudos podem ser interpretados com precisão.
Orientação da retina é geralmente identificada, marcando a córnea dorsal, ventral, nasal ou temporal antes da Enucleação ocular1,3,12,15,16,17 ,18,19 ou por corte ou coloração marcos anatômicos profundos olhos tais como os músculos extra-oculares6,7, a coroide fissura20,21, ou o s-opsin gradiente2,3. Os músculos retos podem ser usados para identificar o dorsal, ventral, nasais e a retina temporal, fazendo um corte profundo alívio que corta a ligação de qualquer um o reto superior, reto inferior, reto medial, o músculo reto lateral, respectivamente. No entanto, para a maioria dos experimentos, usar um músculo reto é suficiente para orientar a retina22. A fissura coroide, que é um remanescente do desenvolvimento do olho, pode ser vista como uma ténue linha horizontal na parte de trás do olho. Cada extremidade desta linha termina na nasal ou polo temporal do globo,23. Finalmente, expressão de s-opsin assimetricamente é distribuído para a retina ventral em camundongos, e anticorpos opsin-s podem ser usados para revelar a retina ventral em imuno-histoquímica experiências1.
Trabalho recente de Stabio, et al 22 demonstraram que Marcos oculares superficiais, tais como queimaduras da córnea são um método menos confiável para orientar a retina no espaço anatômico, provavelmente devido a erro humano e variabilidade em fazer a queimadura da córnea quando usando o temporal e medial canthi como pontos de referência. Em contraste, Marcos profundos, tais como o músculo reto superior, fissura coroide e gradiente s-opsina, foram mostrados para ser mais confiáveis e precisos para orientar a retina22Marcos. No entanto, a identificação destes pontos anatômicos requer etapas de dissecação exclusivos que não são descritas em detalhes na literatura. Assim, o objetivo do presente protocolo é fornecer um tutorial completo sobre como usar o músculo reto superior, fissura coroide e gradiente s-opsina para identificar com precisão a orientação espacial da retina do rato. Além disso, incluímos uma comparação da eficácia dos dois anticorpos s-opsina, bem como um protocolo para s-opsin immunohistochemistry.
Um desafio adicional para estudos baseando-se na orientação precisa da retina é os grandes cortes de alívio necessários para achatar as retinas wholemount em uma câmara de gravação, prato ou slide. Isto pode apresentar desafios para a análise do que é naturalmente uma estrutura tridimensional, quando ela é imaginada como uma estrutura bidimensional plana. Um programa chamado Retistruct24 pode ser usado para retornar uma retina plana wholemount a sua estrutura tridimensional antes dos dados coletados a partir dele são analisados. Assim, uma seção do presente protocolo é dedicada a destacar as etapas que são necessárias para usar o software Retistruct para reconstruir as retinas de rato de immunostained s-opsina. Também incluímos uma seção de protocolo para usar nosso script personalizado do MATLAB, que foi desenvolvido para rato com precisão girar e orientar as retinas manchadas com s-opsina.

<table><tbody><tr><td>0.1 M Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan2 Epifluorescent Microscope</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nailpolish</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE Low Speed Orbital Shaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS6780FP</td><td></td></tr><tr><td>Costar TC-Treated 24-well Plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat Alexa 594</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit Alexa 594</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Normal Serum</td><td>Millipore</td><td>566460</td><td>Use at 5.2% (52 &amp;mu;L with 86 &amp;mu;L of 20% Triton X-100 and 863 &amp;mu;L of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution)</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-s-opsin</td><td>Santa Cruz Biotechnologies&amp;nbsp;</td><td>sc-14363</td><td>Not commerically available as of 2017</td></tr><tr><td>Graefe Curved Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ or FIJI</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A</td><td>Freely available software</td></tr><tr><td>Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>At least version 2007b or later</td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses&amp;nbsp;</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Micro Slide Trays</td><td>VWR International</td><td>82020-913</td><td></td></tr><tr><td>Moira Ultra Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>Use at 4% (25 &amp;mu;L and 875 &amp;mu;L of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative)</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle 20G (0.90 mm x 25 mm)&amp;nbsp;</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Glass Petri Dish</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160152</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>The R Project for Statistical Computing</td><td>N/A</td><td>Freely available software; version 3.4.3 or later</td></tr><tr><td>Rabbit anti-s-opsin</td><td>Millipore</td><td>ABN1660</td><td></td></tr><tr><td>Retiga R3 Microscope Camera</td><td>Qimaging</td><td>01-RET-R3-R-CLR-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retistruct</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Freely available software&amp;nbsp; compatiable with Windows 7 or Windows 10</td></tr><tr><td>Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Use 1.7% (86 &amp;mu;L of 20% Triton-X with 52 &amp;mu;L of Donkey Normal Serum and 863 &amp;mu;L of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution)</td></tr><tr><td>Vannas Spring Dissection Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>5MP USB Microscope Digital Camera</td><td>AmScope</td><td>MU500</td><td>To be used with the Olympus Dissection Microscope</td></tr></tbody></table>

where you cut matters: a dissection and analysis guide for the spatial orientation of the mouse retina from ocular landmarks

Com precisão e confiabilidade identificar a orientação espacial da retina do rato isolado é importante para muitos estudos em neurociência visual, incluindo a análise da densidade e tamanho gradientes de tipos de células da retina, a direção de afinação de direção-seletivo células ganglionares e o exame dos padrões topográficos degeneração em algumas doenças da retina. No entanto, existem muitos métodos diferentes de dissecação ocular relatados na literatura que são usados para identificar e rotular a orientação da retina na retina do rato. Enquanto o método de orientação utilizado em tais estudos é muitas vezes esquecido, não relata como retinal orientação é determinada pode causar discrepâncias na literatura e confusão ao tentar comparar os dados entre os estudos. Marcos oculares superficiais, tais como queimaduras da córnea são comumente usados, mas recentemente foram mostrados para ser menos confiáveis do que os marcos mais profundos, como os músculos reto, fissura coroide ou gradiente s-opsina. Aqui, nós fornecemos um guia completo para o uso do fundo oculares Marcos de precisão de dissecar e documentar a orientação espacial de uma retina de rato isolado. Temos também comparou a eficácia de dois anticorpos s-opsin e incluiu um protocolo para s-opsin immunohistochemistry. Porque a orientação da retina de acordo com o gradiente s-opsin requer reconstrução da retina com o software Retistruct e rotação com código personalizado, apresentamos os passos importantes necessários para usar os dois destes programas. No geral, o objetivo do presente protocolo é entregar um conjunto confiável e reproduzível de métodos para exata orientação da retina que é adaptável aos protocolos mais experimentais. Um objectivo fundamental deste trabalho é a padronização de métodos de orientação da retina para futuros estudos.

Um único corte de alívio que corta o músculo reto superior com precisão e confiantemente identifica a retina dorsal (Figura 1). A fissura coroide com precisão e confiabilidade identifica a retina nasal e temporal com cortes profundos de alívio ao longo da fissura coroide temporal e nasal (Figura 2). Neste exemplo, um corte de alívio também fez na retina dorsal a fim de identificar o eixo dorsal/ventral da retina (Figura 2D, seta vertical). As etapas destes processos são mostradas com fins de replicação por futuros dissectors. Uma combinação de imuno-histoquímica s-opsina (Figura 3A e 3D), reconstrução com software Retistruct (3B, 3E) e rotação exata com um código personalizado do MATLAB (3 C, 3F) permitem a identificação das metades ventrais e dorsais da retina, bem como os polos nasais e temporais se sabe se a retina é de um olho esquerdo ou direito (Figura 3). Nós também comparamos dois anticorpos primários de s-opsin comumente usados para a eficácia da rotulagem cones s-opsina (Figura 4A-D): ambos o bode anticorpo primário anti-s-opsin e o anticorpo primário de coelho anti-s-opsin efetivamente etiqueta s-opsin conoides (Figura 4E) o mouse mesmo.
Aliviar cortes foram identificados na retina de s-opsin immunostained reconstruída e suas localizações foram comparadas à orientação determinada pelo gradiente s-opsina. Usando nosso personalizado MATLAB código as retinas (ver Materiais suplementares), com precisão foram girados para que a maior concentração de s-opsin coloração está localizada ventralmente, colocando, assim, verdadeira dorsal em 90 ° (para reto superior), verdadeiro nasal em 0 ° (para nasal fissura coroide) e verdadeiro temporal em 180 ° (para temporal fissura coroide). O valor de cada indivíduo aliviar corte ângulo foi determinado usando a ferramenta de ângulo no ImageJ após as retinas foram giradas de acordo com o gradiente s-opsina. Um ângulo médio foi calculado para cada alívio cortar o tipo e o valor médio de cada tipo de corte alívio foi então plotado em um terreno polar (Figura 6). Em média, cortes de músculo reto superior identificaram o polo dorsal 96.3 ± 4,3 ° (n = 11) (Figura 6). A fissura coroide nasal identificado o polo nasal a 6,7 ± 5,8 ° e temporal fissura coroide identificado o polo temporal 172.0 ± 4,4 ° (n = 9; A Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg"> Figura 1: usando o músculo reto superior para identificar com precisão a retina de um olho direito dorsal. (A) um exemplo de uma queimadura da córnea dorsal, perto da fronteira da córnea-scleral feita com uma caneta de ponta de cauterização (seta branca). O músculo reto superior é também visível neste modo de exibição (seta branca). (B) um exemplo de um todo montado retina com um alívio de corte feito na retina dorsal por atravessa o músculo reto superior. Seta retrata o profundo alívio corte feito na retina dorsal por atravessa o músculo reto superior. A retina está manchada com o anticorpo primário cabra anti-s-opsina (ver Tabela de materiais) e anticorpo secundário burro anti-cabra 594 Alexa (ver Tabela de materiais; excitação: 590 nm; emissão: 620 nm) (ciano). Retina foi fotografada com um microscópio de epifluorescente com um filtro vermelho Texas (595 nm). (C), A retina reconstruída em Retistruct e girado com um código personalizado do MATLAB (ver Material suplementar) com o reto superior muscular aliviando corte visível (seta branca). D: dorsal, v: ventral, t: temporal, n: nasal. Barras de escala = 1 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg"> Figura 2: usando a fissura coroide para identificar com precisão os polos nasais e temporais da retina de um olho direito. (A) um exemplo de uma queimadura da córnea dorsal, perto da fronteira da córnea-scleral feita com uma caneta de ponta de cauterização. (B) a coroide fissura visível na parte de trás do olho sobre a esclera (seta branca). A queimadura da córnea dorsal é também visível neste ponto de vista, localizado a cerca de 90° a partir da fissura coroide temporal. (C) a coroide fissura visível na parte de trás do olho sobre a esclera, viajando do nervo óptico à fronteira córneo-escleral. (D), A retina manchada de cabra anti-s-opsina (ver Tabela de materiais) e anticorpo secundário burro anti-cabra 594 Alexa (ver Tabela de materiais; excitação: 590 nm; emissão: 620 nm) (ciano), com cortes de fissura coroide (horizontal as setas) e o alívio dorsal corte (seta vertical). Retina foi fotografada com um microscópio de epifluorescente com um filtro vermelho Texas (595 nm). (E) uma retina reconstruída em Retistruct e girado com um código personalizado do MATLAB (ver material suplementar) com o corte de alívio dorsal e os cortes nasal e temporal fissura coroide visíveis (setas brancas). D: dorsal, v: ventral, t: temporal, n: nasal. Barras de escala = 1 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg"> Figura 3: usando o gradiente s-opsina para identificar todos os quatro polos da retina. (A), um exemplo de uma retina dissecado de um olho direito que foi immunostained para rotular s-opsin e fotografada com um microscópio de epifluorescente com um filtro vermelho Texas (595 nm). Os cortes neste retina são arbitrários, desde que a orientação topográfica é determinada pelo gradiente s-opsina. (B) os resultados da reconstrução da retina em A com Retistruct. Observe que o gradiente s-opsin não está corretamente alinhado porque a retina não foi executada através do código personalizado do MATLAB (ver Materiais suplementares). (C) os resultados da retina na com o código personalizado de giro. A retina foi girada para que a maior concentração de s-opsin coloração está localizada na parte inferior e identificada como a ventral da retina. Porque a retina é de um olho direito, o polo temporal está localizado 90° no sentido anti-horário do polo dorsal e o polo nasal é localizado 90° no sentido horário do polo dorsal. (D) um exemplo de uma retina dissecado de um olho esquerdo que foi immunostained para rotular s-opsin e fotografada com um filtro vermelho Texas (595 nm). Os cortes neste retina são arbitrários, desde que a orientação topográfica é determinada pelo gradiente s-opsina. (E) os resultados da reconstrução digitalmente a retina em D com Retistruct. Observe que o gradiente s-opsin não está corretamente alinhado porque a retina não foi girada pelo código personalizado. (F) os resultados de rotativas da retina em D com código personalizado. A retina foi girada para que a maior concentração de s-opsin coloração está localizada na parte inferior e identificada como a ventral da retina. Porque a retina é de um olho esquerdo, o polo nasal é localizado 90° no sentido anti-horário do polo dorsal e o polo temporal está localizado 90° no sentido horário do polo dorsal. D: dorsal, v: ventral, t: temporal, n: nasal. Barras de escala = 1 mm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg"> Figura 4: comparação de dois anticorpos primários s-opsin na rotulagem cones s-opsin. (A), A retina manchado com o anticorpo primário de cabra anti-s-opsina (ver Tabela de materiais). (B) outra retina do rato mesmo corados com anticorpo primário de coelho anti-s-opsina (ver Tabela de materiais). (C) A região representativa (0,1 x 0,1 mm2) de uma retina manchado com o anticorpo primário de cabra anti-s-opsina. Imagem tirada em um microscópio de epifluorescente ampliação de 40 X. (D) A região representativa (0,1 x 0,1 mm2) de uma retina manchada de coelho anti-s-opsina (ver Tabela de materiais), uma alternativa de anticorpo primário. Imagem foi tirada em um microscópio de epifluorescente ampliação de 40 X. (E) ambos os anticorpos rotular o mesmo número de segmentos de s-cone exterior porque não há nenhuma diferença significativa no número de immunopositive s-cones que estão manchadas de cabra anti-s-opsin e anti-s-opsin do coelho em qualquer um do retinal testado excentricidades (n = 2; ANOVA com teste post hoc de Bonferroni; p > 0,05). Barras de escala = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg"> Figura 5: um guia visual para usar o software Retistruct para reconstruir as retinas immunostained com s-opsin. (A), A retina, inaugurado em Retistruct com o contorno visível e um "rasgo" adicionado. Pontos do "Rasgo" são indicados com setas brancas sobrepostas. Todos os cortes neste retina são arbitrários, como nenhum Marco particular foi usado para marcar a orientação da retina durante a dissecção. Botões importantes são descritas em vermelho. (B), A retina com todas as "lágrimas" adicionado e a retina dorsal identificada com "D" na periferia da retina. Observe que o botão de "Retina reconstruir" agora é visível. Botões importantes são descritas em vermelho. (C) o processo de reconstrução de uma retina. A trama do polar da retina reconstruída aparecerá à direita, mostrando que a aliviar cortes em ciano (setas azuis sobrepostos para esclarecer locais de corte). (D) o resultado final da execução uma retina através de Retistruct. A retina wholemount original permanece no lado esquerdo e reconstruída retina aparece no lado direito. Os cortes de alívio são visíveis em ciano (setas brancas sobrepostas para esclarecer locais de corte). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg"> Figura 6: A fissura de músculo e coroide reto superior pode ser usada para orientar com precisão a retina do rato. Uma trama polar dos ângulos obtidos a partir de qualquer músculo reto superior aliviando cortes ou fissura coroide cortes em retinas que foram reconstruídas com Retistruct. Aliviar cortes foram identificados na retina de s-opsin immunostained reconstruída e suas localizações foram comparadas com a localização do gradiente s-opsina. Usando o código personalizado do MATLAB para girar com precisão as retinas para que a maior concentração de s-opsin coloração é localizado ventralmente, verdadeiro dorsal (90° para reto superior), true nasal (0° para fissura coroide nasal) e temporal (180° para coroide temporal é verdade fissura) foram determinados para cada retina. O valor de cada individual aliviar o ângulo de corte foi determinado no ImageJ e um ângulo médio foi calculado para aliviar cada tipo de corte. Cortes de músculo reto superior identificaram o polo dorsal 96.3 ± 4,3 ° (n = 11). A fissura coroide nasal identificado o polo nasal a 6,7 ± 5,8 ° e temporal fissura coroide identificado o polo temporal 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Marco profundo</td>
			<td>Localização de queimadura da córnea</td>
			<td>Polo de Retina identificado</td>
			<td>Aplicação experimental</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reto superior</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Ao vivo ou fixo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fissura coroide nasal</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Nasal</td>
			<td>Ao vivo ou fixo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temporal fissura coroide</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Temporal</td>
			<td>Ao vivo ou fixo</td>
		</tr>
<tr>
<td>S-opsin gradiente</td>
			<td>Nenhum</td>
			<td>Dorsal, Ventral, Nasal, Temporal</td>
			<td>Fixo</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Marcos profundos, o polo da retina identificam-se, e se eles podem ser usados para aplicação de tecido vivo ou fixo.

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Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Este protocolo fornece um guia completo de dissecção e análise para o uso de fundo oculares Marcos s-opsin immunohistochemistry, Retistruct e código personalizado com precisão e confiabilidade orientar a retina de rato isolado no espaço anatômico.

Onde cortar matérias: Uma dissecção e análise de guia para a orientação espacial da Retina do rato de Marcos Ocular

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

where-you-cut-matters-dissection-analysis-guide-for-spatial

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K visualizações.  The University of Akron. Este protocolo fornece um guia completo de dissecção e análise para o uso de fundo oculares Marcos s-opsin immunohistochemistry, Retistruct e código personalizado com precisão e confiabilidade orientar a retina de rato isolado no espaço anatômico.

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Video-oculography in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the mouse, have a limited capacity to lock their eyes onto a target. In contrast to these target directed eye movements, compensatory ocular eye movements are easily elicited in afoveate animals1,2,3,4. Compensatory ocular movements are generated by processing vestibular and optokinetic information into a command signal that will drive the eye muscles. The processing of the vestibular and optokinetic information can be investigated separately and together, allowing the specification of a deficit in the oculomotor system. The oculomotor system can be tested by evoking an optokinetic reflex (OKR), vestibulo-ocular reflex (VOR) or a visually-enhanced vestibulo-ocular reflex (VVOR). The OKR is a reflex movement that compensates for "full-field" image movements on the retina, whereas the VOR is a reflex eye movement that compensates head movements. The VVOR is a reflex eye movement that uses both vestibular as well as optokinetic information to make the appropriate compensation. The cerebellum monitors and is able to adjust these compensatory eye movements. Therefore, oculography is a very powerful tool to investigate brain-behavior relationship under normal as well as under pathological conditions (f.e. of vestibular, ocular and/or cerebellar origin).
Testing the oculomotor system, as a behavioral paradigm, is interesting for several reasons. First, the oculomotor system is a well understood neural system5. Second, the oculomotor system is relative simple6; the amount of possible eye movement is limited by its ball-in-socket architecture ("single joint") and the three pairs of extra-ocular muscles7. Third, the behavioral output and sensory input can easily be measured, which makes this a highly accessible system for quantitative analysis8. Many behavioral tests lack this high level of quantitative power. And finally, both performance as well as plasticity of the oculomotor system can be tested, allowing research on learning and memory processes9.
Genetically modified mice are nowadays widely available and they form an important source for the exploration of brain functions at various levels10. In addition, they can be used as models to mimic human diseases. Applying oculography on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors under normal and pathological conditions. Here, we describe how to measure video-oculography in mice8.

Video-oculography is a very quantitative method to investigate ocular motor performance as well as motor learning. Here, we describe how to measure video-oculography in mice. Applying this technique on normal, pharmacologically-treated or genetically modified mice is a powerful research tool to explore the underlying physiology of motor behaviors.

Vídeo oculografia-in Mice

Eye movements are very important in order to track an object or to stabilize an image on the retina during movement. Animals without a fovea, such as the ...

Neurociência

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

Um modelo de rato induzida por laser de crônica Ocular Hypertension para Caracterizar defeitos visuais

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Medicina

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

In vivo Structural Assessments of Ocular Disease in Rodent Models using Optical Coherence Tomography

Spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) is useful for visualizing retinal and ocular structures in vivo. In research, SD-OCT is a valuable tool to evaluate and characterize changes in a variety of retinal and ocular disease and injury models. In light induced retinal degeneration models, SD-OCT can be used to track thinning of the photoreceptor layer over time. In glaucoma models, SD-OCT can be used to monitor decreased retinal nerve fiber layer and total retinal thickness and to observe optic nerve cupping after inducing ocular hypertension. In diabetic rodents, SD-OCT has helped researchers observe decreased total retinal thickness as well as decreased thickness of specific retinal layers, particularly the retinal nerve fiber layer with disease progression. In mouse models of myopia, SD-OCT can be used to evaluate axial parameters, such as axial length changes. Advantages of SD-OCT include in vivo imaging of ocular structures, the ability to quantitatively track changes in ocular dimensions over time, and its rapid scanning speed and high resolution. Here, we detail the methods of SD-OCT and show examples of its use in our laboratory in models of retinal degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, and myopia. Methods include anesthesia, SD-OCT imaging, and processing of the images for thickness measurements.

Here, we describe the use of spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) to visualize retinal and ocular structures in vivo in models of retinal degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, and myopia.

Avaliações estruturais in vivo de doenças oculares em modelos de roedores utilizando tomografia de coerência óptica

Spectral-domain optical coherence tomography (SD-OCT) is useful for visualizing retinal and ocular structures in vivo. In research, SD-OCT is a valuable ...

Bioengenharia

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

Tomografia de coerência óptica Mouse ultra alta resolução para auxiliar a injeção intra-ocular em pesquisa de terapia de genes da retina

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

Na Vivo Imagem de Cx3cr1gfp/gfp repórter ratos com a tomografia de coerência óptica espectral-domínio e digitalização Laser Oftalmoscopia

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...

Avaliação das respostas do reflexo optocinético em camundongos: um novo protocolo de alta precisão

Quantification of Visual Feature Selectivity of the Optokinetic Reflex in Mice

The optokinetic reflex (OKR) is an essential innate eye movement that is triggered by the global motion of the visual environment and serves to stabilize retinal images. Due to its importance and robustness, the OKR has been used to study visual-motor learning and to evaluate the visual functions of mice with different genetic backgrounds, ages, and drug treatments. Here, we introduce a procedure for evaluating OKR responses of head-fixed mice with high accuracy. Head fixation can rule out the contribution of vestibular stimulation on eye movements, making it possible to measure eye movements triggered only by visual motion. The OKR is elicited by a virtual drum system, in which a vertical grating presented on three computer monitors drifts horizontally in an oscillatory manner or unidirectionally at a constant velocity. With this virtual reality system, we can systematically change visual parameters like spatial frequency, temporal/oscillation frequency, contrast, luminance, and the direction of gratings, and quantify tuning curves of visual feature selectivity. High-speed infrared video-oculography ensures accurate measurement of the trajectory of eye movements. The eyes of individual mice are calibrated to provide opportunities to compare the OKRs between animals of different ages, genders, and genetic backgrounds. The quantitative power of this technique allows it to detect changes in the OKR when this behavior plastically adapts due to aging, sensory experience, or motor learning; thus, it makes this technique a valuable addition to the repertoire of tools used to investigate the plasticity of ocular behaviors.

Autor em destaque: uma abordagem precisa e quantitativa para estudar a seletividade de características visuais do reflexo optocinético em camundongos 

Here, we describe a standard protocol for quantifying the optokinetic reflex. It combines virtual drum stimulation and video-oculography, and thus allows precise evaluation of the feature selectivity of the behavior and its adaptive plasticity.

Quantificação da Seletividade Visual do Reflexo Optocinético em Camundongos

The optokinetic reflex (OKR) is an essential innate eye movement that is triggered by the global motion of the visual environment and serves to stabilize ...

Alinhamento de Fibra de OCT de Retina de Camundongo com Imagens Confocais

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has been increasingly applied to obtain an objective assessment of neural damage in eye diseases. Ex vivo confocal imaging of the same retina is often necessary to validate the in vivo findings especially in animal research. In this study, we demonstrated a method for aligning an ex vivo confocal image of the mouse retina with its in vivo images. A new clinical-ready imaging technology called visible light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) was applied to acquire in vivo images of the mouse retina. We then performed the confocal imaging of the same retina as the &#34;gold standard&#34; to validate the in vivo vis-OCTF images. This study not only enables further investigation of the molecular and cellular mechanisms but also establishes a foundation for a sensitive and objective evaluation of neural damage in vivo.

Autor em destaque: Avanços na imagem da retina in vivo e ex vivo para melhorar o diagnóstico e o tratamento do glaucoma 

The present protocol outlines the steps for aligning in vivo visible-light optical coherence tomography fibergraphy (vis-OCTF) images with ex vivo confocal images of the same mouse retina for the purpose of verifying the observed retinal ganglion cell axon bundle morphology in the in vivo images.

Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Onde cortar matérias: Uma dissecção e análise de guia para a orientação espacial da Retina do rato de Marcos Ocular

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Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo

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Na Vivo Imagem de Cx3cr1^gfp/gfp repórter ratos com a tomografia de coerência óptica espectral-domínio e digitalização Laser Oftalmoscopia

Quantificação da Seletividade Visual do Reflexo Optocinético em Camundongos

Quantificação da Seletividade Visual do Reflexo Optocinético em Camundongos

Quantificação da Seletividade Visual do Reflexo Optocinético em Camundongos

Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo