Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da leucemia linfocítica crônica, como o prognóstico preciso dos pacientes. A principal vantagem dessa técnica é que ela é simples, rápida e altamente precisa. As implicações dessa técnica se estendem para um prognóstico robusto, principalmente certificações de risco com pacientes com leucemia linfocítica crônica, pois o prognóstico preciso pode definir posteriormente o manejo terapêutico da doença.
A demonstração visual deste método é fundamental, como a seleção de produtos PCR e os tipos de análise de sequência de digestão são difíceis de aprender porque requerem precisão e experiência. Para iniciar este procedimento, adicione 200 microliters de EDTA a um tubo de coleta estéril de 50 mililitros. Adicione 20 mililitros de sangue periférico e 15 mililitros de meio RPMI ao tubo e pipeta para cima e para baixo duas a três vezes para misturar.
Em seguida, adicione 15 mililitros de média gradiente de densidade a um novo tubo de coleta de 50 mililitros. Coloque lentamente a solução sanguínea periférica no meio gradiente de densidade, certificando-se de que ela não interrompa o gradiente. Centrifugar a 800 vezes G por 20 minutos com o freio centrífuga desligado.
Em seguida, use uma pipeta pasteur estéril para coletar o anel de célula mononuclear que se formou entre a camada de plaqueta de plasma superior e a camada média gradiente de densidade e transferi-la para um novo tubo de coleta de 15 mililitros estéreis. Adicione o meio RPMI de tal forma que o volume final seja de 12 mililitros e pipeta a solução para cima e para baixo para misturar. Centrifugar a 800 vezes G por oito minutos.
Descarte o supernatante e suspenda a pelota celular com 10 mililitros de meio RPMI. Centrifuge novamente a 750 vezes G por oito minutos. Depois disso, descarte o supernasce e dissolva a pelota celular em um mililitro de PBS.
Usando uma nova placa Bauer, forme uma contagem de células misturando 20 microliters de amostra e 80 microliters de uma a 10 solução turca. Se o processamento a jusante da amostra não for agendado para o mesmo dia, centrifugar a amostra a 750 vezes G durante oito minutos. Descarte o supernasce e armazene a pelota da célula a menos 80 graus Celsius.
Primeiro, prepare a mistura de primer usando quantidades equimolares de cada primer do subgrupo para garantir a amplificação imparcial. Misture os reagentes PCR conforme listado na tabela dois do protocolo de texto. Adicione 0,5 microliters de polimerase TAP ao tubo PCR contendo os reagentes PCR mistos.
Em seguida, adicione 100 nanogramas de gDNA ou dois microliters de cDNA. Execute o protocolo PCR térmico conforme detalhado na tabela três do protocolo de texto. Depois disso, verifique se há produtos PCR de aproximadamente 500 pares de base ao usar primers de litro IGHV ou 350 pares de base ao usar as misturas de primer IGHPFR1.
Para iniciar a purificação do produto PCR, carregue o volume total do produto PCR em um gel de recuperação de 3% de baixa fusão. Deixe que os produtos PCR sejam executados no gel até que se separem do plano de fundo. Extire as bandas pcr proeminentes afiadas e, em seguida, purificá-las e elute-los.
Se dois rearranjos forem detectados, ambas as bandas devem ser extirpadas e sequenciadas separadamente. Para realizar a limpeza exo-sap, siga as instruções do fabricante sobre os volumes específicos a serem utilizados. Vórtice suavemente cada amostra para misturá-los e incuba-los em um bloco PCR a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Inativar as enzimas aquecendo-as a 85 graus Celsius por 15 minutos. Depois disso, carregue uma pequena quantidade de produtos PCR em um gel de 3% de agarose para avaliar a pureza do produto. O último ponto de verificação antes do sequenciamento é determinar a clonalidade da amostra usando análise de fragmentos.
Para começar a analisar a sequência, inicie o software apropriado. Especifique a espécie, como homo sapiens, e o tipo receptor ou lócus. Acelere as sequências a serem analisadas em formato fasta e incluindo identificadores na área de texto em lotes de até 50 sequências por execução.
Em seguida, escolha uma das três opções de exibição a seguir para os resultados. Visualização detalhada:escolha esta opção para obter os resultados de cada sequência individualmente. Exibição de síntese:escolha esta opção para compilar uma tabela de resumo encomendada pelo gene IGHV e nome de alelo ou por ordem de entrada sequencial.
Esta opção também fornece um alinhamento de sequências que em qualquer lote enviado são atribuídos ao mesmo gene IGHV e alelo e, por último, arquivo Excel. Escolha esta opção para fornecer todos os arquivos de saída como planilhas incorporadas em um único arquivo. Somente o uso de primers de litro IGHV permite a amplificação de toda a extensão do IGHV reorganizado, permitindo assim que a verdadeira carga HSM seja determinada.
O produto PCR esperado é de aproximadamente 500 pares de base. Em casos raros em que os primers de litro IGHV não podem amplificar o rearranjo clonotypic IG, os primers IGHBFR1 podem ser usados. O produto PCR esperado é de aproximadamente 350 pares de base.
As sequências obtidas são então analisadas usando a ferramenta IMG TV Quest. A primeira linha na tabela de resultados afirma que a funcionalidade da sequência, uma vez que uma sequência rearranjada de IG pode ser produtiva ou improdutiva. Um rearranjo genético IGH é improdutivo é parar códons estão presentes na região VDJ e/ou se o rearranjo está fora de quadro devido a inserções/exclusões.
É importante ressaltar que apenas rearranjos produtivos e, portanto, funcionais devem ser analisados mais adiante. Ao usar os parâmetros padrão do IMG TV Quest, as inserções e exclusões não são detectadas automaticamente, porém fortes indicações de que uma sequência pode levar tais alterações são fornecidas pela ferramenta e um alerta de alerta aparece abaixo da tabela de resumo do resultado. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de pousar os produtos PCR no gel por tempo suficiente para que o vínculo clonal possa ser discriminado a partir do fundo policlonal.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da imunogenética de leucemia linfocítica crônica explorarem o impacto prognóstico do status de epimutação somática em pacientes. Não se esqueça que trabalhar com brometo de etilium pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar sob o capô em todos os momentos devem ser tomadas durante a realização deste procedimento.
