Agradecemos a Anne Dodson e Stephanie Heinrich para aconselhamento sobre como otimizar o protocolo smFISH, Xavier Darzacq para ajudar com a plataforma de análise, Haiyan Huang para sugestões sobre a análise estatística. Este trabalho foi financiado por fundos da March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) e Glenn Foundation para EÜ e um NSF pós-graduação Research Fellowship Grant no. DGE-1106400 de JC.

Nota: Todos os buffers e os suportes utilizados neste protocolo são listados na tabela 1. As informações do fornecedor para os reagentes são listadas na Tabela de materiais.
Dia 1/dia 1-2:
Nota: Para a cultura vegetativa, desenvolvem-se células para uma OD600 de 0,4 a 0,6 em meio preferencial. Para cultura meiótica, induzi células submeter-se a meiose, usando um método preferido (normalmente cultivo em uma OD600 de 1,85).
1. fixação e digestão da amostra
<ol><li>Conserte um total de ~3.5 OD600 de células em formol 3%.<ol>
<li>Para cultura vegetativa, adicione 5,52 mL da cultura a 480 µ l de formol de 37% em tubos cônicos de 15 mL.</li>
		<li>Para cultura meiótica, adicione 1840 µ l de cultura a 160 µ l de formol de 37% em 2 mL microcentrifuge tubos. Inverter ~ 5 vezes para misturar. Atenção: O formol é tóxico. Manuseie e elimine de acordo com regulamentos institucionais.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque os tubos em um tambor de cilindro em temperatura ambiente por 20 min. Para amostras meióticas, após a fixação em temperatura ambiente por 20 min, continuam durante a noite de fixação no 4 ˚ c, rotação. Nota: A fixação durante a noite aumenta a reprodutibilidade e a qualidade dos dados smFISH obtidos para as amostras meióticas. Tempo de fixação deve ser otimizado.</li>
	<li>Enquanto as amostras estiver corrigindo, descongele 200mm vanadil Ribonucleoside complexos (VRC) em 65 ˚ c durante pelo menos 10 minutos.</li>
	<li>Preparar a mistura de mestre digestão em um tubo de 15 mL: para 1 amostra, misturar 425 µ l de tampão B com 40 µ l de 200mm VRC (aquecido a 65 ˚ c); para 5 amostras, misture 2125 µ l de tampão B com 200 µ l de 200mm VRC (aquecido a 65 ˚ c). Vórtice ~ 5 s para totalmente resuspenda o VRC antes de adicionar à mistura de mestre, que irá aparecer a luz verde acastanhado após adição da VRC. Nota: Adição de VRC durante a digestão melhora a consistência dos resultados smFISH, potencialmente, inibindo o contaminante de nuclease introduzido pela mistura de zymolyase, que é purificada do extrato bruto. A quantidade de VRC necessário a esta etapa deve ser otimizada.</li>
	<li>Para amostras vegetativas, centrifuga os tubos no ~ 1057 x g durante 3 minutos. Para amostras meióticas (após a fixação da noite), centrifugar a 21.000 x g, durante 1,5 min. decantar ou aspirar o sobrenadante para resíduos de formaldeído. Nota: Todas as etapas de centrifugação são realizadas à temperatura ambiente.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1,5 mL de frio Buffer B pipetando para cima e para baixo ou invertendo os tubos e passando rapidamente para misturar. Transferi amostras vegetativas para tubos de 2 mL após ressuspensão.</li>
	<li>Centrifugue a 21.000 x g 1,5 min. remover a maior parte do líquido por aspiração vácuo ou pipetando, deixando para trás ~ 100 µ l.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1,5 mL de frio B. Buffer</li>
	<li>Centrifugue a 21.000 x g 1,5 min. remover a maior parte do líquido por aspiração vácuo ou pipetando, deixando para trás ~ 100 µ l.</li>
	<li>Ressuspender as células em 1,5 mL de frio Buffer B. Centrifugue a 21.000 x g 1,5 min. aspirado o líquido completamente por vácuo ou pipetando.</li>
	<li>Ressuspender as células em 425 µ l de mistura de mestre de digestão e brevemente vórtice para ressuspender. Adicione 5 µ l de zymolyase de 10 mg/mL de 100T a cada tubo. Nota: Vórtice a zymolyase toda vez antes de adicionar aos tubos. Zymolyase adicione a cada tubo individualmente, em vez de adicionar à mistura de mestre. Ambas as etapas ajudam a manter a consistência de digestão entre os tubos, porque zymolyase precipita-se rapidamente.</li>
	<li>Vórtice de 2-3 s para misturar. Coloque os tubos em um tambor de cilindro e digerir a 30 ˚ c durante 15-30 min. Para as células vegetativas e primeiros estágios meióticos, normalmente demora ~ 15 min, e para prófase meiótica e divisões meióticas, normalmente demora ~ 30 min. Nota: Verifique no microscópio cada 5 min depois de 15 min e parar a digestão quando aparecem de ~ 80% das células não-transparente e não-refrativa. De agora em diante, as células são muito frágeis. Lidar com células suavemente e evitar o uso de vácuo aspiração ou num Vortex.
</li>
	<li>Centrifuga os tubos no ~ 376 x g durante 3 min. Retire o líquido completamente pipetando.</li>
	<li>Resuspenda suavemente células com 1 mL de tampão B pipetando acima e para baixo 1 - 2 vezes para misturar.</li>
	<li>Centrifuga os tubos a ~ 376 x g durante 3 min. líquido de remover o tampão B pipetando. Delicadamente Ressuspender as células em 1 mL de etanol a 70% (diluído com água livre de RNase).</li>
	<li>Incube a temperatura ambiente para 3,5-4 horas.</li>
</ol>2. hibridação
<ol><li>Levar o formamide à temperatura (para alíquota de 50 mL, leva ~ 30 min em banho-maria). Nota: Não abra a garrafa de formamida até a garrafa atinja a temperatura ambiente para evitar a oxidação de formamida. Cuidado: Formamida é tóxica. Manuseie e elimine de acordo com regulamentos institucionais.</li>
	<li>Prepare o tampão de lavagem de formamida 10% em um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Centrifuga os tubos no ~ 376 x g durante 3 min. remover 500 µ l de etanol 70% por pipetagem. Suavemente a pipeta acima e para baixo para Ressuspender as células restantes e então transferir as células para tubos de baixa aderência. Nota: Utilizando tubos de baixa aderência grandemente reduz a perda de células durante lavagens subsequentes.</li>
	<li>Centrifuga os tubos novamente a ~ 376 x g durante 3 min. remover todo o etanol pipetando.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de tampão de lavagem de formamida 10% e suavemente pipeta acima e para baixo, 2 - 3 vezes para Ressuspender as células.</li>
	<li>Permitir que as células para sentar-se à temperatura ambiente por ~ 20 min enquanto se prepara a solução de hibridação. Para 1 amostra, misture 50 µ l de tampão de hibridização (sala temp.), 5 µ l de 200mm VRC (aquecido a 65 ˚ c) e 1 µ l de cada sonda (final de 200 nM). Para 5 amostras, misture 250 µ l de tampão de hibridização (sala temp.), 25 µ l de 200mm VRC (aquecido a 65 ˚ c) e 5 µ l de cada sonda (final de 200 nM).<ol>
<li>Descongele o tampão de hibridização (congelado a-20 ˚ c) à temperatura ambiente antes de abrir o tubo para evitar a oxidação de formamida.</li>
		<li>Depois de adicionar a 200mm VRC, vórtice para 5-10 s antes de adicionar as sondas, que são projetados adquiridos comercialmente e reconstituído de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Se duas sondas são incubadas co, adicione 1 µ l da 01:10 diluição do estoque a sonda #1, bem como 1 µ l da 01:10 diluição da unidade populacional de sonda #2, tornar-se uma diluição final de ~ 1: 500 para cada sonda. A concentração necessária para o melhor sinal-para-ruído precisa ser otimizado (ver discussão para detalhes).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar as amostras no ~ 376 x g durante 3 min. Retire o sobrenadante em resíduos perigosos pipetando.</li>
	<li>Adicione pelo menos 50 µ l de solução de hibridização de cada tubo. Agite os tubos para misturar.</li>
	<li>Incube a 30 ˚ c em um tambor de cilindro pelo menos 16 horas no escuro.</li>
</ol>Dia 2/dia 3
3. lavar e imagem
<ol><li>Levar o formamide à temperatura.</li>
	<li>Prepare-se 10% formamida o tampão de lavagem (FWB) em um tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Retirar os tubos do tambor de rolo e coloque-os em uma caixa de folha-cobertas para proteger da luz.</li>
	<li>Centrifugar as amostras no ~ 376 x g durante 3 min. Retire o sobrenadante em resíduos perigosos pipetando.</li>
	<li>Resuspenda em 1 mL de 10% FWB suavemente pipetando acima e para baixo 2 - 3 vezes.</li>
	<li>Incube a 30 ˚ c por 30 min (não rotativos) na caixa de folha-cobertas.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a ~ 376 x g por 3 min. Retire o sobrenadante para resíduos perigosos por pipetagem e deixar ~ 50 µ l.</li>
	<li>Enquanto isso, preparar DAPI/FWB em um tubo cônico de 15 mL: para 1 amostra, misturar 1000 µ l de tampão de lavagem de formamida 10% com 1 µ l de 5mg/mL DAPI. Para 10 amostras, misture 10 mL de tampão de lavagem formamide 10% com 10 µ l de 5mg/mL DAPI. Resuspenda em 1 mL de DAPI/FWB suavemente pipetando acima e para baixo 2 - 3 vezes.</li>
	<li>Incube a 30 ˚ c por 30 min (não rotativos) na caixa de folha-cobertas.</li>
	<li>Descongele os reagentes antilixívia no gelo.</li>
	<li>Centrifugar as amostras no ~ 376 x g durante 3 min. Retire o sobrenadante completamente pipetando. Se necessário, centrifugue novamente para remover todo o sobrenadante.</li>
	<li>Para as amostras que não são imagem imediatamente, resuspenda o pellet em 50 µ l de Buffer GLOX sem enzimas. Pipeta acima e para baixo 3 - 4 vezes para misturar.<ol>
<li>Mantenha todas as amostras unimaged na caixa folha-cobertas no 4 ˚ c até que esteja pronto a imagem. Quando estiver pronto para a imagem, Centrifugar as amostras a ~ 376 x g por 2 min e retire o sobrenadante completamente por pipetagem. Resuspenda em GLOX com enzimas como abaixo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para amostras sendo fotografada imediatamente, adicionar 15 a 20 µ l de tampão GLOX com enzimas. Suavemente a pipeta para cima e para baixo se misturam. Nota: O volume adicionado pode variar dependendo do tamanho do centrifugado. Recomendamos que resuspending a pelota em 15 µ l de tampão GLOX com enzimas e verificar a densidade de células em microscópio. Se são demasiado densas (células aglutinação uns sobre os outros), adiciona extra reserva GLOX com enzimas. Se as células são muito escassas, centrifugar a amostra e remover ~ 5 µ l de tampão.</li>
	<li>Pipetar 5 µ l para uma lamela (18 x 18, n. º 1) e colocar a lamela em um slide.</li>
	<li>Coloca uma limpeza de laboratório em cima do slide onde a lamela é colocada. Pressione suavemente sobre a limpeza de laboratório para definir o slide (deve ver líquido saindo de todas as quatro bordas da lamela).</li>
	<li>Transferi o slide para o quarto de microscópio em uma caixa coberta por papel alumínio.</li>
	<li>Imagem usando um microscópio de fluorescência de campo amplo com alta ampliação (60-100x) e alta abertura numérica. Observação: Para coletar o número máximo de fótons emitidos por sondas smFISH, microscópios confocal não são recomendados, como eles limitam significativamente a quantidade de luz a serem coletados. Aqui, os dados foram coletados em um microscópio equipado com 100 X, objectivo de at 1.4, usando filtros CY5 (EX632/22, EM679/34) fotografada em 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; e DAPI (EX390/18, EM435/48), 0,05-0,1 s, T. 32-50% Uma imagem brilhante-campo referência também deve ser adquirida. Adquirir 15-25 fatias com um tamanho de passo de 0,1-0,2 µm, de inteiramente abaixo o foco do campo de visão inteiramente acima, a fim de garantir que todos os pontos do RNA são contabilizados.</li>
</ol>4. análise de imagens
<ol><li>Analise os dados de smFISH com ferramentas de análise de smFISH publicado como peixe-quant17 e plateia2ou com programas feitos sob medidos, conforme as suas necessidades exatas do experimento. Nota: Um pipeline de boa análise deve permitir que os usuários determinar um limite para separar os verdadeiros pontos de RNA do fundo e estatísticas, tais como as coordenadas X, Y e Z (opcionais) e a intensidade de cada ponto, o número de pontos em cada célula de saída e possivelmente montagem parâmetros como uma maneira de filtrar as detecções falsas.</li>
</ol>

<ol>
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H., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+detection+of+single+mRNA+molecules+in+situ.">Allele-specific detection of single mRNA molecules in situ.</a> Nat Methods. 10 (9), 869-871 (2013).</li><li>Ginart, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+allele-specific+expression+in+single+cells+reveals+epigenetic+mosaicism+in+an+H19+loss-of-imprinting+mutant.">Visualizing allele-specific expression in single cells reveals epigenetic mosaicism in an H19 loss-of-imprinting mutant.</a> Genes Dev. 30 (5), 567-578 (2016).</li><li>Long, R. 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Os autores não têm nenhum conflito de interesses para divulgar.

O protocolo aqui apresentado é derivado de outros publicados smFISH protocolos2,3,21,22,23e é especificamente otimizado para o fundo de cepa de levedura SK1. Os parâmetros otimizados incluíam o número do celular, duração de fixação, velocidade de centrifugação e duração, duração da digestão, tampão de digestão, concentração de sonda e tampão de hibridização. Outros parâmetros como temperatura de hibridização e duração não foram otimizados. Nesta seção, nós compartilhamos algumas notas que ajudam a se adaptar a este protocolo para qualquer fundo de cepa de levedura e as condições de crescimento de interesse.
Parede celular de leveduras brotamento é um grande desafio contra a obtenção de imagens de alta qualidade smFISH em brotamento fermento porque a parede celular impede a penetração da sonda. Digestão incompleta da parede celular por zymolyase leva a ineficiente hibridização de sondas e alta variabilidade de célula para célula no sinal. No entanto, digestão excesso pode tornar as células muito frágil, levando a significativa perda de células durante as etapas de lavagem e estourando durante a preparação de slides para a imagem latente da pilha. Assim, otimizando a duração da digestão é crucial. Recomendamos a realização de um experimento piloto smFISH digerindo a mesma amostra para diferentes quantidades de tempo. No nosso caso, obtivemos os dados smFISH melhores se nós paramos a digestão quando tornou-se ~ 80% das células não-refrativa. Normalmente, para a mesma condição de crescimento diferentes cepas mutantes genéticas podem ser digeridas com sincronismo semelhante. No entanto, a duração da digestão diferente quando comparada entre as condições de crescimento diferentes e diferentes estágios da meiose em leveduras brotamento. Uma vez que o calendário é determinado, a qualidade do smFISH é reproduzível. Nota que para cepas mutantes de síntese da parede de celular com defeito e/ou composição, a digestão pode ser concluída em menos de 15 min. utilização de diferentes lotes de zymolyase também ligeiramente pode mudar o tempo de digestão.
Concentração de sonda ideal é necessária para alcançar uma alta relação sinal-ruído. Projetamos e comprou nossas sondas smFISH comercialmente. Boas sondas (geralmente 20-mers) devem ter uma porcentagem de GC variando de 35% a 45%, um espaçamento mínimo de 2 pares de base entre as sondas e baixa reatividade cruzada. Usamos um designer sonda baseado na web do fabricante para gerar uma lista de pontas de prova, e se houvesse suficiente sondas para escolher, nós usaríamos o algoritmo de explosão no banco de dados do genoma de Saccharomyces para eliminar as sondas com mais de 17 pares de base sobrepostos com outras regiões genômicas. Escolhemos a mais fotoestável tintura fluorescente (CAL Fluor 590) para o conjunto de sonda anneals para a região única de NDC80luti (CF. 590), porque neste conjunto, o número de testes que satisfeitos todos os critérios acima (20 testes) foi menor do que o número mínimo recomendado pelo fabricante (~ 25 sondas). Após reconstituir a solução de sonda, seguindo as instruções do fabricante, nós fizemos um 01:10 diluição da solução estoque e armazenados a solução diluída em alíquotas de 5 µ l em-20 ˚ c. Cada alíquota foi usada apenas uma vez. Para a otimização, um deve fazer serial diluições das 01:10 diluído solução e teste a concentração que produz a melhor relação sinal-ruído. Recomendamos fazer uma série de diluição de 1: 250, 1: 500, 1: 1000 e 1: 2000 do estoque original. No nosso caso, um fator de diluição 1: 500 resultou na melhor relação sinal-ruído, para ambos os 590 CF e 670 Q conjuntos de sonda.
Tempo de fixação ideal também é fundamental para o sucesso smFISH em leveduras brotamento. Temos encontrado que a fixação da noite no 4 ˚ c, ao invés de fixação à temperatura ambiente por 20 min, melhorou significativamente a consistência e a qualidade dos resultados smFISH para amostras meióticas. Embora nós não testamos como durante a noite fixação pode impactar amostras vegetativas, fixação à temperatura funcionou bem para esta condição de crescimento. Assim, para otimizar o protocolo smFISH para novas cepas ou condições de crescimento, recomendamos começar com tempo curto fixação à temperatura ambiente e aumentar o tempo de fixação se alta variabilidade do sinal é encontrada.
Em comparação com outros protocolos publicados3,22,23, nosso protocolo usa o inibidor de RNase VRC durante a digestão e uma maior concentração de VRC durante a hibridação. Adição de VRC nessas duas etapas melhorou a consistência dos resultados smFISH, possivelmente por melhor preservar as moléculas do RNA contra a atividade de nuclease, que podem ser introduzidos pela mistura de zymolyase (a enzima é purificada a partir de extratos brutos e pode conter RNase contaminantes). Assim, nós recomendamos usar a quantidade de VRC, conforme listado no nosso protocolo ou mesmo umas concentrações mais elevadas de VRC para otimização.
Uma parcela significativa das células pode ser perdida durante as etapas de lavagem em tampão B e o tampão de lavagem de formamida. Para reduzir a perda de células, pode-se aumentar a velocidade de centrifugação. No nosso caso, usando uma velocidade alta (21.000 x g) para nossas amostras de pelotas durante o Buffer B lava perda celular significativamente reduzida. No entanto, células tornam-se muito frágil após a digestão de zymolyase, portanto não é recomendado alterar a velocidade de centrifugação. Em vez disso, nós sugerimos o uso dos tubos de baixa aderência na Scientific EUA, que ajudam muito as células de pelotas durante as lavagens no tampão de lavagem de formamida. No geral, nosso protocolo pode gerar consistentemente uma monocamada de células densas o bastante para a imagem latente eficiente. Normalmente, 7 campos de vista deve render > 130 células apropriadas para quantificação.
Por último, é importante determinar os parâmetros ideais para e as saídas necessárias de análise de imagem. Para detectar manchas de smFISH, programas de análise publicada comumente filtram as imagens raw usando o kernel gaussiano para remover o sinal de fundo e perguntar aos usuários para determinar a relação sinal-ruído para usar para cada conjunto de imagens de2,17. Infelizmente, não há atualmente um único padrão pelo qual são determinados os parâmetros adequados, e então alguns testes empíricos dessas diferentes configurações é necessário. Para definir os parâmetros necessários para cada um destes passos, um precisa iterativamente diferentes conjuntos de parâmetros de entrada e verificar o quanto os resultados obtidos de cada conjunto corresponde da contagem manual em algumas células representativas. Uma vez que encontra-se um conjunto de parâmetros, pode ser usada para a maioria das imagens obtidas apesar das condições de crescimento diferente e origens genéticas.
Além disso, um pode testar se a projeção de intensidade máxima das imagens smFISH pode ser realizada antes da quantificação22. Este passo simplifica o algoritmo de detecção local e reduz significativamente o tempo de geração de imagens, embora à custa de algumas informações potencialmente úteis sobre pontos individuais, tais como sua localização subcellular. No nosso caso, o número de moléculas de mRNA produzido pelo gene NDC80 foi baixo o suficiente para que as manchas eram bem separadas após esse processamento (não é incomum para as transcrições em brotamento fermento3,7). Em casos onde o colocalization análise é crítico, o pipeline de análise precisa determinar a localização de cada ponto de smFISH em cada canal para avaliar colocalization. Dependendo as perguntas específicas sendo perguntado, outras informações como a intensidade de cada ponto também podem precisar de ser extraído o pipeline para posterior análise. Otimizando a chave entra o protocolo e o pipeline de análise de imagem é crucial na obtenção de alta qualidade de dados smFISH para estudar a questão de interesse.

Dinâmica regulação da expressão genética impulsiona o desenvolvimento de um organismo, bem como a sua resposta ao estresse ambiental, infecção e alterações no metabolismo. Estudos que se concentram no Regulamento transcriptional dependem de tecnologias que medem a abundância de RNA. Um tal método, denominado única molécula fluorescência em situ da hibridação (smFISH), é utilizado para detecção de moléculas individuais de RNA em células únicas1,2. Esse método permite que a medição da variabilidade na expressão gênica celular para celular e determinação da localização intracelular de RNA.
A técnica mais comumente usados smFISH, a detecção de uma molécula de RNA individual exige vários curtas sondas de DNA (frequentemente ~ 48 20-mer sondas) que são complementares ao RNA alvo e são conjugadas para a mesma tintura fluorescente. Ligação de uma única sonda fluorescente resulta num sinal fraco, mas o sinal do conjunto de todas as sondas é robusto. Esse recurso melhora a relação sinal-ruído porque mesmo que um único teste pode apresentar vinculação fora do alvo, tal sinal deverá ser muito fraco em relação ao que o destino de molécula de RNA3. No erro de deteção, o número de moléculas de RNA pode ser contado e comparado através de várias condições de crescimento e entre diferentes mutantes.
Desde seu primeiro desenvolvimento, foi adaptada para estudar vários aspectos da expressão gene4, tais como a transcrição alongamento1,2, emenda5,6, transcriptional estourando7 smFISH , 8 , 9, expressão alélica intracelular de11,10,12e RNA localização13,14,15. Recentemente, nós usamos este método para estudar a expressão de duas isoformas de transcrição do gene da mesma, em que a isoforma de transcrição curta (NDC80ORF) tem sua sequência toda compartilhada com o isoform longo (NDC80luti )16. Para identificar com exclusividade as duas isoformas de mRNA, usamos dois conjuntos de sonda: um conjunto é específico para a sequência única de NDC80luti, e o outro conjunto, conjugado com outra tintura fluorescente, vincula-se à região comum das duas isoformas. O NDC80luti RNA é identificado como um ponto colocalized com ambos os sinais fluorescentes, Considerando que o NDC80ORF RNA é aquele que contém apenas o sinal do conjunto de sonda comum. Desde o número da NDC80ORF transcrições é calculado por um método de "subtração", alta eficiência de hibridização da sonda e uma alta relação sinal-ruído são necessários com confiança identificar pontos smFISH e reduzir o erro propagação.
Este artigo descreve um protocolo otimizado para executar smFISH no brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. No presente protocolo, o número do celular, tempo de fixação, tempo de digestão, tampão de digestão, sonda concentração e hibridação buffer usado para os experimentos de smFISH foram otimizados para o SK1 estirpe fundo de S. cerevisiae em fase vegetativo crescimento ou meiose. No entanto, constatamos também neste manuscrito: (1) o método para verificar a qualidade dos dados de smFISH após a aquisição da imagem e (2) os passos no protocolo que podem exigir a otimização adicional para a tensão de diferentes origens e condições de crescimento.

<table><tbody><tr><td>BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>Store at 4 &amp;deg;C for short-term. Vortex before use.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td>Store at -20 &amp;deg;C after reconstitution in water. Protect from light.</td></tr><tr><td>50% Dextran Sulfate</td><td>Milli Pore</td><td>S4030</td><td>Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in water.</td></tr><tr><td>Ethanol (100%, 200 proof)</td><td>various</td><td></td><td>Flammable.</td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>various</td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C after dissolving in nuclease-free water.</td></tr><tr><td>Glucose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td><td>various</td><td></td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Probe library, diluted in TE, pH 8.0&amp;nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots (5 &amp;micro;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>various</td><td></td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots.</td></tr><tr><td>200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in water.</td></tr><tr><td>Low-adhesion tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>Store at room temperature.</td></tr></tbody></table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Única molécula fluorescência situ hibridação in (smFISH) é uma técnica poderosa para estudar a expressão gênica em células únicas devido à sua capacidade de detectar e contar as moléculas de RNA individuais. Complementares aos métodos baseados em sequenciamento profundos, smFISH fornece informações sobre a variação de célula para célula em abundância de transcrição e a Localização subcellular de um determinado RNA. Recentemente, temos usado smFISH para estudar a expressão do gene NDC80 durante a meiose em leveduras brotamento, na qual dois transcrição isoformas existem e a isoforma de transcrição curta tem sua sequência toda compartilhada com o isoform longo. Para identificar com confiança cada isoforma de transcrição, nós otimizadas conhecidos smFISH protocolos e obteve alta consistência e qualidade dos dados de smFISH para as amostras adquiridas durante a brotação fermento meiose. Aqui, descrevemos este protocolo otimizado, os critérios que usamos para determinar se é obtida a alta qualidade dos dados de smFISH e algumas dicas para a aplicação do presente protocolo em outras cepas de leveduras e condições de crescimento.

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Esta molécula fluorescência em situ da hibridação protocolo é otimizado para quantificar o número de moléculas de RNA em leveduras brotamento durante a meiose e crescimento vegetativo.

Única molécula fluorescência In Situ Hybridization (smFISH) análise em Budding fermento crescimento vegetativo e meiose

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

19.2K visualizações.  University of California, Berkeley. Esta molécula fluorescência em situ da hibridação protocolo é otimizado para quantificar o número de moléculas de RNA em leveduras brotamento durante a meiose e crescimento vegetativo.

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A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

Uma técnica rápida para a visualização de células vivas de levedura Imobilizado

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Biologia

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

Uso de hibridização in situ de fluorescência (FISH) para monitorar o estado da coesão do braço em oócitos de Drosophila na prometáfase e na metáfase I

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativas de células vivas de Análise de microscopia de fluorescência de levedura

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopia do ciclo de vida sexual por fissão de levedura

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal remodeling and vesicular trafficking in living cells. Quantitative methodologies using chimeric GFP fusions have been developed for many applications; however, GFP is somewhat resistant to proteolysis, thus its fluorescence persists in the lysosome/vacuole, which can impede quantification of cargo trafficking in the endocytic pathway. An alternative method for quantifying endocytosis and post-endocytic trafficking events makes use of superecliptic pHluorin, a pH-sensitive variant of GFP that is quenched in acidic environments. Chimeric fusion of pHluorin to the cytoplasmic tail of transmembrane cargo proteins results in a dampening of fluorescence upon incorporation of the cargo into multivesicular bodies (MVBs) and delivery to the lysosome/vacuole lumen. Thus, quenching of vacuolar fluorescence facilitates quantification of endocytosis and early events in the endocytic pathway. This paper describes methods using pHluorin-tagged cargos for quantification of endocytosis via fluorescence microscopy, as well as population-based assays using flow cytometry.

Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.

Aplicações de pHluorin para Quantitative, Kinetic e de alta capacidade: Análise de endocitose em brotamento Yeast

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...