Name: single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis
Uploaded: 2018-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis at JoVE.com

Ringraziamo Anne Dodson e Stephanie Heinrich per consigli su come ottimizzare il protocollo smFISH, Xavier Darzacq per aiutare con la piattaforma di analisi, Haiyan Huang per suggerimenti sull'analisi statistica. Questo lavoro è stato sostenuto dal March of Dimes (5-FY15-99), Pew Charitable Trusts (00027344), Damon Runyon Cancer Research Foundation (35-15) e Glenn Foundation a EÜ e un NSF Graduate Research Fellowship Grant No. DGE-1106400 JC.

Nota: Tutti i buffer e i media utilizzati in questo protocollo sono elencati nella tabella 1. Le informazioni sul fornitore per i reagenti è elencati nella Tabella materiali.
1 giorno/1 e 2 giorno:
Nota: Per cultura vegetativo, far crescere cellule a un OD600 di 0,4 e 0,6 in un mezzo comodo. Per cultura meiotica, indurre le cellule per subire la meiosi utilizzando un metodo preferito (in genere la coltura in un OD600 di 1.85).
1. la fissazione e la digestione del campione
<ol><li>Difficoltà un totale di ~3.5 OD600 delle cellule in 3% di formaldeide.<ol>
<li>Per cultura vegetativo, aggiungere mL 5,52 della cultura a 480 µ l di formaldeide al 37% in provette coniche da 15 mL.</li>
		<li>Per cultura meiotica, µ l 1840 di cultura a 160 µ l di formaldeide al 37% in 2 mL microcentrifuga. Capovolgere ~ 5 volte per mescolare. Attenzione: La formaldeide è tossica. Gestire e smaltire secondo le normative istituzionali.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inserire le provette su un rullo di tamburo a temperatura ambiente per 20 min. Per campioni meiotici, dopo aver sistemato a temperatura ambiente per 20 min, continuano a fissaggio durante la notte a 4 ˚ c, rotazione. Nota: La fissazione durante la notte aumenta la riproducibilità e la qualità dei dati smFISH ottenuti per i campioni meiotici. Tempo di fissaggio deve essere ottimizzato.</li>
	<li>Mentre i campioni sono di fissaggio, scongelare 200 mM Vanadyl Ribonucleoside complessi (VRC) a 65 ˚ c per almeno 10 min.</li>
	<li>Preparare il mix master digestione in una provetta da 15 mL: per 1 campione, mescolare 425 µ l di tampone B con 40 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c); per 5 campioni, mescolare 2125 µ l di tampone B con 200 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c). Vortice ~ 5 s per risospendere completamente il VRC prima di aggiungere il mix master, che apparirà verde brunastro chiaro dopo aggiunta di VRC. Nota: Aggiunta di VRC durante la digestione migliora l'uniformità dei risultati smFISH, potenzialmente inibendo il contaminante di nucleasi introdotto dalla miscela di zymolyase, che è purificata dal greggio estratto. La quantità di VRC necessaria a questo punto dovrebbe essere ottimizzata.</li>
	<li>Per i campioni vegetativi, centrifugare le provette a ~ 1057 x g per 3 min. Per campioni meiotici (dopo la fissazione durante la notte), centrifugare a 21.000 x g per un minimo di 1,5 decantare o aspirare il supernatante a rifiuti di formaldeide. Nota: Tutte le fasi di centrifugazione vengono eseguite a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1,5 mL di tampone freddo B pipettando su e giù o invertendo i tubi e sfogliando per mescolare. Trasferire campioni vegetativi 2 mL provette dopo la risospensione.</li>
	<li>Centrifuga a 21.000 x g per un minimo di 1,5 rimuovere la maggior parte del liquido tramite aspirazione a vuoto o di pipettaggio, lasciando dietro di sé ~ 100 µ l.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1,5 mL di tampone freddo B.</li>
	<li>Centrifuga a 21.000 x g per un minimo di 1,5 rimuovere la maggior parte del liquido tramite aspirazione a vuoto o di pipettaggio, lasciando dietro di sé ~ 100 µ l.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1,5 mL di freddo Buffer B. Centrifugare a 21.000 x g per un minimo di 1,5 aspirato il liquido completamente dal vuoto o di pipettaggio.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 425 µ l di mix master di digestione e brevemente vortice per risospendere. Aggiungere 5 µ l di 100T 10mg/mL zymolyase ad ogni provetta. Nota: Vortex zymolyase ogni volta prima aggiunta ai tubi. Zymolyase aggiungere ad ogni provetta individualmente, invece di aggiungere al mix master. Entrambi i passaggi aiutano a mantenere la coerenza di digestione tra tubi perché zymolyase precipita rapidamente.</li>
	<li>Vortice 2-3 s per mescolare. Posizionare i tubi su un tamburo rullo e digerire a 30 ˚ c per 15-30 min. Per cellule vegetative e prime fasi meiotic, prende solitamente ~ 15 min e per Profase Meiotica e divisioni meiotiche, prende solitamente ~ 30 min. Nota: Verificare sul microscopio ogni 5 min dopo 15 min ed interrompere la digestione quando ~ 80% delle cellule appaiono non trasparente e rifrangente. Da questo punto in poi, le cellule sono molto fragili. Gestire le celle delicatamente ed evitare tramite aspirazione a vuoto o tramite vortex.
</li>
	<li>Centrifugare le provette a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il liquido completamente pipettando.</li>
	<li>Risospendere delicatamente le cellule con 1 mL di tampone B pipettando su e giù 1 - 2 volte per mescolare.</li>
	<li>Centrifugare le provette a ~ 376 x g per 3 min liquido rimuovere Buffer B pipettando. Risospendere delicatamente le cellule in 1 mL di etanolo al 70% (diluito con acqua priva di RNasi).</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 3,5-4 ore.</li>
</ol>2. ibridazione
<ol><li>Portare la formammide a temperatura ambiente (per aliquota di 50 mL, ci vogliono ~ 30 min in bagno d'acqua). Nota: Non aprire la bottiglia di formammide fino a quando la bottiglia raggiunge la temperatura ambiente per evitare l'ossidazione della formammide. Attenzione: Formammide è tossica. Gestire e smaltire secondo le normative istituzionali.</li>
	<li>Preparare il tampone di lavaggio di formammide 10% in una provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare le provette a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere 500 µ l di etanolo al 70% di pipettaggio. Pipetta da delicatamente su e giù per risospendere le cellule rimanenti e quindi trasferire le cellule ai tubi a bassa aderenza. Nota: Utilizzando i tubi a bassa aderenza notevolmente riduce la perdita di cellule durante i lavaggi successivi.</li>
	<li>Centrifugare le provette nuovamente a ~ 376 x g per 3 min. Rimuovi tutte l'etanolo di pipettaggio.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio di 10% formammide e delicatamente dispensare su e giù 2 - 3 volte per risospendere le cellule.</li>
	<li>Permettono alle cellule di riposare a temperatura ambiente per ~ 20 min durante la preparazione della soluzione di ibridazione. Per 1 campione, mescolare 50 µ l di tampone di ibridazione (camera Temp.), 5 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c) e 1 µ l di ciascuna sonda (200 nM finale). Per 5 campioni, mescolare 250 µ l di tampone di ibridazione (camera Temp.), 25 µ l di 200mm VRC (riscaldato a 65 ˚ c) e 5 µ l di ciascuna sonda (200 nM finale).<ol>
<li>Scongelare il tampone di ibridazione (congelato a-20 ° c) a temperatura ambiente prima dell'apertura del tubo per impedire l'ossidazione di formammide.</li>
		<li>Dopo aver aggiunto il 200mm VRC, vortexare per 5-10 s prima di aggiungere le sonde, che sono progettati e acquistati commercialmente e ricostituiti secondo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Se due sonde sono co-incubate, aggiungere 1 µ l del 01:10 diluizione di stock sonda #1, come pure 1 µ l del 01:10 diluizione dello stock sonda #2, per fare una diluizione finale di ~ 1: 500 per ogni sonda. La concentrazione necessaria per il migliore rapporto di segnale-rumore deve essere ottimizzato (vedi discussione per dettagli).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante in rifiuti pericolosi pipettando.</li>
	<li>Aggiungere almeno 50 µ l di soluzione di ibridazione ad ogni provetta. Scorri i tubi per mescolare.</li>
	<li>Incubare a 30 ˚ c su un tamburo rullo per almeno 16 ore al buio.</li>
</ol>Giorno 2/3 giorno
3. lavaggio e imaging
<ol><li>Portare formammide a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare il tampone di lavaggio di 10% formammide (FWB) in una provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Togliere le provette dal tamburo rullo e metterli in una scatola rivestita di lamina al riparo dalla luce.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante in rifiuti pericolosi pipettando.</li>
	<li>Risospendere in 1 mL di 10% FWB pipettando delicatamente su e giù 2 - 3 volte.</li>
	<li>Incubare a 30 ˚ c per 30 min (non rotante) nella casella coperto di stagnola.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante per rifiuti pericolosi pipettando e lasciare ~ 50 µ l.</li>
	<li>Nel frattempo, preparare DAPI/FWB in una provetta conica da 15 mL: per 1 esempio, mescolare 1000 µ l di tampone di lavaggio di 10% formammide con 1 µ l di 5 mg/mL DAPI. Per 10 campioni, mescolare 10 mL di tampone di lavaggio 10% formammide con 10 µ l di 5 mg/mL DAPI. Risospendere in 1 mL di DAPI/FWB pipettando delicatamente su e giù 2 - 3 volte.</li>
	<li>Incubare a 30 ˚ c per 30 min (non rotante) nella casella coperto di stagnola.</li>
	<li>Scongelare i reagenti anti-candeggina sul ghiaccio.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 3 minuti rimuovere il surnatante completamente pipettando. Se necessario, centrifugare nuovamente per rimuovere tutti del surnatante.</li>
	<li>Per i campioni che non sono imaged immediatamente, risospendere il pellet in 50 µ l di tampone di GLOX senza enzimi. Dispensare su e giù 3 - 4 volte per mescolare.<ol>
<li>Mantenere tutti i campioni unimaged nella finestra coperto di stagnola a 4 ˚ c fino al momento dell'immagine. Quando si è pronti all'immagine, centrifugare i campioni a ~ 376 x g per 2 minuti e rimuovere il surnatante completamente pipettando. Risospendere in GLOX con enzimi come di seguito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per i campioni essere imaged immediatamente, aggiungere 15-20 µ l di tampone GLOX con enzimi. Pipetta da delicatamente su e giù per mescolare. Nota: Il volume aggiunto può variare a seconda della dimensione del pellet cellulare. Si consiglia di risospendere il pellet in 15 µ l di tampone GLOX con enzimi e controlla la densità delle cellule al microscopio. Se le cellule sono troppo dense (cellule che ragruppa una sopra l'altra), aggiunta tampone GLOX extra con enzimi. Se le celle sono troppo radi, centrifugare il campione e rimuovere ~ 5 µ l di tampone.</li>
	<li>Pipettare 5 µ l su un vetrino coprioggetti (18 mm x 18 mm, n ° 1) e mettere il vetrino coprioggetto in una diapositiva.</li>
	<li>Mettere un panno di laboratorio sopra la diapositiva dove sono collocato il vetrino coprioggetti. Premere delicatamente il panno di laboratorio per impostare diapositiva (dovrebbe vedere liquido venuta fuori da tutti e quattro i bordi del coprivetrino).</li>
	<li>Trasferire la diapositiva alla Camera microscopio in una scatola rivestita con foglio di alluminio.</li>
	<li>Immagine utilizzando un microscopio a fluorescenza grandangolari con alto ingrandimento (60-100x) e apertura numerica elevata. Nota: Per raccogliere il massimo numero di fotoni emessi dalle sonde smFISH, microscopi confocali non sono consigliate, come limitare significativamente la quantità di luce per essere raccolti. Qui, i dati sono stati raccolti su un microscopio equipaggiato con un 100 X, 1,4 obiettivo NA, usando filtri CY5 (EX632/22, EM679/34) ripreso a 1.3 s, 100% T; TRITC (EX542/27, EM597/45), 1.3 s, 100% T; e DAPI (EX390/18, EM435/48), 0.05-0.1 s, T. 32% - 50% Dovrebbe essere acquisita anche un'immagine di riferimento di campo chiaro. Acquisire fette di 15-25 con una dimensione di passaggio di 0.1-0.2 µm, da interamente sotto il fuoco del campo di vista interamente sopra, al fine di garantire che tutti i punti di RNA sono contabilizzati.</li>
</ol>4. image Analysis
<ol><li>Analizzare i dati di smFISH con smFISH pubblicati tra gli strumenti di analisi come pesce-quant17 e StarSearch2, o con programmi personalizzati, a seconda dei requisiti esatti dell'esperimento. Nota: Una pipeline di buona analisi dovrebbe consentire agli utenti di determinare una soglia per separare il vero spot di RNA dallo sfondo e statistiche quali le coordinate X, Y e Z (facoltative) e l'intensità di ogni spot, il numero di punti in ogni cella di output e possibilmente raccordo parametri come un modo per filtrare i falsi rilevamenti.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280 (5363), 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. 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Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.

Il protocollo presentato qui è derivato da altri protocolli pubblicati smFISH2,3,21,22,23ed è specificamente ottimizzato per lo sfondo del ceppo di lievito SK1. I parametri ottimizzati incluso il numero di cellulare, durata di fissazione, velocità di centrifugazione e durata, durata di digestione, buffer di digestione, sonda concentrazione e tampone di ibridazione. Altri parametri come la temperatura di ibridazione e durata non sono state ottimizzate. In questa sezione, condividiamo alcune note che aiuterebbero a adattare il presente protocollo a qualsiasi sfondo del ceppo di lievito e le condizioni di crescita di interesse.
La parete cellulare del lievito è una grande sfida contro ottenere immagini di alta qualità smFISH in lievito perché la parete cellulare impedisce la penetrazione della sonda. La digestione incompleta della parete delle cellule di zymolyase conduce alla inefficiente ibridazione del probe e alta variabilità della cellula--cellula nel segnale. Tuttavia, digestione eccessiva può rendere le cellule troppo fragile, portando a significativi cella perdita durante le fasi di lavaggio e delle cellule di scoppio durante la preparazione del vetrino per l'imaging. Così, ottimizzando la durata della digestione è cruciale. Si consiglia di condurre un esperimento pilota smFISH digerendo lo stesso campione per diverse quantità di tempo. Nel nostro caso, abbiamo ottenuto i migliori dati di smFISH se ci siamo fermati la digestione quando ~ 80% delle cellule è diventato non-rifrangente. In genere, per la stessa condizione di crescita, diversi ceppi mutanti genetici possono essere digeriti con tempi simili. Tuttavia, la durata della digestione differisce rispetto tra le diverse condizioni di crescita e le diverse fasi della meiosi nel lievito gemmante. Una volta determinata la tempistica, la qualità del smFISH è riproducibile. Nota che ceppi mutanti con la sintesi della parete cellulare difettoso e/o composizione, digestione potrebbe essere completata in meno di 15 minuti di uso di diversi lotti di zymolyase cambiano anche leggermente i tempi di digestione.
Concentrazione ottimale sonda è necessario per raggiungere un elevato rapporto segnale-rumore. Abbiamo progettato e acquistato le nostre sonde smFISH commercialmente. Buone sonde (spesso 20-mers) dovrebbero avere una percentuale di GC che vanno dal 35% al 45%, una distanza minima di 2 paia di basi tra sonde e bassa reattività crociata. Abbiamo usato una finestra di progettazione web-based sonda dal produttore per generare un elenco di sonde, e se c'erano abbastanza sonde da scegliere, useremmo l'algoritmo BLAST nel Database del genoma di Saccharomyces per eliminare le sonde con più di 17 coppie di basi sovrapposte con altre regioni genomiche. Abbiamo scelto il più fotostabile colorante fluorescente (CAL Fluor 590) per il set di sonda che accoppia alla regione unica di NDC80luti (CF 590) perché in questo set, il numero di sonde che ha soddisfatto tutti i criteri di cui sopra (20 Sonde) era inferiore al numero minimo consigliato dal produttore (~ 25 sonde). Dopo ricostituzione la soluzione della sonda seguendo le istruzioni del produttore, abbiamo fatto un 01:10 diluizione della soluzione di riserva e memorizzato la soluzione diluita in aliquote di 5-µ l a-20 ˚ c. Ogni aliquota è stata usata solo una volta. Per l'ottimizzazione, uno dovrebbe fare seriale diluizioni dal 01:10 diluito soluzione e prova che la concentrazione produce il miglior rapporto segnale-rumore. Si consiglia di effettuare una serie di diluizione di 1: 250, 1: 500, 1: 1000 e 1: 2000 dallo stock originale. Nel nostro caso, un fattore di diluizione di 1: 500 ha provocato il miglior rapporto segnale-rumore, per il CF 590 e la Q 670 set sonda.
Tempo di fissaggio ottimale è anche critico per il successo smFISH in lievito. Abbiamo trovato quella fissazione durante la notte a 4 ˚ c, anziché fissaggio a temperatura ambiente per 20 min, ha migliorato significativamente la coerenza e la qualità dei risultati smFISH per campioni meiotici. Anche se non è stato testato come una notte fissazione potrebbe avere un impatto campioni vegetativi, fissazione a temperatura ambiente ha funzionato bene per questa condizione di crescita. Così, per ottimizzare il protocollo smFISH per nuovi ceppi o condizioni di crescita, si consiglia a partire con il tempo breve fissazione a temperatura ambiente e aumentando il tempo di fissazione se alta variabilità del segnale viene rilevato.
Rispetto ad altri protocolli pubblicati3,22,23, il nostro protocollo utilizza l'inibitore di RNAsi VRC durante digestione e una maggiore concentrazione di VRC durante l'ibridazione. Aggiunta di VRC in questi due passaggi migliorato la consistenza dei risultati smFISH, possibilmente con una migliore conservazione molecole di RNA contro attività di nucleasi, che possono essere introdotti mediante il mix di zymolyase (l'enzima è purificata da estratti grezzi e può contenere RNasi contaminanti). Pertanto, si consiglia di utilizzare la quantità di VRC come elencati nel nostro protocollo o persino più alte concentrazioni di VRC per l'ottimizzazione.
Una parte significativa delle cellule può essere persa durante le fasi di lavaggio in tampone B e il tampone di lavaggio di formammide. Per ridurre la perdita di cellule, uno potrebbe aumentare la velocità di centrifugazione. Nel nostro caso, usando un'ad alta velocità (21.000 x g) per appallottolare i nostri campioni durante il tampone B lava perdita delle cellule significativamente ridotta. Tuttavia, le cellule diventano molto fragili dopo zymolyase digestione, quindi non è consigliabile modificare la velocità di centrifugazione. Al contrario, si consiglia di utilizzare i tubi di bassa aderenza da scientifica USA, che molto utile per agglomerare le cellule durante i lavaggi in tampone di lavaggio di formammide. Nel complesso, il nostro protocollo è in grado di generare costantemente un monostrato di cellule abbastanza dense per l'imaging efficiente. In genere, 7 campi di vista dovrebbe produrre > 130 celle adatte per la quantificazione.
Infine, è importante determinare i parametri ottimali per e le uscite necessarie da analisi dell'immagine. Per rilevare punti di smFISH, programmi di analisi pubblicata filtrare le immagini raw con kernel gaussiano per rimuovere il segnale di fondo e chiedono agli utenti di determinare il rapporto segnale-rumore da utilizzare per ogni set di immagini2,17. Purtroppo, non c'è attualmente un unico standard con cui vengono determinati i parametri appropriati, e così alcune prove empiriche di queste diverse impostazioni è necessaria. Per impostare i parametri necessari per ognuno di questi passaggi, è necessario in modo iterativo diversi set di parametri di input e controllare quanto bene i risultati ottenuti da ogni insieme che corrisponde dal conteggio manuale in alcune cellule rappresentante. Una volta che viene trovato un set di parametri, può essere utilizzato per la maggior parte delle immagini ottenute nonostante le diverse condizioni di crescita e di ambiti di provenienza genetici.
Inoltre, uno può testare se-intensità massima di proiezione delle immagini smFISH può essere eseguita prima di quantificazione22. Questo passaggio semplifica l'algoritmo di rilevamento spot e riduce notevolmente i tempi di formazione immagini, anche se a costo di alcune informazioni potenzialmente utili su singoli punti, ad esempio la loro localizzazione subcellulare. Nel nostro caso, il numero di molecole di mRNA prodotta dal gene NDC80 era abbastanza basso che le macchie erano ben separate dopo questa elaborazione (non è rara per le trascrizioni in erba lievito3,7). In casi dove la colocalizzazione analisi è critico, la pipeline di analisi ha bisogno determinare la posizione di ogni spot di smFISH in ogni canale per valutare colocalizzazione. In base alle specifiche domande viene chiesto, altre informazioni come l'intensità di ogni spot possono anche bisogno di essere estratto dalla pipeline per ulteriori analisi. Ottimizzando la chiave interviene il protocollo e la pipeline di analisi di immagine è fondamentale per ottenere alta qualità di smFISH dati per studiare la questione di interesse.

Regolazione dinamica dell'espressione genica guida lo sviluppo di un organismo, come pure la sua risposta a stress ambientali, infezione ed i cambiamenti nel metabolismo. Gli studi che si concentrano sulla regolazione trascrizionale si basano su tecnologie che misurano abbondanza di RNA. Un tale metodo, definito ibridazione di singola molecola fluorescenza in situ (smFISH), è utilizzato per il rilevamento delle singole molecole di RNA in cellule singole1,2. Questo metodo consente la misurazione della cellula--cellula variabilità nell'espressione genica e la determinazione della localizzazione intracellulare di RNA.
La tecnica più comunemente utilizzati smFISH, rilevazione di una singola molecola di RNA richiede sonde di DNA breve multiple (spesso ~ 48 20-mer sonde) che sono complementari a RNA dell'obiettivo e sono coniugati alla stessa tintura fluorescente. Associazione di una singola sonda fluorescente si traduce in segnale debole, ma il segnale dall'insieme di tutte le sonde è robusto. Questa caratteristica migliora notevolmente il rapporto segnale-rumore, perché anche se una singola sonda può esibire fuori bersaglio associazione, tale segnale dovrebbe essere molto debole rispetto a quella del bersaglio RNA molecola3. All'interno di errore di rilevazione, il numero di molecole di RNA può essere contato e confrontato tra diverse condizioni di crescita e tra diversi mutanti.
Dal suo primo sviluppo, smFISH è stato adattato per studiare vari aspetti dell' espressione genica4, come trascrizione allungamento1,2,5,6, trascrizionale scoppio7 di splicing , 8 , 9, espressione allelica intracellulare10,11,12e RNA localizzazione13,14,15. Recentemente, abbiamo usato questo metodo per studiare l'espressione delle due isoforme di trascrizione del gene stesso, in cui l'isoforma breve trascrizione (NDC80ORF) ha la sua intera sequenza ha condiviso con l'isoforma lunga (NDC80luti )16. Per identificare in modo univoco le due isoforme di mRNA, abbiamo usato due sonda set: un set è specifico per la sequenza univoca di NDC80luti, e l'altro insieme, coniugato a un altro colorante fluorescente, si lega alla regione comune delle due isoforme. NDC80luti RNA viene identificato come un posto colocalized con entrambi i segnali fluorescenti, considerando che la NDC80ORF RNA è quella che contiene solo il segnale dal set sonda comune. Poiché il numero della NDC80ORF trascrizioni è calcolato con un metodo di "sottrazione", ad alta efficienza dell'ibridazione della sonda e un alto rapporto segnale-rumore sono necessari con fiducia smFISH macchie di identificare e ridurre l'errore propagazione.
Questo articolo descrive un protocollo ottimizzato per l'esecuzione di smFISH nel lievito Saccharomyces cerevisiae. In questo protocollo, il numero di cellulare, tempo di fissazione, tempo di digestione, digestione buffer, sonda concentrazione e ibridazione buffer utilizzato per gli esperimenti di smFISH sono state ottimizzate per lo sfondo di SK1 ceppo di Saccharomyces cerevisiae in fase vegetativo crescita o meiosi. Tuttavia, notiamo anche in questo manoscritto: (1) il metodo per controllare la qualità dei dati di smFISH dopo l'acquisizione dell'immagine e (2) i passaggi nel protocollo che potrebbero richiedere ulteriore ottimizzazione per gli sfondi di ceppo diverso e le condizioni di crescita.

<table><tbody><tr><td>BSA, RNase-free (50 mg/mL)</td><td>Ambion</td><td>AM2616</td><td>Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C3515</td><td>Store at 4 &amp;deg;C for short-term. Vortex before use.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td>Store at -20 &amp;deg;C after reconstitution in water. Protect from light.</td></tr><tr><td>50% Dextran Sulfate</td><td>Milli Pore</td><td>S4030</td><td>Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma</td><td>R4251</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in water.</td></tr><tr><td>Ethanol (100%, 200 proof)</td><td>various</td><td></td><td>Flammable.</td></tr><tr><td>37% Formaldehyde</td><td>Fisher</td><td>F79-500</td><td>Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution.</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Ambion</td><td>AM9342</td><td>Store at 4 &amp;deg;C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>various</td><td></td><td>Store at 4 &amp;deg;C after dissolving in nuclease-free water.</td></tr><tr><td>Glucose oxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5.</td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Potassium phosphate (monobasic and dibasic)</td><td>various</td><td></td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Probe library, diluted in TE, pH 8.0&amp;nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots (5 &amp;micro;L) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>various</td><td></td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Ambion</td><td>AM9763</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9849</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>Store at room temperature.</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma</td><td>238813</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots.</td></tr><tr><td>200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer.</td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>MP Biomedicals</td><td>08320932</td><td>Store at -20 &amp;deg;C in aliquots after reconstitution in water.</td></tr><tr><td>Low-adhesion tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2600</td><td>Store at room temperature.</td></tr></tbody></table>

single molecule fluorescence in situ hybridization (smfish) analysis in budding yeast vegetative growth and meiosis

Ibridazione di singola molecola fluorescenza in situ (smFISH) è una tecnica potente per studiare l'espressione genica in cellule singole grazie alla sua capacità di rilevare e contare le singole molecole di RNA. Complementari ai metodi basati su sequenziamento profondi, smFISH fornisce informazioni circa la variazione della cellula--cellula in abbondanza di trascrizione e la localizzazione subcellulare di un determinato RNA. Recentemente, abbiamo usato smFISH per studiare l'espressione del gene NDC80 durante la meiosi nel lievito gemmante, in cui trascrizione due isoforme esiste e l'isoforma breve trascrizione ha sua intera sequenza ha condiviso con l'isoforma lunga. Per identificare con sicurezza ogni isoforma di trascrizione, abbiamo ottimizzato smFISH noti protocolli ed abbiamo ottenuto alta consistenza e qualità dei dati di smFISH per i campioni acquisiti durante in erba lievito meiosi. Qui, Descriviamo questo protocollo ottimizzato, i criteri che utilizziamo per determinare se si ottiene alta qualità di dati di smFISH e alcuni suggerimenti per l'implementazione di questo protocollo in altri ceppi di lievito e le condizioni di crescita.

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Questa singola molecola fluorescenza in situ di ibridazione protocollo è ottimizzato per quantificare il numero di molecole di RNA in lievito durante la meiosi e crescita vegetativa.

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

single-molecule-fluorescence-situ-hybridization-smfish-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

19.2K Views.  University of California, Berkeley. Questa singola molecola fluorescenza in situ di ibridazione protocollo è ottimizzato per quantificare il numero di molecole di RNA in lievito durante la meiosi e crescita vegetativa.

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Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.

Uso di singola molecola fluorescente ibridazione In Situ (SM-pesce) per quantificare e Localize mRNAs in ovociti murini

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), ...

Ricerca

Genetica

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk of conceiving an aneuploid fetus increases dramatically and this phenomenon is known as the maternal age effect. One requirement for accurate chromosome segregation during the meiotic divisions is maintenance of sister chromatid cohesion during the extended prophase period that oocytes experience. Cytological evidence in both humans and model organisms suggests that meiotic cohesion deteriorates during the aging process. In addition, segregation errors in human oocytes are most prevalent during meiosis I, consistent with premature loss of arm cohesion. The use of model organisms is critical for unraveling the mechanisms that underlie age-dependent loss of cohesion. Drosophila melanogaster offers several advantages for studying the regulation of meiotic cohesion in oocytes. However, until recently, only genetic tests were available to assay for loss of arm cohesion in oocytes of different genotypes or under different experimental conditions. Here, a detailed protocol is provided for using fluorescence in situ hybridization (FISH) to directly visualize defects in arm cohesion in prometaphase I and metaphase I arrested Drosophila oocytes. By generating a FISH probe that hybridizes to the distal arm of the X chromosome and collecting confocal Z stacks, a researcher can visualize the number of individual FISH signals in three dimensions and determine whether sister chromatid arms are separated. The procedure outlined makes it possible to quantify arm cohesion defects in hundreds of Drosophila oocytes. As such, this method provides an important tool for investigating the mechanisms that contribute to cohesion maintenance as well as the factors that lead to its demise during the aging process.

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

This manuscript presents a detailed method for generating X-chromosome arm probes and performing fluorescence in situ hybridization (FISH) to examine the state of sister chromatid cohesion in prometaphase and metaphase I arrested Drosophila oocytes. This protocol is suitable for determining whether meiotic arm cohesion is intact or disrupted in different genotypes.

Mediante ibridazione In Situ di fluorescenza (pesce) per monitorare lo stato di coesione braccio in prometafase e metafase I Oocytes di Drosophila

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Biologia dello sviluppo

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk population methods (Northern blot, PCR, and RNAseq) that measure mRNA levels lack the ability to provide information on cell-to-cell variation in responses. Precise single cell and allelic visualization and quantification is possible via single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). RNA-FISH is performed by hybridizing target RNAs with labeled oligonucleotide probes. These can be imaged in medium/high throughput modalities, and, through image analysis pipelines, provide quantitative data on both mature and nascent RNAs, all at the single cell level. The fixation, permeabilization, hybridization and imaging steps have been optimized in the lab over many years using the model system described herein, which results in successful and robust single cell analysis of smFISH labeling. The main goal with sample preparation and processing is to produce high quality images characterized by a high signal-to-noise ratio to reduce false positives and provide data that are more accurate. Here, we present a protocol describing the pipeline from sample preparation to data analysis in conjunction with suggestions and optimization steps to tailor to specific samples.&#160;

Single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a method to accurately quantify levels and localization of specific RNAs at the single cell level. Here, we report our validated lab protocols for wet-bench processing, imaging and image analysis for single cell quantification of specific RNAs.

Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Biochimica

Rilevamento e quantificazione di singole molecole di mRNA in Drosophila

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study muscle biology. The combination of both Drosophila genetics and advanced omics approaches led to the identification of key conserved molecules that regulate muscle morphogenesis and regeneration. However, the transcriptional dynamics of these molecules and the spatial distribution of their messenger RNA within the syncytia cannot be assessed by conventional methods. Here we optimized an existing single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) method to enable the detection and quantification of individual mRNA molecules within adult flight muscles and their muscle stem cells. As a proof of concept, we have analyzed the mRNA expression and distribution of two evolutionary conserved transcription factors, Mef2 and Zfh1/Zeb. We show that this method can efficiently detect and quantify single mRNA molecules for both transcripts in the muscle precursor cells, adult muscles, and muscle stem cells.

Autore in primo piano: Indagine sulla distribuzione spaziale dell'mRNA nel tessuto muscolare di Drosophila 

Drosophila is a well-established model for studying key molecules that regulate myogenesis. However, current methods are insufficient to determine mRNA transcriptional dynamics and spatial distribution within syncytia. To address this limitation, we optimized an RNA fluorescence in situ hybridization method allowing the detection and quantification of mRNAs at a single-molecule scale.

Studio della dinamica trascrizionale muscolare su scale di singole molecole in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Biologia

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualizzazione e l&#39;analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Ibridazione in situ a fluorescenza per studiare la spermatogenesi delle zanzare

Whole-Mount Fluorescence In Situ Hybridization to Study Spermatogenesis in the Anopheles Mosquito

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural changes to form haploid spermatozoa. Besides the biological aspect, studying spermatogenesis is of paramount importance for understanding and developing genetic technologies such as gene drive and synthetic sex ratio distorters, which, by altering Mendelian inheritance and the sperm sex ratio, respectively, could be used to control pest insect populations. These technologies have proven to be very promising in lab settings and could potentially be used to control wild populations of Anopheles mosquitoes, which are vectors of malaria. Due to the simplicity of the testis anatomy and their medical importance, Anopheles gambiae, a major malaria vector in sub-Saharan Africa, represents a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes how whole-mount fluorescence in situ hybridization (WFISH) can be used to study the dramatic changes in cell nuclear structure through spermatogenesis using fluorescent probes that specifically stain the X and Y chromosomes. FISH usually requires the disruption of the reproductive organs to expose mitotic or meiotic chromosomes and allow the staining of specific genomic regions with fluorescent probes. WFISH enables the preservation of the native cytological structure of the testis, coupled with a good level of signal detection from fluorescent probes targeting repetitive DNA sequences. This allows researchers to follow changes in the chromosomal behavior of cells undergoing meiosis along the structure of the organ, where each phase of the process can clearly be distinguished. This technique could be particularly useful for studying chromosome meiotic pairing and investigating the cytological phenotypes associated with, for example, synthetic sex ratio distorters, hybrid male sterility, and the knock-out of genes involved in spermatogenesis.

Autore in primo piano: Ibridazione in situ a fluorescenza a montaggio intero per studiare la spermatogenesi nella zanzara Anopheles  

Given their simple anatomy, Anopheles testes offer a good cytological model for studying spermatogenesis. This protocol describes whole-mount fluorescence in situ hybridization, a technique used to investigate this biological process, as well as the phenotype of transgenic strains harboring mutations in the genes involved in sperm production.

Ibridazione in situ a fluorescenza a montaggio intero per studiare la spermatogenesi nella zanzara Anopheles

Spermatogenesis is a complex biological process during which diploid cells undergo successive mitotic and meiotic division followed by large structural ...

Singola molecola l'ibridazione In Situ (smFISH) analisi in crescita vegetativa lievito germogliante e meiosi

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Uso di singola molecola fluorescente ibridazione In Situ (SM-pesce) per quantificare e Localize mRNAs in ovociti murini

Mediante ibridazione In Situ di fluorescenza (pesce) per monitorare lo stato di coesione braccio in prometafase e metafase I Oocytes di Drosophila

Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

Studio della dinamica trascrizionale muscolare su scale di singole molecole in Drosophila

Studio della dinamica trascrizionale muscolare su scale di singole molecole in Drosophila

Studio della dinamica trascrizionale muscolare su scale di singole molecole in Drosophila

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Visualizzazione e l'analisi di molecole di mRNA mediante fluorescenza

Ibridazione in situ a fluorescenza a montaggio intero per studiare la spermatogenesi nella zanzara Anopheles

Ibridazione in situ a fluorescenza a montaggio intero per studiare la spermatogenesi nella zanzara Anopheles