Agradecemos Hisayoshi Nozaki (Universidade de Tóquio), Takashi Nakada (Keio University), Yuka Marukawa Hashimoto (Universidade feminina do Japão) e Hiroyuki Sekimoto (Universidade feminina do Japão). Gostaríamos de agradecer os revisores para suas observações. Este estudo foi suportado por um subsídio para investigação científica (n. º 26440223 e 15H 04413) da sociedade para a promoção da ciência, Japão, Japão e por uma concessão da Fundação de desenvolvimento de nova tecnologia para Yuki Tsuchikane.

1. a recolha de uma amostra de água contendo algas
Nota: Conjugatophytes unicelulares crescer em áreas de água doce estagnadas, como Lagos, pântanos e arrozais. Uma amostra de água contendo algas é recolhida a partir de um desses ambientes para produzir uma tensão de cultura. Os seguintes itens são necessários antes de iniciar o processo: uma rede de plâncton, uma pipeta descartável e uma garrafa ou um tubo de 50 mL para a coleta de amostras de água.
<ol><li>Use uma rede em um ambiente de Lago de plâncton para coletar as algas da água. Use uma rede apropriada, dependendo da finalidade. Nota: A parte superior da rede é permeável à água. As algas pego pela net concentram-se no recipiente inferior da rede de plâncton. Uma malha grossa permite que pequenas algas a passagem. Uma malha fina entupir facilmente.</li>
	<li>Transferi a água (cerca de 50 mL) para o tubo de 50 mL ou uma garrafa de plástico de 100 mL. Levar a amostra de água concentrada para o laboratório.</li>
	<li>Conjugatophytes unicelulares também crescem em pântanos ou arrozais. Nestas áreas de águas rasas, a amostra de água contendo algas pode ser degustada diretamente com um conta-gotas. Em seguida, transferi a água (30-50 mL) para o tubo de 50 mL ou uma garrafa de plástico de 50 mL. Nota: A água cuidadosamente colhidas amostras acima da superfície do solo para que a amostra não contém qualquer tipo de solo.</li>
</ol>2. a confirmação das algas
Nota: Os seguintes itens são necessários: uma lupa ou microscópio portátil e um 60 mm prato para observação.
<ol><li>Para confirmar a presença de algas na amostra enquanto na pipeta descartável, use a lupa para observar a amostra diretamente. Nota: Células maiores de aproximadamente 400-1.000 µm de comprimento (por exemplo, Closterium ehrenbergii) pode ser facilmente observado usando esse método.</li>
	<li>Para confirmar as algas sob o microscópio portátil, despeje a amostra de água em um prato de plástico do laboratório.<ol>
<li>Colocar a amostra (cerca de 3 mL) na parte interna da parte superior (tampa) do prato de Petri 60 milímetros, em seguida, coloque a metade inferior, com a parte inferior virada para a parte interna da tampa, na parte superior. Nota: Esse método impede que a amostra se movendo e facilita a observação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação de uma pipeta capilar de vidro de uma pipeta Pasteur para a isolação
Nota: Antes de iniciar o processo, os seguintes itens são necessários: esterilizar pipetas Pasteur, um rack para as pipetas Pasteur, um bulbo de borracha, luvas, uma lâmpada de espírito, metanol para a lâmpada do espírito, fórceps, um isqueiro, uma lata de lixo para o vidro e uma sala limpa ou laminar capa de fluxo (se necessário).
<ol><li>Acenda uma lamparina.<ol>
<li>Para produzir uma pipeta capilar de vidro fino para o isolamento, certifique-se que a chama não está piscando. Aguçar a chama e derrete a pipeta Pasteur na sua ponta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um vidro estéril pipeta Pasteur na chama, apoiada na parte lateral do bulbo de borracha com a mão e no lado de ponta usando fórceps de calor.</li>
	<li>Levar a pipeta Pasteur fora a chama e esticá-lo.<ol>
<li>Quando o vidro está a derreter, retire a pipeta Pasteur rapidamente a chama e puxe. Nota: Neste experimento, a pipeta Pasteur foi prorrogada por 15-20 cm. fazer claro a pipeta é desligado a chama durante o puxando.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quebre a ponta da pipeta vidro capilar para o comprimento correcto. Porque a parte da curvando-se é o melhor, é ideal para a ponta. Nota: Neste estudo, foi preparada uma pipeta capilar de vidro com uma ponta de 5 a 10 cm.<ol>
<li>Certifique-se de descartar o capilar depois derrete-lo, e confirmar que a chama é posta para fora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>As bolhas libertadas a pipeta capilar de vidro indicam o tamanho da ponta da abertura. Selecione o tamanho apropriado para a célula a ser isolada. Cerca de 1 mm de bolhas é adequada para o isolamento de espécies Closterium , com larguras de célula de 10-20 µm.</li>
</ol>4. célula única isolamento por uma pipeta capilar de vidro
Nota: Os seguintes itens são necessários antes de começar: um microscópio invertido, vidros de relógio, um prato de plástico e estéril rosca tubos de ensaio contendo meio de CA (tabela 1) ou condicionado CA média7.
<ol><li>Prepare alguns vidros de relógio (22 mm de diâmetro e 1 mm de profundidade), cada contendo 1 mL de meio estéril de CA.</li>
	<li>Isole uma célula-alvo da amostra de água coletada no campo.<ol>
<li>Despeje a amostra de água (cerca de 30-40 mL) que contém as células de destino para o prato de plástico.</li>
		<li>Enquanto observa a amostra no prato plástico sob um microscópio invertido, pega células únicas usando a pipeta capilar de vidro.</li>
		<li>Trazer a pipeta capilar de vidro perto da célula para facilitar a aspiração da célula por ação capilar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferi as células em um vidro de relógio contendo 1 mL de meio de CA estéril (Figura 1a).</li>
	<li>Pegar as células novamente usando uma pipeta capilar de vidro novo do meio estéril de CA e transferi-lo para um segundo vidro de relógio contendo meio estéril de CA (Figura 1b). Nota: Este processo é repetido até que uma única célula é isolada na placa local (Figura 1C).</li>
	<li>Pegar a única célula usando uma pipeta capilar de vidro novo e finalmente, transferi-lo para um tubo de ensaio contendo 14 mL de meio de CA ou condicionados CA médio (Figura 1 d). Incubar a amostra a 23 ° C, sob uma luz: 8 16-h-h escuro ciclo por 2 semanas. Nota: O factor desconhecido para a proliferação celular, que é secretadas do crescimento de células para o meio ambiente, está incluídos no meio condicionado para facilitar a divisão celular4. Se for estabelecida uma cultura clonal, prepare o suporte de CA condicionado do meio de cultura4. A cultura vai ficar verde, se for bem sucedida.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Wickett, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylotranscriptomic+analysis+of+the+origin+and+early+diversification+of+land+plants.">Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).</li><li>Delwiche, C. F., Cooper, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+origin+of+a+terrestrial+flora.">The evolutionary origin of a terrestrial flora.</a> Current Biology. 25, R899-R910 (2015).</li><li>Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+obtaining+clonal+isolation+of+diatoms.">A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms.</a> British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).</li><li>Pringsheim, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , 119 (1946).</li><li>Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N., Andersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+isolation+techniques+for+microalgae.">Automated isolation techniques for microalgae.</a> Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. , 101-116 (2005).</li><li>Andersen, R. A., Kawachi, M., Andersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+microalgae+isolation+techniques.">Traditional microalgae isolation techniques.</a> Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. , 83-100 (2005).</li><li>Abe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+nuclear+transformation+of+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex.">Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).</li><li>Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+processes+of+Penium+margaritaceum+(Zygnemophyceae,+Charophyta).">Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta).</a> Phycological Research. 59, 74-82 (2011).</li><li>Kanda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+knockouts+reveal+that+CpRLP1+is+a+negative+regulator+of+the+sex+pheromone+PR-IP+in+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex.">CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Scientific Reports. 7, 17873 (2017).</li><li>Ichimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mating+types+and+reproductive+isolation+in+Closterium-ehrenbergii+Meneghini.">Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini.</a> Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).</li><li>Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+physiological+properties+of+a+protein+inducing+protoplast+release+during+conjugation+in+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex.">Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Planta. 182, 348-354 (1990).</li><li>Ichimura, T., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Closterium+calosporum+complex+from+the+Ryukyu+Islands-Variation+and+taxonomical+problems.">The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems.</a> Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).</li><li>Provasoli, L., Pintner, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+media+for+fresh-water+algae:+problems+and+suggestions+.">Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions .</a> The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , 84-96 (1960).</li><li>Provasoli, L., Tryon, C. A., Hartmann, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Media++&amp;+prospects+for+the+cultivation+of+marine+algae.">Media &amp; prospects for the cultivation of marine algae.</a> Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. , 63-75 (1968).</li><li>Guillard, R. R. L., Andersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+methods+for+microalgae.">Purification methods for microalgae.</a> Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. , 117-132 (2005).</li></ol>

Usando o método presente, cepas de 9 cultura clonal de SP. Closterium foram estabelecidas de 15 células isoladas da amostra de água (Inba1), que representa uma taxa de sucesso de 60%. Identificação de espécies realizarão no futuro por observação morfológica, bem como análises de ADN, tais como análise filogenética molecular8.
No presente método, o frescor da amostra de água é importante para a taxa de sucesso. É melhor isolar as células a partir das amostras de água logo que possível após a coleta de campo. Embora as células da espécie Closterium (por exemplo, c. ehrenbergii, c. peracerosum-strigosum-littorale complexo) podem ser mantidas na amostra de água para cerca de 7 d armazenando-a 4-8 ° C, o isolamento das células é desejável no dia da coleção ou no dia seguinte. Também é importante remover todos os contaminadores que não sejam as células alvo, aumentando assim o número de repetições de lavagem (i.e., > 3 x) podem impedir a contaminação das culturas por microorganismos no solo e células.
Uma limitação dessa técnica é que os meios de cultura utilizados neste protocolo (CA ou condicionados CA médio) nem sempre são adequados para todas as algas de conjugação. Em alguns casos, pode ser necessário considerar o uso de outro meio, bem como a luz diferente e a condições de temperatura. Além disso, como é difícil provar se uma cultura cresceu de uma única célula, é necessário buscar com precisão apenas 1 célula ao transferir células para um tubo de ensaio. Portanto, a transferência deve ser feito com uma nova pipeta capilar de vidro cada vez.
Estabelecer uma cultura clonal com este método de lavagem de pipeta é um método clássico/padrão e é o método mais confiável para usar para isolar as células desejadas para um estudo. Estabeleceram-se as culturas clonais de conjugação algas usadas em muitos estudos8,9,10,11 usando o método actual. É difícil analisar a conjugação algas sem uma cultura clonal. Além disso, nos últimos anos, sequências do genoma inteiro de novo tornou-se fácil de obter (por exemplo, usando o MinION nanopore sequencer), e estabelecer culturas clonais facilitará ainda mais o sequenciamento de novo . Em outras palavras, esse método é o primeiro passo no futuro estudar destas algas para compreender melhor a sua biodiversidade.
A fim de estabelecer uma tensão estável de cultura, é necessário realizar determinadas etapas críticas com precisão dentro do protocolo. O passo mais importante é a preparação de uma pipeta capilar de vidro com uma abertura ideal para permitir a passagem de apenas uma única célula. A abertura da pipeta capilar de vidro deve ser ligeiramente mais do que o comprimento do eixo menor da célula de interesse. A pipeta capilar de vidro ideal pode aspirar a uma única célula por ação capilar. No entanto, se o diâmetro da abertura é muito grande, o capilar também desenhará em materiais de contaminantes não-vivos ou mesmo (um) outro microrganismo, além da célula-alvo.
Para obter uma pipeta capilar de vidro com um ideal de abertura, os seguintes pontos são importantes para observação. Primeiro, o pilar de fogo deve ser estreito ao aquecer a pipeta capilar de vidro. Em seguida, quando puxar a pipeta Pasteur, tem que ser removido da chama; caso contrário, a abertura da pipeta Pasteur entrará em colapso.
Os equipamentos e recipientes mostrados neste protocolo são básicos e podem ser modificados. Por exemplo, usando placas multi bem em vez de vidros de relógio com um poço, a lavagem da célula pode ser feita mais eficiente. Além disso, os recipientes podem ser substituídos por outros semelhantes. Através da transferência de uma única célula para o meio de cultura para a última etapa, uma cultura clonal pode ser estabelecida.
Preparar um recipiente esterilizado e trabalhando em um capuz estabelecerá axénica cepas (não contaminadas). Para evitar a contaminação, é necessário repetir a etapa de lavagem com alíquotas frescas mais de 3x. Às vezes, as bactérias também são esterilizadas pela adição de antibióticos15.
Esse método focado em gênero (Zygnematales) isolamento, mas alterando o tamanho da abertura da pipeta capilar de vidro, pode ser aplicado para o isolamento de diferente tamanho plâncton.

Conjugação de algas (da ordem Zygnematales), também conhecido como conjugatophytes, ocupam uma posição-chave filogenética como os parentes vivos mais próximos dos antepassados imediatos da terra plantas1,2. Estabelecidas culturas clonais de algas têm levado a uma grande variedade de estudos taxonômicos, fisiológicos e genéticos ao longo dos últimos anos. As técnicas de isolamento de microorganismos de um campo natural têm uma longa tradição de3,4. Nos últimos anos, isolamento automatizado técnicas usando citometria de fluxo foram também estabelecidos5. O método mais comum usado para obter uma única célula para o estabelecimento de uma cultura clonal é isolamento de célula única usando uma pipeta capilar de vidro6. Esse método tradicional requer habilidade e um protocolo experimental preciso.
Neste artigo, demonstramos a amostragem de algas de amostras de campo e o estabelecimento de culturas clonais de algas unicelulares de conjugação, tais como a espécie Closterium , usando uma pipeta capilar de vidro. Uma amostra de água contendo as células vegetativas é coletada de um site de campo (por exemplo, um lago, lagoa ou arrozal). As células são isoladas da amostra de água usando uma pipeta capilar de vidro e em seguida lavadas. As células são cultivadas em um tubo de ensaio contendo meio de nitrogênio-completada (médio CA) a 24 ° C, sob uma luz: 8 16-h-h regime de escuro. Esse método também é apropriado para isolar outras microalgas para gerar culturas clonais.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Sampling&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plankton net</td><td>RIGO, Japan</td><td>N-NO380T</td><td>Mesh size: 32 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Portable microscope (e.g., Nature Scope FABRE)</td><td>Nikon, Japan</td><td>JAN: 4960759 206725</td><td>Magnification: 20&amp;times;</td></tr><tr><td>Loupe (e.g., Peak 1985 Steinheil System Magnifier)</td><td>Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japan</td><td>1985-20</td><td>Magnification: 20&amp;times;</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japan</td><td>Sterile spuit No.4</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube (50 mL centrifuge tubes with screw caps)</td><td>Labcon, USA</td><td>3181-345-008</td><td></td></tr><tr><td>Bottle (100 mL Polycarbonate bottle)</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>1-7403-01</td><td></td></tr><tr><td>60 mm dish</td><td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td><td>1010-060</td><td>&amp;nbsp;For observation of algae.&amp;nbsp; 60 mm/non-treated dish</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Preparation of a micropipette&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes (cotton plugged 9&amp;rdquo; Pasteur Pipettes)</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>13-678-8B</td><td>7 &amp;times; 225 mm</td></tr><tr><td>Rubber bulb (SPOID SILICONE, 1 cc)</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>5-5669-01</td><td>10 &amp;times; 40 mm</td></tr><tr><td>Stainless forceps</td><td>AS ONE Corporation, Japan</td><td>PT-09</td><td>110 mm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Single-cell isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Watch glass (Blood reaction board)</td><td>Sekiya Rika Co., Ltd, Japan</td><td>F14-155-030</td><td>to rinse cells during isolation. 22 mm diameter and 1 mm depth</td></tr><tr><td>Threaded test tubes&amp;nbsp;</td><td>Fujimotorika, Co., Ltd, Japan</td><td>XX142</td><td>18 &amp;Oslash; &amp;times; 170 mm</td></tr><tr><td>Inverted light microscope</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>CKX41N</td><td>for isolation of algae.</td></tr><tr><td>Plastic dish</td><td>Asahi glass Co. Ltd., Japan</td><td>SH90-15E&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;90 &amp;times; 15 mm</td></tr></tbody></table>

establishment of a clonal culture of unicellular conjugating algae

É essencial para estabelecer culturas clonais de microalgas para uso em estudos de vários temas, tais como fisiologia, genética, taxonomia e Microbiologia. Assim, é extremamente importante desenvolver técnicas para estabelecer culturas clonais. Neste artigo, vamos demonstrar o estabelecimento de culturas clonais de uma alga de conjugação. São coletadas amostras de água do campo. Posteriormente, as células são isoladas, usando uma pipeta capilar de vidro, colocado na mídia e cresceu em condições adequadas para a geração de uma cultura clonal.

Uma amostra de água (Inba1) de 50 mL foi coletada de um ponto de amostragem no lago Inba-numa (pH 8.1, 24,7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E) no Sakura-shi, Chiba, Japão, em 25 de junho de 2016. A amostra de água era armazenada em 4-8 ° C. No dia seguinte após a coleta, uma amostra de Closterium SP. foi isolado a partir da amostra de água contendo as células vegetativas. As células vegetativas quinze de morfologia idêntica (Inba1-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12,-13, -14 e -15) foram isoladas a partir da amostra e em seguida, lavou usando a pipeta método de lavagem. Quinze células únicas isoladas foram cultivadas em tubos de ensaio independentes, contendo 15 mL de meio de CA condicionado. Depois de 2 semanas de incubação, observou-se proliferação celular em 9 tubos de ensaio [Inba1-1, -3, -4, -5 (Figura 2a), -6, -9, -10, -12 (Figura 2b) e-13; Tabela 2]. Estabeleceram-se nove culturas clonais dos Inba1 isolados de amostra (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig1.jpg"> Figura 1 : O fluxo de isolamento de célula única. (a) transferência a célula algal único alvo a amostra de água original para o estéril médio no primeiro vidro de relógio. (b, c) Transferi o celular novamente para o vidro de relógio próximo para lavar. Este procedimento deve ser repetido até que não haja nenhuma outras células/contaminantes do que o alvo a médio; três vidros de relógio são mostrados no diagrama aqui como exemplo. (d) finalmente, transferir a célula lavada para um tubo de ensaio do meio adequado para o crescimento. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57761/57761fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2.jpg"> Figura 2 : Fotografias de células vegetativas de Closterium SP. (um) Inba1-5) e (b) Inba1-12 são mostrados aqui. Barra de escala = 50 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig3.jpg"> Figura 3 : Estabelecimento de uma cultura clonal da amostra Inba1. Os tubos de ensaio, cultivados por 2 semanas foram fotografados do fundo. Um asterisco indica a proliferação celular. Barra de escala = 2 cm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57761/57761fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Nome da mídia</td>
			<td>Referência</td>
			<td colspan="2">Comentários</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">CA</td>
			<td rowspan="13">Ichimura e Watanabe12
</td>
			<td>O CA (não3)2·4H2</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>KNO3
</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4não3
</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β – at2glycerophosphate·5H2O</td>
			<td>3 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>O MgSO4·7H2</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vitamina B12</td>
			<td>0,01 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biotina</td>
			<td>0,01 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tiamina HCl</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metais PIV</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe (como EDTA; molar de 1:1)</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Adicione água para completar 100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ajustar o pH com NaOH a 7.2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">Metais P IV</td>
			<td rowspan="7">Provasoli e Pintner13
</td>
			<td>At2EDTA·2H2, O</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>O FeCl3·6H2</td>
			<td>19,6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2· 4H2O</td>
			<td>3,6 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2*</td>
			<td>1,04 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>O CoCl2·6H2</td>
			<td>0,4 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>At2MoO4·2H2, O</td>
			<td>0,25 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Adicione água para completar 100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fe (como EDTA; molar de 1:1)</td>
			<td rowspan="3">Provasoli14
</td>
			<td>Fe (NH4)2(então4)2·6H2O,</td>
			<td>70,2 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA·2H2O,</td>
			<td>66 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Adicione água para completar 100 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Médio de CA condicionado</td>
			<td>Abe et al.7
</td>
			<td colspan="2">Incube as células em meio fresco CA 14 – 20 dias. Coletar o médio cultivado por filtração utilizando papel de filtro qualitativo e esterilizar o meio filtrado em autoclave (121 ° C por 15 min).</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">* O NIES, 1,04 mg ZnCl2 redacção 2,2 mg ZnSO4·7H2O.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Formulações de meios de comunicação utilizados neste estudo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Amostra de água</td>
			<td>Nome da célula</td>
			<td>Estatuto após a cultura</td>
			<td>Nome de estirpe</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="15">Inba1</td>
			<td>-1</td>
			<td>As células se proliferaram</td>
			<td>Inba1-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>-2</td>
			<td>Não mudou</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-3</td>
			<td>As células se proliferaram</td>
			<td>inba1-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>-4</td>
			<td>As células se proliferaram</td>
			<td>inba1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>-5</td>
			<td>As células se proliferaram</td>
			<td>inba1-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>-6</td>
			<td>As células se proliferaram</td>
			<td>inba1-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>-7</td>
			<td>Não mudou</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-8</td>
			<td>Não mudou</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-9</td>
			<td>As células se proliferaram</td>
			<td>inba1-9</td>
		</tr>
<tr>
<td>-10</td>
			<td>As células se proliferaram</td>
			<td>inba1-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>-11</td>
			<td>Não mudou</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-12</td>
			<td>As células se proliferaram</td>
			<td>inba1-12</td>
		</tr>
<tr>
<td>-13</td>
			<td>As células se proliferaram</td>
			<td>inba1-13</td>
		</tr>
<tr>
<td>-14</td>
			<td>Não mudou</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-15</td>
			<td>Não mudou</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: O isolamento julgamento sumário.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae at JoVE.com

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

Estabelecimento de uma cultura Clonal de algas unicelulares de conjugação

Neste artigo, vamos demonstrar o estabelecimento de culturas clonais de espécies de algas conjugação unicelulares coletadas de um site de campo natural.

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

establishment-of-a-clonal-culture-of-unicellular-conjugating-algae

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K visualizações.  Japan Women's University. Neste artigo, vamos demonstrar o estabelecimento de culturas clonais de espécies de algas conjugação unicelulares coletadas de um site de campo natural.

Vídeo: Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

A craca Balanus improvisus como modelo Marine - cultivo e expressão gênica

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Ambiente

Cultivation of Green Microalgae in Bubble Column Photobioreactors and an Assay for Neutral Lipids

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the treatment of wastes. As most new research efforts begin at laboratory scale, there is a need for cost-effective methods for culturing microalgae in a reproducible manner. Here, we communicate an effective approach to culture microalgae in laboratory-scale photobioreactors, and to measure the growth and neutral lipid content of that algae. Instructions are also included on how to set up the photobioreactor system. Although the example organisms are species of Chlorella and Auxenochlorella, this system can be adapted to cultivate a wide range of microalgae, including co-cultures of algae with non-algae species. Stock cultures are first grown in bottles to produce inoculum for the photobioreactor system. Algae inoculum is concentrated and transferred to photobioreactors for cultivation in batch mode. Samples are collected daily for the optical density readings. At the end of the batch culture, cells are harvested by centrifuge, washed, and freeze dried to obtain a final dry weight concentration. The final dry weight concentration is used to create a correlation between the optical density and the dry weight concentration. A modified Folch method is subsequently used to extract total lipids from the freeze-dried biomass and the extract is assayed for its neutral lipid content using a microplate assay. This assay has been published previously but protocol steps were included here to highlight critical steps in the procedure where errors frequently occur. The bioreactor system described here fills a niche between simple flask cultivation and fully-controlled commercial bioreactors. Even with only 3-4 biological replicates per treatment, our approach to culturing algae leads to tight standard deviations in the growth and lipid assays.

Here, we present a protocol to construct lab-scale bubble column photobioreactors and use them to culture microalgae. It also provides a method for the determination of the culture growth rate and neutral lipid content.

Cultivo de microalgas verdes em fotobiorreatores coluna de bolha e um ensaio para lípidos neutros

There is significant interest in the study of microalgae for engineering applications such as the production of biofuels, high value products, and for the ...

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri (Uljanin 1884) for Experimental Studies

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, and trophic interactions primarily due to methodological challenges, including the ability to culture them. This is particularly true for the doliolid, Dolioletta gegenbauri. D. gegenbauri commonly occurs in productive subtropical continental shelf systems worldwide, often at bloom concentrations capable of consuming a large fraction of daily primary production. In this study, we describe cultivation approaches for collecting, rearing, and maintaining D. gegenbauri for the purpose of conducting laboratory-based studies. D. gegenbauri and other doliolid species can be captured live using obliquely towed conical 202 &micro;m mesh plankton nets from a drifting ship. Cultures are most reliably established when water temperatures are below 21 &deg;C and are started from immature gonozooids, maturing phorozooids, and large nurses. Cultures can be maintained in rounded culture vessels on a slowly rotating plankton wheel and sustained on a diet of cultured algae in natural seawater for many generations. In addition to the ability to establish laboratory cultures of D. gegenbauri, we demonstrate that the collection condition, algae concentration, temperature, and exposure to naturally conditioned seawater are all critical to the culture establishment, growth, survival, and reproduction of D. gegenbauri.

Cultivation of the Marine Pelagic Tunicate Dolioletta gegenbauri Uljanin 1884 for Experimental Studies

Doliolids, including the species Dolioletta gegenbauri, are small gelatinous marine zooplankton of ecological significance found on productive subcontinental shelf systems worldwide. The difficulty of culturing these delicate organisms limits their investigation. In this study, we describe cultivation approaches for collecting, rearing, and maintaining the doliolid Dolioletta gegenbauri.

Cultivo do Tunicato marinho pelágico Dolioletta gegenbauri (uljanin 1884) para estudos experimentais

Gelatinous zooplanktons play a crucial role in ocean ecosystems. However, it is generally difficult to investigate their physiology, growth, fecundity, ...

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact genome. For these reasons, it is considered a useful model organism for marine ecological studies, evolutionary developmental biology, and genomics. As research often requires a steady supply of animal resources, it is useful to establish a reliable, low-maintenance culture system. Here we describe a step-by-step method for establishing an O. dioica culture. We describe how to select potential sampling sites, collection methods, target animal identification, and the set-up of the culturing system. We provide troubleshooting advice based on our own experiences. We also highlight critical factors that help sustain a robust culture system. Although the culture protocol provided here is optimized for O. dioica, we hope our sampling technique and culture setup will inspire new ideas for maintaining other fragile pelagic invertebrates.

Streamlined Sampling and Cultivation of the Pelagic Cosmopolitan Larvacean, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a tunicate model organism in various fields of biology. We describe sampling methods, species identification, culturing setup, and culturing protocols for the animals and algal feed. We highlight key factors that helped strengthen the culture system and discuss the possible problems and resolutions.

Amostragem e Cultivo Simplificado da Larvacean Cosmopolita Pelagic, Oikopleura dioica

Oikopleura dioica is a planktonic chordate with exceptional filter-feeding ability, rapid generation time, conserved early development, and a compact ...

Coupling Carbon Capture from a Power Plant with Semi-automated Open Raceway Ponds for Microalgae Cultivation

In the United States, 35% of the total carbon dioxide (CO2) emissions come from the electrical power industry, of which 30% represent natural gas electricity generation. Microalgae can biofix CO2 10 to 15 times faster than plants and convert algal biomass to products of interest, such as biofuels. Thus, this study presents a protocol that demonstrates the potential synergies of microalgae cultivation with a natural gas power plant situated in the southwestern United States in a hot semi-arid climate. State-of-the-art technologies are used to enhance carbon capture and utilization via the green algal species Chlorella sorokiniana, which can be further processed into biofuel. We describe a protocol involving a semi-automated open raceway pond and discuss the results of its performance when it was tested at the Tucson Electric Power plant, in Tucson, Arizona. Flue gas was used as the main carbon source to control pH, and Chlorella sorokiniana was cultivated. An optimized medium was used to grow the algae. The amount of CO2 added to the system as a function of time was closely monitored. Additionally, other physicochemical factors affecting algal growth rate, biomass productivity, and carbon fixation were monitored, including optical density, dissolved oxygen (DO), electroconductivity (EC), and air and pond temperatures. The results indicate that a microalgae yield of up to 0.385 g/L ash-free dry weight is attainable, with a lipid content of 24%. Leveraging synergistic opportunities between CO2 emitters and algal farmers can provide the resources required to increase carbon capture while supporting the sustainable production of algal biofuels and bioproducts.

A protocol is described to utilize the carbon dioxide in natural gas power plant flue gas to cultivate microalgae in open raceway ponds. Flue gas injection is controlled with a pH sensor, and microalgae growth is monitored with real time measurements of optical density.

Acoplamento da captura de carbono de uma usina com lagoas abertas semi-automatizadas para cultivo de microalgas

In the United States, 35% of the total carbon dioxide (CO2) emissions come from the electrical power industry, of which 30% represent natural gas ...

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

Acasalamento e separação da Tétrade Chlamydomonas reinhardtii Para análise genética

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Biologia

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable photosynthetic models facilitating the understanding of the basic cellular processes. System wide studies enable comprehensive and in-depth understanding of molecular functions of the organisms. However, multiple independent samples and protocols are required for proteomics, lipidomics and metabolomics studies introducing higher error and variability. A robust high throughput extraction method for the simultaneous extraction of chlorophyll, lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample of the green alga Chlamydomonas reinhardtii is presented here. The illustrated experimental setup is for Chlamydomonas cultures synchronized using 12 h/12 h light/dark conditions. Samples were collected over a 24 h cell cycle to demonstrate that the metabolites, lipids and starch data obtained using various analytical platforms are well conformed. Furthermore, protein samples collected using the same extraction protocol were used to conduct detailed proteomics analysis to evaluate their quality and reproducibility. Based on the data, it can be inferred that the illustrated method provides a robust and reproducible approach to advance understanding of various biochemical pathways and their functions with greater confidence for both basic and applied research.

A Multi-Omics Extraction Method for the In-Depth Analysis of Synchronized Cultures of the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii

System-wide analysis of multiple biomolecules is crucial to gain functional and mechanistic insights into biological processes. Hereby, an extensive protocol is described for high throughput extraction of lipids, metabolites, proteins and starch from a single sample harvested from synchronized Chlamydomonas culture.

Um método de extração multi-Omics para a análise aprofundada de culturas sincronizadas da alga verde Chlamydomonas reinhardtii

Microalgae have been the focus of research for their applications in the production of high value compounds, food and fuel. Moreover, they are valuable ...

Biologia do Desenvolvimento

<meta charset="utf8"></head><body>Aumentando a produção de clorofila em microalgas por meio da otimização do fator de crescimento

Evaluation of the Effect of Growth Factors on Chlorophylls a and b Production from Microalgae

Microalgae contain two main groups of pigments: chlorophylls and carotenoids. Chlorophyll is a green pigment that absorbs light energy and transforms it into chemical energy to facilitate the synthesis of organic compounds. This pigment serves as a valuable primary source for biotechnological input products in the food, pharmaceutical, and cosmetic industries due to its high antioxidant properties and coloring capabilities. The objective of this research was to evaluate the effect of growth factors (CO2 concentration, light color, and light intensity) through a Taguchi L4 experimental design on cell growth and the cellular content of chlorophyll a and b in Chlorella sorokiniana, followed by validation of the method using Haematococcus pluvialis microalgae as an additional study model. Cell growth was quantified using the optical density spectrophotometric technique at a wavelength of 550 nm. For the quantification of chlorophylls, a cell extract was obtained using a 90% pure acetone solution, and subsequently, the concentrations of chlorophylls a and b were quantified using spectrophotometric techniques at wavelengths of 647 nm and 664 nm, according to the method described by Jeffrey and Humphrey. The experimental results indicated that controlling conditions of low CO2 addition, purple light, and low light intensity increases both cell growth and the concentration of chlorophylls a and b within the cells. The implementation of this chlorophyll quantification method allows for quick, simple, and precise determination of chlorophyll content, as the wavelengths used are at the absorbance peaks of both types of chlorophylls, making this technique easily reproducible for any microalgae under study.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Otimizando fatores de crescimento para a produção de metabólitos secundários biotecnologicamente relevantes

The present study highlights the advantages of employing the method developed by Jeffrey and Humphrey for extracting and quantifying fat-soluble pigments from microalgae. This method serves as a valuable tool for assessing the influence of growth factors on chlorophyll production and cellular content in these organisms.

Avaliação do Efeito dos Fatores de Crescimento na Produção de Clorofilas a e b a partir de Microalgas

Microalgae contain two main groups of pigments: chlorophylls and carotenoids. Chlorophyll is a green pigment that absorbs light energy and transforms it ...

Estabelecimento de uma cultura Clonal de algas unicelulares de conjugação

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

A craca Balanus improvisus como modelo Marine - cultivo e expressão gênica

Cultivo de microalgas verdes em fotobiorreatores coluna de bolha e um ensaio para lípidos neutros

Cultivo do Tunicato marinho pelágico Dolioletta gegenbauri (uljanin 1884) para estudos experimentais

Amostragem e Cultivo Simplificado da Larvacean Cosmopolita Pelagic, Oikopleura dioica

Acoplamento da captura de carbono de uma usina com lagoas abertas semi-automatizadas para cultivo de microalgas

Acasalamento e separação da Tétrade Chlamydomonas reinhardtii Para análise genética

Um método de extração multi-Omics para a análise aprofundada de culturas sincronizadas da alga verde Chlamydomonas reinhardtii

Avaliação do Efeito dos Fatores de Crescimento na Produção de Clorofilas a e b a partir de Microalgas

Avaliação do Efeito dos Fatores de Crescimento na Produção de Clorofilas a e b a partir de Microalgas

Avaliação do Efeito dos Fatores de Crescimento na Produção de Clorofilas a e b a partir de Microalgas