Name: using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions
Uploaded: 2018-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions at JoVE.com

Este trabalho é financiado pela Fundação de pesquisa alemã (INST 39/969-1) e o Conselho Europeu de investigação através da Convenção de subvenção ERC n. 681891.

1. instalação e pré-requisitos
<ol><li>Realizar as medições de cor multi smFRET em um TIRFM de prisma-tipo. Uma descrição de uma configuração de duas cores como uma publicação de JoVE é dado referência a12.<ol>
<li>Construa um TIRFM de várias cor. Um layout geral é detalhado em 9.</li>
		<li>Uso comutável, diodo bombeou onda contínua lasers de estado sólido, que tornam a utilização de obturadores mecânicos nos caminhos de excitação desnecessárias.</li>
		<li>Emprega um prisma assimétrico, alongado que impede a reflexão traseira do feixe da excitação da parte traseira para entrar o objetivo.</li>
		<li>Use lentes de silicone acromática de esféricos fundido de 2 polegadas nos caminhos de deteção que coletar tanta luz quanto possível e evitar autofluorescência e aberrações, por exemplo, as distorções nas regiões fora do centro da imagem.</li>
		<li>Focar cada caminho de deteção do chip do EMCCD com uma lente separada. Isso permite que o foco ideal de cada canal de deteção. Atenção: Lasers de classe 3B são usados na TIRFM. Isto significa que eles são perigosos, se o olho é exposto diretamente, mas reflexões difusas não são prejudiciais. Garantir a conformidade com laser precauções de segurança, de acordo com as regulamentações governamentais locais antes que o sistema é operado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine os factores de correcção para propriedades de configuração e fluoróforo previamente usando amostras de dsDNA.<ol>
<li>Usar um alto-FRET dsDNA amostra para cada corante em combinação com o aceitador tendo o mais longo comprimento de onda de excitação (para a configuração apresentada: Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto594-Atto647N). Certifique-se de que o DNA é modificado adicionalmente com uma biotina.</li>
		<li>Diluir a amostra a 5 nM com tampão TNM (5 mM Tris pH 7,5, 5 mM de NaCl, 20 mM MgCl2) e 2 mM Trolox (use também esse buffer para medição).</li>
		<li>Imobilize o dsDNA conforme descrito para Hsp90 em etapas 2.5 e 2.7.</li>
		<li>Calcule os fatores de correção para vazamento aparente (LC) e aparente gama (ag) de traços de único-molécula que mostram um evento de branqueamento do aceitador.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construa uma câmara de fluxo que é um sanduíche de uma lâmina de quartzo passivadas PEG/biotina-PEG, uma película fina que é adesivo em ambos os lados e uma lamínula. Para protocolos de detalhe para a limpeza do quartzo slides e passivação consulte referência9.<ol>
<li>Uso de espessura (3mm) quartzo slides para evitar geometricamente a coleção do laser espalhados na interface entre o prisma e o slide funcionalizados quartzo quartzo-glicerol-quartzo.</li>
		<li>Use uma fina (40 µm) filme que é pulverizado com adesivo no lado não-adesivo de vedação. A película fina reduz a distância entre as moléculas de superfície-anexado e objectivo. Aquecer a 80 ° C e pressione.</li>
		<li>Coloca uma lamínula por cima. Aquecer a 80 ° C e pressione. Use uma gota de glicerol, ao colocar a câmara de fluxo sobre o prisma. Nota: Os materiais de prisma e os slides de quartzo, bem como o glicerol são índice de correspondência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Express Hsp90 de Saccharomyces cerevisiae na forma de dois mutantes de ponto único de cisteína nas posições D61 ou Q385. Adicione um motivo de bobina coiled do C-terminal para evitar a dissociação do dímero em concentrações picomolar. Rotular as proteínas mutantes separadamente e trocar os monómeros para obter heterodímeros rotulados com Atto488 na posição do ácido aminado 61 e Atto550 no ácido aminado posição 3859.</li>
</ol>2. medição
<ol><li>Inicie o software da câmera e definir os parâmetros de imagem conforme especificado abaixo:<ol>
<li>Regule a temperatura para o sensor de resfriamento mais baixo possível (-95 ° C com refrigeração a água externa) para diminuir o ruído de corrente escuro.</li>
		<li>Usar as configurações da câmera que são otimizadas para a gravação do único-molécula: velocidade de deslocamento vertical 3.3 µs, tensão de pulso de disparo vertical normal, 17 horizontal MHz 16 bits lidos, pré-amplificação ganho 3, ganho de elétron multiplicador 1.000.</li>
		<li>Defina o acionamento do alarme a aquisição "Externo" e o tempo de exposição para 70 filmes de registro MS., com um comprimento de 750 ciclos de aquisição. Nota: Desliga a luz do quarto quando a câmera está adquirindo para evitar a saturação do sensor EMCCD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crie uma pasta no local SSD para a medição. No software configurações vão para o piloto < Auto-Save > habilitar < Auto-save > em escolher o formato de arquivo "Tiff" para aquisição de filme. Selecione a pasta sobre o SSD como local de salvamento automático.</li>
	<li>Inicie o software que controles o acústico-Óptico Sintonizável filtro (AOTF), o software que controla a operação dos lasers e o software de gatilho que sincroniza os lasers, AOTF, persianas no caminho de deteção e câmeras. Ajustar a potência do laser com o AOTF (ca. 3 mW antes de entrar o prisma) e carregar o padrão correto de disparo.</li>
	<li>Montar o porta-amostras com o prisma e a câmara de fluxo, conecte a tubulação, coloque o tubo de entrada em um copo de microcentrifuga e conecte o tubo de saída de uma bomba de seringa. Lave a câmara com cerca de 150 buffer µ l, alinhe a excitação feixe e foco. Bleach todos os contaminadores na superfície fluorescentes por movendo-se lentamente ao longo do intervalo de detecção completa do slide com um poder do laser de cerca de 10 mW para todos os lasers. Isso leva cerca de 1h. Nota: se não for indicado o contrário, o buffer usado contém 40 mM HEPES pH 7,5, KCl, de 150 mM e 10 mM MgCl2.</li>
	<li>Descarga de aproximadamente 300 µ l de uma solução de NeutrAvidin (0,25 mg/mL em buffer) para a câmara e incubar durante 1 min. Flush fora NeutrAvidin desacoplado com tampão e flush aproximadamente 300 ml de uma solução de BSA (0,5 mg/mL em buffer) através da câmara. Nota: Este bloco restante superfície functionalization defeitos por adsorção inespecíficas da BSA para a superfície.</li>
	<li>Imobilizar a amostra por carregar a câmara de fluxo com aproximadamente 150 µ l do biotinilado e rotulado Hsp90 em concentrações crescentes (diluídas em tampão + 0,5 mg/mL BSA) até uma densidade de superfície suficiente é atingida, que é geralmente o caso numa concentração de 5-22:00. Lave desvinculado da proteína com buffer de aproximadamente 300 µ l + 0,5 mg/mL BSA.</li>
	<li>Descarga em 150 µ l de 25 nM AMP-PNP * no tampão + 0,5 mg/mL BSA. Deixe incubar durante 5 min e repita este passo uma vez para garantir a concentração correta do nucleotide. Nota: Para experiências na presença de AMP-PNP adicionais, sem rótulo, também adicionar 250 µM AMP-PNP.</li>
	<li>Começam com a aquisição de dados. Para uma quantidade adequada de dados adquira cerca de 20 filmes, o que leva cerca de 1,5 h.<ol>
<li>Mova a posição da câmara de amostra perpendicular ao feixe de excitação com um seletor de piezo para alterar o campo de visão.</li>
		<li>Ajuste o foco com o z-piezo que controla a altura do objectivo, se necessário. Isso não deve ser necessário muitas vezes, quando a câmara de medição é montada sem inclinação.</li>
		<li>Preparar a gravação das câmeras pressionando < leve sinal > no software da câmera e iniciar os ciclos de excitação/aquisição usando o botão < Iniciar > no software do gatilho. Isso inicia a aquisição da intensidade da fluorescência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute um registo de canal pela primeira gravação de um filme com grânulos fluorescentes que mostram a emissão de fluorescência na faixa espectral de todos os canais de deteção da instalação. Em seguida, detectar as posições do grânulo do filme de calibração por procurar os pontos mais brilhantes e determinar que a posição central de uma gaussiana se encaixam no perfil de intensidade. Salve as coordenadas dos grânulos que são encontrados em todos os canais e ajuste os dois o deslocamento mapeamento em x - e y-direção com uma 2D polinomial de grau três9.</li>
</ol>3. selecção dos traços de único-molécula
<ol><li>A análise dos dados é feita com in-house scripts usando Igor Pro. Carregar todos os scripts necessários através da abertura de "iniTIRF.ipf" e selecione o tipo correto de experiência. Nota: no seguinte, < botão > especifica elementos clicáveis no menu ou a interface do usuário. Chamadas de função são indicadas entre aspas, por exemplo, "Print"Hello World"". Esses comandos podem ser colados na linha de comando do Igor Pro (sem as aspas de fechamento).</li>
	<li>Verifique se que os parâmetros para o registo do canal de deteção são carregados.</li>
	<li>Inicie a GUI clicando < smFRET novo | Análise GUI >.</li>
	<li>Carrega os filmes (ou seja, a sequência de quadros com 512 x 512 pixels armazenados como pilhas TIFF de 16 bits) que seguram a intensidade nos respectivos canais. Fazer isso pressionando o botão < filme de carga > e selecionando os arquivos das câmeras "mestre" e "escravo" so-called um após o outro.</li>
	<li>Identifica as posições dos potenciais moléculas simples, procurando os pontos mais brilhantes na soma dos cinco primeiros quadros em um determinado canal de deteção. Calcule as posições correspondentes em todos os outros canais de deteção de mapeamento do canal. Para obter o rastreamento de intensidade de fluorescência, soma-se a intensidade de um quadrado de pixel em torno da posição central para cada quadro. Fazer isso pressionando o botão < encontrar vestígios > no GUI. Nota: O comprimento do lado do quadrado (em pixel) é dada por: 2 * < soma Pxs > + 1.</li>
	<li>Para cada molécula, calcule um traço comum intensidade crua como a soma de todos os vestígios deste local com a mesma cor de excitação. Avalie o perfil de intensidade da molécula em todos os canais para os seguintes critérios:<ol>
<li>Um planalto aproximadamente plano em intensidade crua conjunta e um branqueamento único passo para todas as cores de excitação, comportamento anticorrelated nos canais apropriados de deteção, detecção de fluorescência vermelha (indicando FRET para um limite AMP-PNP *) pelo menos uma vez dentro do rastreamento e não há várias etapas na fluorescência vermelha, que indicaria a presença de dois AMP-PNP * acoplado a um dímero de Hsp90.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Salve os traços de fluorescência do local para posterior análise, se estes critérios forem satisfeitos. Fazer isso selecionando o rastreamento com o cursor e pressionando o botão < salvar > no gráfico de "prazos". Inspecione manualmente os traços de intensidade em todos os três canais de deteção após excitação azul para cerca de 200 moléculas por filme.</li>
</ol>4. cálculo dos traços fluorescência parcial
<ol><li>Exiba todos os vestígios de intensidade de fluorescência para uma das moléculas salvas. Use os cursores no gráfico para selecionar intervalos de tempo.</li>
	<li>Selecione um intervalo de tempo onde todos os fluorophores são clareados já. A intensidade média do fundo é calculada a partir desse intervalo e subtraída o rastreamento de intensidade em cada canal. Fazer isso pressionando o botão < Background >.</li>
	<li>Selecione o intervalo de eficiência FRET, onde pelo menos ambos os corantes anexados a Hsp90 (Atto488 e Atto550) estão presentes. Certifique-se de excluir rastreamentos que contêm um evento piscando (ver Figura 3B). Esses eventos são caracterizados por uma intensidade de fluorescência de drop-in em um canal sem um aumento que acompanha qualquer outro canal.</li>
	<li>Calcule os vestígios PF . Fazer isso pressionando o botão < PF Calc >. Os factores de correcção predefinidos para vazamento aparente (LC) e aparente gama (ag) são aplicados a intensidade crua para corrigir para foto-física e propriedades de configuração.</li>
</ol>5. população seleção e ajuste de histograma 3D
<ol><li>Remova moléculas que mostram uma baixa relação sinal-ruído nos vestígios PF . Moléculas que excedem o intervalo [-1; 2] em qualquer vestígio PF para mais de 10% dos quadros são removidas do conjunto de dados. Fazer isso, executar o "RemoveTracesLowSNR()" na janela de comando.</li>
	<li>Calcule binned projeções 2D de dados da PF . Lote <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq12.jpg"> </img>sobre <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq13v2.jpg"> e <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq14.jpg"> sobre <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq13v2.jpg"> no intervalo [-0.5; 1.5] com uma resolução de 100 x 100 caixas. Para fazer isso, execute:<ol>
<li>"HistFret2D ("r_b","r_g", binHist = 100)"</li>
		<li>"HistFret2D ("r_b","g_b", binHist = 100); MoveWindow 553.5, 42,5, 1055.25, 508,25"</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine a população relativa de cada Estado distinguível nas projecções 2D.<ol>
<li>Trazer o gráfico apropriado para a frente e executar o "panelHist2DCount()".</li>
		<li>Pressione a tecla < Init > e desenhar um polígono de mão livre em volta do pico.</li>
		<li>Clique no botão < contagem >. O número de pontos de dados no polígono e o número total de pontos de dados na projeção são impressos na janela de comando.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar um histograma 3D dos dados PF executando "HistFret3D ("g_b","r_b","r_g")".</li>
	<li>Normalize o histograma 3D para uma integral de 1. Execute o seguinte:<ol>
<li>"Fit0 de NewDataFolder/S"</li>
		<li>"Duplicata/O:: FRET: Hist3D, Hist3D"</li>
		<li>"Div variável/g = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0)) ^ 3"</li>
		<li>"Hist3D = div; Impressão div"</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fornece parâmetros iniciais para o Gaussian 3D se encaixa e preparem estruturas de dados necessárias.<ol>
<li>Execute "Gauss3D_initParam(); editar W_coef_old."</li>
		<li>Adicione as populações do estado até o fim do vetor parâmetro.</li>
		<li>Executar "Gauss3D_prepareFit()." Nota: W_coef_old é um vetor que contém os parâmetros iniciais para o ajuste. Por Estado, isso significa <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq15.jpg"> e a população do estado, que é concatenada ao final do vetor. Certifique-se que a matriz de covariância é simétrica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cabe a soma de S funções Gaussian 3D para o histograma PF 3D, com S , sendo o número de Estados distinguíveis.<ol>
<li>Executar "do3D()." Isto pode demorar uma hora ou mais em um escritório normal PC, dependendo da qualidade dos parâmetros iniciais.</li>
		<li>Execute "postprocessFitMultiGauss3D(); evalFitMultiGauss3D(); editar W_coef."</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exiba o resultado de apto. Para cada uma das duas projeções 2D, use os seguintes comandos:<ol>
<li>"contourPF3D_new(0); contourPF3D_new(1); contourPF3D_new(2); contourPF3D_new(3); contourPF3D_new(4)"</li>
		<li>"contourPF3D_colorize()"</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. cinética análise 3D Ensemble HMM
<ol><li>Prepare um ensemble HMM executar para extrair as informações cinéticas. Um HMM é otimizado de todas as moléculas no conjunto de dados. Use as informações obtidas na etapa anterior para definir a posição e a largura de cada Estado no espaço 3D PF .<ol>
<li>Inicializar a interface do usuário HMM (< HMM | Init HMM >) e escolha o número apropriado de Estados-Membros (no caso dos dados Hsp90 isso significa < NumStates > = 5), o número de dimensões do sinal de entrada (< NumDims > = 3) e o tipo da entrada (< Input Type > = "FRET bgr 3D").</li>
	</ol>
</li>
	<li>Otimizar os parâmetros do HMM, deixando o software convergem a probabilidade do HMM (execute "prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1), -14)") até que a mudança na matriz de transição, em comparação com a iteração anterior cai abaixo de um limite (10-14 para a soma da mudança absoluta para cada probabilidade de transição). Isto rende o MLE para as probabilidades de transição em cerca de uma hora em um PC normal do escritório.</li>
	<li>Repita a seleção da população, encaixe gaussiana e a otimização de HMM para subconjuntos de dados (por exemplo, 75% do conjunto de dados completo). Se fundiu-se o conjunto de dados completo de experiências diferentes, repita a otimização também para cada um dos experimentos simples. Análise de subconjuntos permite estimar a incerteza da seleção manual da população e a variabilidade dentro do conjunto de dados.</li>
	<li>Calcule o CI para as probabilidades de transição, que o relatório sobre a heterogeneidade do conjunto de dados e a precisão do HMM.<ol>
<li>Obter uma estimativa aproximada dos limites CI executando "$cd (raiz: path3Dimport +"HMM"); loop_getCI_estimate_limits()."</li>
		<li>Calcule os limites exatos da IC, executando:</li>
		<li>"loop_getCI_HMM_converge(1)"</li>
		<li>"CIresults_conv_new()"</li>
		<li>"cd:: HMM_CIresult; reportCI_conv()"</li>
		<li>"cd:: cmp_CI_conv; CI_plot2 ("HMM", doAppend = 0) "</li>
	</ol>
</li>
	<li>Condense as informações cinéticas disponíveis para simplificar a interpretação.<ol>
<li>Colete informações sobre o tempo um nucleotídeo rotulado permanece ligado à Hsp90. Para fazer isso, o colapso dos Estados que são obrigados a AMP-PNP * (ou seja, S1e S2 , S3, ver também a Figura 2) e compilar o histograma de tempo de permanência. Execute o "cd $(raiz: path3Dimport +"HMM"); collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0}) ", que combina habita de Estados S0 e S4 bem como S1e S2S3.</li>
		<li>Extrair os tempos de permanência do caminho de Viterbi para cada Estado de interesse e comparar o histograma resultante de tempo Habitai para diferentes condições experimentais. Execute "plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)."</li>
		<li>Para uma imagem mais detalhada, colapso dos Estados que têm distintas PF mas são funcionalmente idênticos para facilitar a análise de dados adicional, por exemplo, no caso de um experimento de três cores com Hsp90 etiquetados e nucleotídeos, Estados S2 e S 3 pode ser recolhido. Executar "collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})."</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Apresentamos o procedimento experimental para obter dados de três cores smFRET para um sistema complexo de proteínas e uma descrição passo a passo da análise dessas medições. Essa abordagem oferece a possibilidade única de avaliar diretamente a correlação entre vários sites de interação ou mudanças conformacionais.
A fim de obter dados de único-molécula multi cores adequados em proteínas é importante realizar as medições podem ser reproduzidas em um baixo nível de ruído. ...

Muitas proteínas cumprem sua função em dinâmicos complexos com outras moléculas, mediadas por mudanças conformacionais e associações transientes em uma ampla gama de escalas temporais1,2,3. Acoplado a uma fonte de energia externa (por exemplo, ATP) essas interações dinâmicas podem levar a direcionalidade de um ciclo funcional e, finalmente, manter o estado de desequilíbrio constante em uma célula, o pré-requisito para a vida.
A fim de compreender plenamente essas máquinas moleculares, uma descrição estática guiada por estudos estruturais não é suficiente. Além disso, é essencial ter conhecimento do modelo cinético subjacente e determinar as constantes de velocidade cinética. Vários métodos existentes permitem aos pesquisadores estudar a dinâmica de interações de binárias entre duas moléculas de interesse, por exemplo, ressonância de plasmon de superfície, métodos de relaxamento com uma leitura espectroscópico (por exemplo, o salto ou fluxo parou técnicas) e ressonância magnética nuclear. No entanto, sua aplicabilidade é na maioria dos casos limitados a simples sistemas de dois Estados (por exemplo, um limite e um estado desacoplado) devido a média de inerente às experiências em massa. Em casos onde a mais Estados ou intermediários estão envolvidos, rendem apenas uma mistura complexa das constantes de velocidade. Único-molécula métodos tais como Pinça óptica ou magnética ou smFRET de duas cores, ou seja, um doador e um aceitador fluoróforo, com uma amostra de superfície-imobilizado podem recuperar as constantes de taxa para todos observadas mudanças conformacionais. No entanto, quando se trata de interações que afetam o sítio de ligação a mais de um, esses métodos permanecem limitados e as informações sobre as interações de possível correlação dos dois (ou mais) só será acessíveis via indirectas conclusões de um conjunto de experiências.
Multi cor smFRET4,5,6,7,8,9 oferece a oportunidade de estudar a interação entre esses componentes directamente, em tempo real e sob condições fisiológicas perto de10. Isso permite que um para investigar, por exemplo, a vinculação dependente da conformação de um ligante ou outra proteína8,9,11. A abordagem global apresentada aqui é para rotular as somáticas de interesse em posições específicas, para anexar uma proteína para a superfície da câmara de medição e para controlar a intensidade da fluorescência ao longo do tempo em um prisma-tipo TIRFM (para detalhes veja 9 , 12). a proximidade espacial das tinturas diferentes então pode ser determinada a partir a transferência de energia entre eles. Estratégias de rotulagem pode variar de proteína a proteína (revista em 13) e orientações para evitar artefatos nas medições smFRET existem14.
Desde que um corante doador pode transferir energia para aceitador diferentes corantes em um experimento smFRET multi cor, a posição relativa de todos os corantes não é acessível a partir da excitação de um corante sozinho15,16. Mas em combinação com a alternância de excitação do laser (ALEX17e revisto em 18) este método fornece todas as informações de espaço-temporal em segundo e resolução de sub nanômetros.
No principal, de alta resolução, informações estruturais podem ser conseguidas usando-se as distâncias de tintura inter calculadas a partir da combinação de todas as intensidades de fluorescência em um smFRET de cor multi experiência com ALEX. No entanto, aqui focamos na identificação de estado e de separação, bem como a extração de modelos cinéticos, onde smFRET multi cor é indispensável. Quando "só" determinação de estrutura por triangulação é desejada, um conjunto de experiências mais simples de duas cores smFRET com alta relação sinal-ruído pode ser realizada de12,19.
Nós usamos a fluorescência parcial (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq1.jpg">) como um proxy para a transferência de energia entre dois fluorophores7. A PF é calculado a partir da intensidade de fluorescência análoga à eficiência de traste de um experimento de duas cores:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq2.jpg">
Onde, <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq3v2.jpg"> é a intensidade de emissão canal em após excitação com cor ex, e c é o aceitador com o comprimento de onda mais longo. Canais de deteção representam a mesma posição na câmara de amostra, mas registros diferentes intervalos espectrais da luz da fluorescência. O mesmo identificador para excitação e emissão são utilizados neste protocolo (ou seja, "azul", "verde" e "vermelho").
Por causa de deficiências experimentais as intensidades de fluorescência medido dependem não só sobre a transferência de energia mas também Propriedades fluoróforo e instalação. Para obter a eficiência de transferência de energia verdadeira entre dois fluorophores, as intensidades medidas tem que ser corrigido. O procedimento a seguir baseia-se na referência9. Fatores de correção para vazamento aparente (LC, ou seja, a detecção de fótons de um fluoróforo num canal designada para outro corante) e aparente gama (ag, ou seja, o rendimento quântico de fluorescência do corante e a eficiência de deteção do canal) são obtidos a partir de vestígios de único-molécula que mostram um aceitador evento de branqueamento.
O escapamento do doador corante em todos os canais possíveis aceitador é calculado a partir de todos os pontos de dados nos vestígios de fluorescência gravada onde o corante aceitador branqueada, mas o doador é ainda fluorescente (<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq4.jpg">):
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq5.jpg">
A mediana do histograma escapamento é usada como o fator de vazamento aparente. Após a correção para detecção de fugas, o fator gama aparente é determinado a partir do mesmo conjunto de traços. É calculado dividindo-se a mudança da fluorescência no canal aceitador pela mudança de fluorescência no canal ao descoramento do corante aceitador de doador:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq6.jpg">
Onde c é novamente o canal de deteção para o aceitador com o comprimento de onda mais longo. A mediana da distribuição resultante é usada como o fator de correção aparente.
As intensidades corrigidas em cada canal são obtidas por:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq7.jpg">
A PF é então calculado de acordo com:
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq8.jpg">
Diferentes populações podem ser separadas no espaço multidimensional ocupado pela s da PF. A posição e a largura de cada Estado é determinado pelo ajuste os dados com funções Gaussian multidimensionais. Otimização subsequente de um HMM global com base em todos os vestígios PF fornece uma descrição quantitativa de cinética observada. Mesmo as pequenas alterações das taxas são detectáveis.
HMMs fornecem uma maneira de se inferir um modelo de estado de uma coleção de traços de tempo barulhento. O sistema é considerado em parte de um conjunto de discreta, Estados ocultos em um determinado momento e a observação real (ou seja, a emissão) é uma função probabilística deste estado oculto20. No caso dos dados de smFRET TIRFM, a emissão probabilidades beu por Estado, pode ser modelado por funções de densidade de probabilidade gaussiana contínua. Em pontos regularmente espaçados de tempo discreto, transições de um para outro Estado podem ocorrer de acordo com a probabilidade de transição que é invariante no tempo e só depende do estado atual. A matriz de transição A contém estas probabilidades de transição umij entre todos os Estados-Membros escondidos. A distribuição de estado inicial <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq9.jpg"> dá as probabilidades específicas de estado <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq10.jpg"> para o primeiro ponto de tempo de um rastreamento de tempo. Usando uma abordagem de máxima probabilidade, estes parâmetros podem ser otimizados para melhor descrevem os dados com o para diante-para trás e Baum-Welch algoritmos20,21. Isso produz os estimadores de máxima verossimilhança (MLE). Finalmente, a sequência de estado que provavelmente produzido a trajetória de observações pode ser inferida com o algoritmo de Viterbi. Em contraste com outras analises HMM smFRET dados24,25,26 não usamos o HMM como um mero "suavização" da dados, mas o modelo de estado cinético extraído do conjunto de dados sem a necessidade para caber o tempo de permanência histogramas de27. HMM análise é feita com in-house scripts usando Igor Pro. Aplicação do código baseia-se na referência21. Nós fornecemos um kit de software e dados exemplares na nossa página da Web para seguir seções 5 e 6 do presente protocolo (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). Software completo está disponível mediante pedido.
Pontos nos dados com PF < -1 ou PF > 2 em qualquer canal de deteção são atribuídos a probabilidade de emissão mínima para todos os Estados (10-200). Isso impede que transições artificiais nestes pontos de dados.
Os parâmetros para as probabilidades de emissão são obtidos a partir do ajuste do histograma PF 3D com funções Gaussian conforme descrito na etapa 5.7. Esses parâmetros são mantidos fixos durante a otimização do HMM.
Na abordagem apresentada, o vetor de distribuição do estado inicial e a matriz de transição são utilizados mundialmente para descrever todo o conjunto de traços. Eles são atualizados com base em todas as moléculas de N do conjunto de dados de acordo com a referência27.
Parâmetros para a distribuição de estado inicial são determinados de projeções 2D do histograma PF (etapa 5.3) e as probabilidades de transição são definidas como 0,05 com exceção as probabilidades de permanecer no mesmo estado, que são escolhidos tais que a probabilidade de sair de um determinado estado é normalizada à unidade.
Um método de criação de perfil de probabilidade é usado para dar intervalos de confiança (CIs) para todos os transição taxas21,22, que servem como estimativas significativas para sua incerteza. Para calcular os limites da IC para uma taxa específica, a probabilidade de transição de juros é fixa para um valor diferente do MLE. Isto rende o teste modelo λ'. Um teste de ratio (LR) probabilidade da probabilidade <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq16.jpg"> dado o conjunto de dados 0 é realizada de acordo com:
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56896/56896eq11.jpg">
A confiança de 95% vinculada para o parâmetro é alcançado quando LR excede 3,841, o Quantil de 95% de um X2-distribuição com um grau de liberdade22,23.
O poder do método é demonstrado usando o Hsp90. Esta proteína abundante é encontrada em bactérias e eucariotas e é parte do estresse celular resposta28. É um alvo de droga promissora no tratamento de câncer29. Hsp90 é um homodímero com um bolso de ligação de nucleotídeos do domínio N-terminal de cada subunidade30. Ele pode sofrer transições pelo menos duas conformações distintas globalmente, um fechado e um N-terminal conformação aberta, em forma de V19,31,32. A natureza dimérica diretamente a questão da interação entre os dois locais de ligação de nucleotídeos em Hsp90.
A seguir, fornecemos um protocolo passo a passo para a aquisição de dados e análise de um experimento de smFRET três cores na levedura Hsp90 e nucleotídeos. A vinculação dependente da conformação do AMP-PNP fluorescente etiquetadas (AMP-PNP *, um analog não hidrolisável do ATP) é analisada. A aplicação do procedimento descrito permite o estudo da ligação de nucleótidos e ao mesmo tempo as mudanças conformacionais de Hsp90 e, assim, revela a cooperatividade entre os dois bolsos de vinculação de nucleotídeo de Hsp90.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vibration-damped optical table&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Newport, Irvine, CA, USA</td><td>RS2000</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 473nm LX 75mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1185052</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 532nm LS 50mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1261779</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 594nm LS 60mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1233470</td><td></td></tr><tr><td>OBIS 637nm LX 140mW LASER</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1196625</td><td></td></tr><tr><td>laser control unit</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td>1234465</td><td>Scientific Remote</td></tr><tr><td>aspheric telescope lenses</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td></td><td>d=25.4mm, f=50mm and f=100mm</td></tr><tr><td>CF ex1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZET 473/10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>CF ex2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZET 532/10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>CF ex3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZET 594/10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>CF ex4</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td>FL635-10</td><td>cleanup filter excitation</td></tr><tr><td>DM ex1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZQ594RDC</td><td>dichroic mirror excitation</td></tr><tr><td>DM ex2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>570DCXR</td><td>dichroic mirror excitation</td></tr><tr><td>DM ex3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>ZQ491RDC</td><td>dichroic mirror excitation</td></tr><tr><td>AOTFnC-Vis</td><td>AA Opto-Electronic, Orsay, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;lambda;/4 plate</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td>AQWP05M-600</td><td></td></tr><tr><td>CFI Apo TIRF 100x</td><td>Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA</td><td></td><td>high-NA objective</td></tr><tr><td>piezo focus positioner MIPOS 250 CAP</td><td>piezosystem jena GmbH, Jena, Germany</td><td></td><td>Piezo Controller NV 40/1 CLE</td></tr><tr><td>piezo stepper</td><td>Newport, Irvine, CA, USA</td><td>PZA12</td><td>PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit</td></tr><tr><td>achromatic aspheric lenses</td><td>Qioptiq Photonics GmbH &amp;amp; Co. KG, G&amp;ouml;ttingen, Germany</td><td>G322-304-000</td><td>d=50mm, f=200mm</td></tr><tr><td>adjustable optical slit</td><td>Owis GmbH, Staufen i. Br., Germany</td><td>27.160.1212</td><td>max. aperture 12 x 12 mm</td></tr><tr><td>DM det1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>T 600 LPXR</td><td>dichroic mirror detection</td></tr><tr><td>DM det2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>H 560 LPXR superflat</td><td>dichroic mirror detection</td></tr><tr><td>DM det3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>HC BS R635</td><td>dichroic mirror detection</td></tr><tr><td>BP det1</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>525/40 BrightLine HC</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>BP det2</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>586/20 BrightLine HC</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>BP det3</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>631/36 BrightLine HC</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>BP det4</td><td>AHF analysentechnik AG, T&amp;uuml;bingen, Germany</td><td>700/75 ET Bandpass</td><td>bandpass filter detection</td></tr><tr><td>optical shutters detection</td><td>Vincent Associates, Rochester, NY, USA</td><td>Uniblitz VS25S2T0&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD iXon Ultra 897</td><td>Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>digital I/O card, PCIe-6535</td><td>National Instruments, Austin, Texas, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>syringe pump</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>PHD22/2000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Flow chamber&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>quartz slides</td><td>G. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USA</td><td></td><td>Spectrosil2000, h=3mm</td></tr><tr><td>TEGADERM film</td><td>3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td><td>1626W</td><td>10 x 12cm</td></tr><tr><td>spray adhesive</td><td>3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany</td><td>Photo Mount 050777</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany</td><td>Immersol G</td><td></td></tr><tr><td>immersion oil</td><td>OLYMPUS EUROPA SE &amp;amp; CO. KG, Hamburg, Germany</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>prism</td><td>Vogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, Germany</td><td></td><td>Suprasil1</td></tr><tr><td>aluminium prism holder</td><td></td><td></td><td>custom built</td></tr><tr><td>hollow setscrews</td><td>Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USA</td><td></td><td>with custom drilling</td></tr><tr><td>Tygon S3 E-3603 tubing</td><td>neoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany</td><td>2-4450</td><td>ACF00001</td></tr><tr><td>PTFE tubing</td><td>Bohlender GmbH, Gr&amp;uuml;nsfeld, Germany</td><td>S1810-08</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sample&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotin</td><td></td><td></td><td>UniProt ID P02829</td></tr><tr><td>Maleimide derivatives of Atto488, Atto550</td><td>ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP*</td><td>Jena Bioscience, Jena, Germany</td><td></td><td>&amp;gamma;-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N</td></tr><tr><td>Fluospheres</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>F8764</td><td>amine-modified, 0.2 &amp;mu;m, yellow-green fluorescent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor Solis</td><td>Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland</td><td></td><td>version 4.30</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments, Austin, Texas, USA</td><td></td><td>version 2012, 32bit; misc. hardware control</td></tr><tr><td>MDS control software</td><td>AA Opto-Electronic, Orsay, France</td><td></td><td>version 2.03a</td></tr><tr><td>Coherent Connection</td><td>Coherent Inc, Santa Clara, CA, USA</td><td></td><td>version 3</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics Inc, Portland, OR, USA</td><td></td><td>version 6.37</td></tr></tbody></table>

using three-color single-molecule fret to study the correlation of protein interactions

Transferência de energia de ressonância do único-molécula Förster (smFRET) tornou-se uma técnica amplamente utilizada biofísica para estudar a dinâmica de biomoléculas. Para muitas máquinas moleculares em proteínas uma célula tem de agir em conjunto com parceiros de interação em um ciclo funcional a cumprir sua tarefa. A extensão de duas cores para cor multi smFRET possibilita a sonda simultaneamente mais de uma interação ou mudança conformacional. Isto não só acrescenta uma nova dimensão às experiências de smFRET, mas também oferece a possibilidade única de estudar diretamente a sequência de eventos e para detectar interações correlacionadas ao usar uma amostra de imobilizado e uma fluorescência de reflexão interna total microscópio (TIRFM). Portanto, multi cor smFRET é uma ferramenta versátil para estudar biomolecular complexos de forma quantitativa e em um detalhe anteriormente inatingível.
Aqui, demonstramos como superar os desafios especiais de multi-cor smFRET experimentos sobre proteínas. Apresentamos a protocolos detalhados para obtenção dos dados e para extrair as informações cinéticas. Isso inclui os critérios de seleção de rastreamento, separação do estado e a recuperação de trajetórias de estado a partir dos dados ruidosos usando um ensemble 3D Hidden modelo de Markov (HMM). Em comparação com outros métodos, as informações cinéticas não são recuperadas de histogramas de tempo de interrupção mas diretamente do HMM. O quadro de máxima verossimilhança nos permite avaliar criticamente o modelo cinético e prever as taxas significativas incertezas.
Através da aplicação de nosso método para a proteína de choque do calor 90 (Hsp90), somos capazes de separar a ligação de nucleotídeos e as globais mudanças conformacionais da proteína. Isso nos permite observar diretamente a cooperatividade entre os dois bolsos de vinculação do nucleotide do dímero Hsp90.

Medições de cor multi smFRET permitem a detecção directa de correlação entre dois ou mais sites de interação distintos. Isso torna a técnica exclusiva para investigar sistemas multicomponentes, tais como os complexos da proteína. Focalizamos a apresentação de um experimento de três cores de smFRET aqui, que serve como um exemplo ilustrativo.
O fluxo de trabalho geral do método é mostrado na Fi...

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Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

Aqui, apresentamos um protocolo para obter dados de três cores de smFRET e sua análise com um ensemble 3D Hidden Markov modelo. Com esta abordagem, cientistas podem extrair informações cinéticas de sistemas complexos proteína, incluindo cooperatividade ou interações correlacionadas.

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.0K visualizações.  University of Freiburg. Aqui, apresentamos um protocolo para obter dados de três cores de smFRET e sua análise com um ensemble 3D Hidden Markov modelo. Com esta abordagem, cientistas podem extrair informações cinéticas de sistemas complexos proteína, incluindo cooperatividade ou interações correlacionadas.

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A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Bioquímica

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological functions. Such interactions can be highly dynamic, meaning the interacting subunits are constantly associated and dissociated at certain rates. While measuring the binding affinity using techniques such as quantitative pull-down reveals the strength of the interaction, studying the binding kinetics provides insights on how fast the interaction occurs and how long each complex can exist. Furthermore, measuring the kinetics of an interaction in the presence of an additional factor, such as a protein exchange factor or a drug, helps reveal the mechanism by which the interaction is regulated by the other factor, providing important knowledge for the advancement of biological and medical research. Here, we describe a protocol for measuring the binding kinetics of a protein complex that has a high intrinsic association rate and can be dissociated quickly by another protein. The method uses fluorescence resonance energy transfer to report the formation of the protein complex in vitro, and it enables monitoring the fast association and dissociation of the complex in real time on a stopped-flow fluorimeter. Using this assay, the association and dissociation rate constants of the protein complex are quantified.

Protein-protein interactions are critical for biological systems, and studies of the binding kinetics provide insights into the dynamics and function of protein complexes. We describe a method that quantifies the kinetic parameters of a protein complex using fluorescence resonance energy transfer and the stopped-flow technique. &#160;

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (&#181;M range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.

Measuring TCR-pMHC Binding In Situ using a FRET-based Microscopy Assay

This manuscript describes how to conduct (single molecule) F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen ...

Bioengenharia

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Espectroscopia de fluorescência de dupla cor para estudar interação proteína-proteína e dinâmica de proteína em células vivas

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

Imagem interações proteína-proteína In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Biologia

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

Análise espacial bidimensional automatizada de sondas FRET de molécula única móvel

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) provide accurate information about PPIs in live cells. FLIM-FRET relies on measuring the fluorescence lifetime decay of a FRET donor at each pixel of the FLIM image, providing quantitative and accurate information about PPIs and their spatial cellular organizations. We propose here a detailed protocol for FLIM-FRET measurements that we applied to monitor PPIs in live Pseudomonas aeruginosa in the particular case of two interacting proteins expressed with highly different copy numbers to demonstrate the quality and robustness of the technique at revealing critical features of PPIs. This protocol describes in detail all the necessary steps for PPI characterization - starting from bacterial mutant constructions up to the final analysis using recently developed tools providing advanced visualization possibilities for a straightforward interpretation of complex FLIM-FRET data.

We describe here a protocol to characterize protein-protein interactions between two highly-differently expressed proteins in live Pseudomonas aeruginosa using FLIM-FRET measurements. The protocol includes bacteria strain constructions, bacteria immobilization, imaging and post-imaging data analysis routines.

Medições FLIM-FRET de Interações proteína-proteína em bactérias vivas.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the distance and orientation of the molecules as well as the extent of overlap between the donor emission and acceptor absorption spectra. FRET permits to study the interaction of proteins in the living cell over time and in different subcellular compartments. Different intensity-based algorithms to measure FRET using microscopy have been described in the literature. Here, a protocol and an algorithm are provided to quantify FRET efficiency based on measuring both the sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule. The quantification of ratiometric FRET in the living cell not only requires the determination of the crosstalk (spectral spill-over, or bleed-through) of the fluorescent proteins but also the detection efficiency of the microscopic setup. The protocol provided here details how to assess these critical parameters.

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorophore molecules can be used for studying protein interactions in the living cell. Here, a protocol is provided as to how to measure FRET in live cells by detecting sensitized emission of the acceptor and quenching of the donor molecule using confocal laser scanning microscopy.

Avaliando interações proteicas em células vivas com emissão sensibilizada por FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and amending cellular functions. These interactions are involved in a wide range of phenomena such as signal transduction, pathogen response, cell-cell interactions, metabolic and developmental processes. In the case of transcription factors, these interactions may lead to oligomerization of subunits, sequestering in specific subcellular contexts such as the nucleus, cytoplasm, etc., which, in turn, might have a more profound effect on the expression of the downstream genes. Here, we demonstrate a methodology to visualize in vivo tripartite interaction using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) based F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) involving Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Two of the proteins selected for this demonstration interact as BiFC partners, and their reconstituted fluorescence activity is used to assay FRET-FLIM with the third partner. Four to five-week-old growth-chamber-grown Nicotiana benthamiana plants have been used as the model plant system for this demonstration.

Here we present, a method to visualize ternary complex formation between three protein partners using fluorescent-tagged proteins by BiFC based FRET-FLIM assay. This method is valuable for studying protein-protein interaction complexes in vivo.

Determinação da interação tripartite entre dois monômeros de um fator de transcrição da caixa MADS e uma proteína de sensor de cálcio por Ensaio BiFC-FRET-FLIM

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Fluorescence Fluctuation Spectroscopy to Study Protein Interaction at Cell Contacts

Source: Dunsing, V. et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58582">A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2018).
This video demonstrates the use of fluorescence fluctuation spectroscopy to detect the interaction among cell surface proteins at cell-cell contacts. By expressing the transmembrane adhesion receptor of interest labeled with a fluorescent protein and mixing two different cell populations harboring two spectrally separated fluorescent labels, the trans-interaction between the receptors of two neighboring cells with different-colored fluorescence is assessed via cross-correlation in the fluctuations of fluorescence intensity.

Espectroscopia de Flutuação de Fluorescência para Estudar a Interação de Proteínas em Contatos Celulares

Source: Dunsing, V. et al. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp.&#160;(2018).
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Usando três cores único-molécula FRET para estudar a correlação de interações da proteína

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