Name: measuring mrna levels over time during the yeast s. cerevisiae hypoxic response
Uploaded: 2017-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
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Agradecemos o Instituto Lewis-Sigler Integrativa facilidade do núcleo do sequenciamento de genómica da Universidade de Princeton para aconselhamento técnico e para a preparação de biblioteca de RNA e sequenciamento. Este trabalho foi financiado por doações da Universidade Rowan e NIH NIGMS R15GM113187 para M.J.H.

1. indução de hipóxia
<ol><li>Um dia ou mais antes do curso do tempo de hipoxia: preparar a incubadora, célula de filtragem sistema, vácuo, tanque de gasolina, balões, rolhas, tubos de vidro e tubos, como a Tabela de materiais.</li>
	<li>Coloque o tanque de2 N, incubadora, sistema de vácuo e filtragem nas proximidades, para permitir o processamento rápido das células.</li>
	<li>Prepare a mídia YPD líquida estéril (1% de extracto de levedura, peptona de 2%, 2% de glicose) misturando os componentes em um frasco de vidro e autoclave.</li>
	<li>Planeje o layout dos balões na incubadora. Nota: O tanque de2 N, o primeiro balão será uma armadilha de água, o segundo frasco será o último ponto de tempo, o terceiro frasco será o tempo do segundo para o último ponto e assim por diante até o último frasco que é uma armadilha de água final. A Figura 1 mostra a ordem e as conexões entre os frascos.</li>
	<li>O dia antes do curso do tempo, inocule uma colônia de levedura em uma cultura de 5 mL de YPD líquido dentro de um tubo de ensaio estéril. Especificamente, pega uma colônia cheia de uma placa utilizando uma ansa esterilizada. Coloque o stick no líquido YPD e apertar o pau até que a maioria das células em suspensão.</li>
	<li>Gire os tubos a 30 ° C durante a noite (~ 16 h). Nota: Após 16 h, sua células vão atingir saturação (~ 2 x 108 células/mL), indicada por uma cultura muito nublada. Outras cepas podem levar mais tempo para atingir a saturação e devem ser testadas por medir a concentração de células com um espectrofotômetro, conforme indicado no passo 1.9.4.</li>
	<li>No dia do curso de tempo, depois de 16 h de incubação, diluir a cultura saturada 01:50, usando uma pipeta de 5 mL para colocar 4 mL de pernoite cultura em 196 mL de YPD líquido dentro de um frasco estéril 500 mL. Crescer com agitação a ~ 200 rpm por 4 h a 30 ° C. Nota: Após 4 h, a sua cultura vai chegar a uma concentração de registro médio de ~ 1-2 x 107 células/mL.</li>
	<li>Durante a incubação de 4 h, Rotule os frascos (para armadilhas de hipóxia e água) e os 50 mL tubos de colheita. Se a incubadora na etapa 1.7 acima não é usada para o curso de tempo de hipóxia, ligue a outra incubadora e definir a 30 ° C.</li>
	<li>
Antes de submeter as células a hipóxia:
	<ol>
<li>Adicione ~ 50 mL de água para dois dos frascos 250ml estéril que servirão as armadilhas de água.</li>
		<li>Encha 1/3 de um gelo balde com nitrogênio líquido e mergulhe um rack de espuma de poliestireno para segurar tubos de centrífuga de 50 mL.</li>
		<li>Configure o sistema de filtro para a coleta de células. Adicione um disco de filtro estéril para a unidade inferior do sistema de filtração, usando uma pinça estéril, tendo o cuidado de só tocar as bordas do disco filtro. Coloque a unidade de filtro superior na unidade inferior do filtro e prenda com os grampos fornecidos com o sistema. Certifique-se de que as unidades inferior e superior são alinhadas para que haja um selo apertado e nenhum escapamento.</li>
		<li>Medir a concentração de células com um espectrofotômetro. Dilua as células para que eles podem ser medidos na escala linear do espectrofotómetro – OD600 entre ~0.2 - 0.6, dependendo do espectrofotómetro. Nota: Uma unidade de600 OD é ~ 3 x 107 células/mL, dependendo da morfologia celular e Espectrofotômetro. Espera-se uma concentração de 1 ~ 2 x 107 células/mL, correspondente a OD600 de ~0.33 - 0,66.</li>
		<li>
Rapidamente obter a amostra de tempo 0.
		<ol>
<li>Ligue o sistema de filtro à vácuo forte (~ 10 mbar) através de tubos de vácuo e uma armadilha do frasco de 1.000 mL. Ligue o aspirador. Despeje a unidade superior da cultura (normalmente ~ 20 mL) e esperar para o líquido ser puxado através do filtro (~ 10 s, dependendo da força do vácuo).</li>
			<li>Com cuidado, retire o disco do filtro com uma pinça limpa e coloque em um tubo de centrífuga de 50 mL. Imediatamente, coloque o tubo de centrifugação dentro do rack mergulhado em nitrogênio líquido. Importante, não pre-chill os tubos antes de inserir o filtro vão explodir os tubos.</li>
			<li>Depois > 30 s, lugar o tubo em um freezer-80 ° C para posterior extração do RNA. Após cada filtração, limpar e remontar o sistema de filtro. Enxaguar o sistema, puxando a água de 10 s sem um disco de filtro. Finalmente, seque o sistema com uma toalha de papel.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dilua a cultura de 4h em frascos diferentes para os vários pontos de tempo, para que cada balão atinge concentração log médio (~ 1-2 x 107 células/mL) no ponto indicado tempo de hipóxia. Nota: A tabela 1 mostra as diluições que foram usadas para a tensão de haploides selvagem-tipo S288C HAP1+ . É aconselhável testar cada estirpe nestas condições de cultura hipóxica e ajustar de acordo com as diluições.</li>
		<li>Uma vez que as células e mídia é adicionada para frascos, substitua a folha de alumínio cobrindo o balão abrindo com uma rolha contendo dois tubos de vidro inseridos.</li>
		<li>Coloca os frascos na incubadora no layout determinado anteriormente.</li>
		<li>Conecte firmemente o tubo conforme mostrado na Figura 1.</li>
		<li>Verifica que todas as rolhas são firmemente empurradas para as aberturas de balão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No tempo 0, abra a válvula do regulador. Em seguida, defina o medidor de fluxo de 3 L/min. Nota: Bubbling será observado em ambos os balões de água, indicando o fluxo adequado de gás. Se isso não for o caso, verifique se todas as rolhas são apertadas e tubulação está bem colocada.</li>
	<li>Fechar a incubadora e definir a velocidade de agitação para ~ 200 rpm. Inicie um timer.</li>
	<li>Cada ponto de tempo, antes de configurar o sistema de filtro como descrevo acima na etapa 1.9.3.</li>
	<li>
Em cada ponto de tempo (por exemplo, 5 min, 10 min, etc.), tem duas pessoas processar rapidamente as células da seguinte forma:
	<ol>
<li>Primeira pessoa: Remova o frasco apropriado do suporte e retire o bujão (com tubos de vidro ligados). Nota: Isto não vai quebrar o fluxo de N2 a qualquer dos restantes frascos cultura mas quebrará temporariamente o fluxo para a última armadilha de água.</li>
		<li>Segunda pessoa: Pipetar 1 mL da cultura e dispense em uma cubeta. Reconecte o tubo do frasco de cultura que é agora no fim da linha para a última armadilha de água (um tubo e uma rolha vai ser eliminada durante o processo.). Em seguida, medir a concentração de células na cubeta, conforme descrito acima na etapa 1.9.4.</li>
		<li>Primeira pessoa: Despeje o restante da cultura o sistema de filtragem de vácuo e em seguida, executar a filtragem e congelamento conforme descrito acima na etapa 1.9.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando acabar com todos os pontos de tempo, desligue o gás de2 N. Primeiro fechar o regulador e esperar que a pressão liberar e depois desligar o medidor de fluxo. Finalmente, desmontar o sistema e limpar todos os materiais com água e em seguida etanol 70%.</li>
</ol>2. extração do RNA
<ol><li>Prepare o tampão RLT para purificação de RNA coluna, conforme descrito na Tabela de materiais.</li>
	<li>Preparar uma solução de trabalho de DNase, adicionando 10 µ l da solução estoque de DNase a 70 µ l de tampão RDD por amostra (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Retirar os tubos de 50 mL contendo filtros e células do freezer-80 ° C e colocar no gelo a derreter (~ 15 min). Execute as seguintes etapas com tubos no gelo.</li>
	<li>Rotular mL 2 tubos de tampa de rosca e coloque-os em gelo, um tubo para cada amostra. Adicione ~0.6 mL de grânulos ácido lavado a cada tubo, usando um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para colher e medir os grânulos.</li>
	<li>Adicione 0,6 mL de tampão RLT frio para os tubos de 50 mL.</li>
	<li>Pipetar acima e para baixo para remover células de filtro e suspender em solução. Evite deixar o filtro permanecem na solução, como o filtro irá absorver a solução. Remover toda solução absorvido o filtro usando a ponta da pipeta para apertar o filtro contra a parede do tubo.</li>
	<li>Transferi todo o líquido do tubo de 50 mL para os tubos de tampa de rosca contendo grânulos.</li>
	<li>Coloque os tubos de tampa de rosca em um homogeneizador de moinho do grânulo e concorrer a um min. Imediatamente, coloque os tubos no gelo durante três minutos. Novamente, coloque os tubos para o homogeneizador e concorrer a um min.</li>
	<li>Retire os tubos do homogenizador e lugar no gelo por 5 min. As contas vão resolver para o fundo do tubo.</li>
	<li>Execute o restante das etapas à temperatura ambiente.</li>
	<li>Com uma pipeta, transferir somente o lisado (~ 350 µ l), evitando os grânulos, para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Microcentrifuga por 2 min em velocidade máxima e a transferência então o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Adicione 1 volume de etanol a 70% (feito de etanol de grau biologia molecular prova 200). Misture bem por pipetagem.</li>
	<li>Transferir a solução e qualquer precipitado para uma coluna de RNA que foi colocada dentro de um tubo de coleta de 2 mL.</li>
	<li>Centrifugar por 15 s em ≥12, 000 x g e descarte o escoamento (o líquido no tubo).</li>
	<li>Adicione 350 µ l de tampão RW1 à coluna. Centrifugar por 15 s em ≥12, 000g x e descarte o escoamento.</li>
	<li>Adicione 80 µ l DNase mistura de incubação para a membrana de coluna (não ficar nos lados do tubo) e deixe para descansar por 15 min.</li>
	<li>Adicione 350 µ l de tampão RW1 a coluna. Microcentrifuga por 15 s em ≥12, 000 x g e descarte o escoamento.</li>
	<li>Adicione 500 µ l de tampão RPE à coluna. Microcentrifuga por 15 s em ≥12, 000 x g e descarte de passagem.</li>
	<li>Adicione 500 µ l de tampão RPE à coluna. Microcentrifuga por 2 min em ≥12, 000 x g.</li>
	<li>Cuidadosamente remova a coluna e colocar em um novo tubo de coleta de 2 mL. Microcentrifuge a toda a velocidade para 1 min (para secar completamente a membrana).</li>
	<li>Descartar o tubo de coleta e colocar a coluna em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Adicione 30 µ l de água livre de RNase para a membrana da coluna.</li>
	<li>Eluir o RNA da coluna por microcentrifuging por 1 min em ≥12, 000 x g. Quando carregar as colunas para a microcentrifuga, certifique-se que as tampas do tubo da coleção estão enfrentando na direção centrífuga gira, para evitar que as tampas de romper.</li>
	<li>Adicione outro 30 μL de água livre de RNase para a membrana da coluna, mantendo a coluna no mesmo tubo microcentrifuga.</li>
	<li>Microcentrifuga por 1 min em ≥12, 000 x g, para que o volume final de eluato é 60 µ l.</li>
	<li>Armazene cada tubo de 1,5 mL contendo 60 µ l de RNA em congelador a-80 ° C.</li>
</ol>3. determinar a qualidade e a concentração de RNA
<ol><li>Medir a concentração de RNA e DNA em cada amostra de RNA, usando um dados, (b) DNA e RNA-específico fluorescente corantes e tubos de ensaio (c), conforme listado na Tabela de materiais. Siga as instruções dos dados e os corantes.</li>
	<li>Alternativamente, medir a concentração de ácido nucleico com um espectrofotômetro UV a 260 nm. Nota: Uma leitura de260 A do 1.0 é equivalente a ~ 40 µ g/mL, single-stranded do RNA.</li>
	<li>Testar a qualidade do RNA executando o RNA em um analisador de ácido nucleico comercial (veja a Tabela de materiais) ou em um padrão de formaldeído/agarose gel 26.</li>
</ol>4. RNA-seq análise
<ol><li>Partir do estoque de RNA total, compõem 21 µ l de 100 ng / µ l do RNA em água livre de RNase. Use 1 µ l deste 21 µ l para testar a concentração de RNA como acima. Enviar o restantes 20 µ l (2 µ g) RNA total para um centro de sequenciamento externo para enriquecimento do mRNA, preparação de biblioteca vertente específica (com oito ou mais códigos de barras para multiplexação) e sequenciamento (veja a Tabela de materiais). Alternativamente, localmente realizar o enriquecimento de mRNA e preparação de biblioteca e então apresentar a biblioteca para sequenciamento.</li>
	<li>Pool de oito ou mais amostras multiplexadas e sequência em uma pista de um sequenciador de última geração.</li>
	<li>Baixe o arquivo FASTQ que contém todas as leituras de sequência e lê o índice correspondente. Também, baixe o arquivo de texto contendo os códigos de barras multiplex. Nota: O índice lê pode estar presente em um arquivo separado de FASTQ. Coloque todos esses arquivos em um diretório.</li>
	<li>Coloque o script fornecido aqui, "fastq_pipeline.sh", no mesmo diretório. Edite este script conforme apropriado para a experiência e os diretórios do computador. Nota: este script contém anotações extensas explicando os passos. Em breve, a qualidade de roteiro apara o lê, o lê é mapeado para o genoma e gera um arquivo delimitado por tabulação que contém o número de leituras por gene para cada amostra.</li>
	<li>Deposite os arquivos FASTQ e dados de contagem de leitura crua na expressão do Gene Omnibus do NCBI antes publicação 27. Siga as instruções para "Submeter dados de sequência de alto rendimento para GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.</li>
	<li>Importar os dados de contagem de leitura para o ambiente de estatística R e realizar análise estatística, utilizando o script de R fornecido aqui, "time_course_script. R". Edite este script conforme apropriado para a experiência e os diretórios do computador. Nota: Este script contém anotações extensas explicando os passos. Em breve, este script importa os dados de leitura, normaliza o lê, identifica genes que mudam significativamente durante o curso do tempo, realiza análise PCA e gráficos a expressão dos genes selecionados.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensing,+homeostasis,+and+disease.">Oxygen sensing, homeostasis, and disease.</a> New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).</li><li>Butler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+gene+expression+in+eukaryotic+microbes.">Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes.</a> Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).</li><li>Ratcliffe, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+sensing+and+hypoxia+signalling+pathways+in+animals:+the+implications+of+physiology+for+cancer.">Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer.</a> J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).</li><li>Rosenfeld, E., Beauvoit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+non-respiratory+pathways+in+the+utilization+of+molecular+oxygen+bySaccharomyces+cerevisiae.">Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).</li><li>Ter Linde, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+transcriptional+analysis+of+aerobic+and+anaerobic+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).</li><li>Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microarray-assisted+screen+for+potential+Hap1+and+Rox1+target+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).</li><li>Kwast, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analyses+of+anaerobically+induced+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae:+functional+roles+of+Rox1+and+other+factors+in+mediating+the+anoxic+response.">Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response.</a> J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).</li><li>Becerra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+yeast+transcriptome+in+aerobic+and+hypoxic+conditions:+effects+of+hap1,+rox1,+rox3+and+srb10+deletions.">The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions.</a> Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).</li><li>Lai, L. -. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamical+remodeling+of+the+transcriptome+during+short-term+anaerobiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae:+differential+response+and+role+of+Msn2+and/or+Msn4+and+other+factors+in+galactose+and+glucose+media.">Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).</li><li>Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic-State-Dependent+Remodeling+of+the+Transcriptome+in+Response+to+Anoxia+and+Subsequent+Reoxygenation+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).</li><li>Hickman, M. J., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+levels+switch+the+function+of+Hap1+of+Saccharomyces+cerevisiae+between+transcriptional+activator+and+transcriptional+repressor.">Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).</li><li>Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase+mediates+a+hypoxic+response+in+Saccharomyces+cerevisiae.">The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).</li><li>Bendjilali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Course+Analysis+of+Gene+Expression+During+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hypoxic+Response.">Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response.</a> G3. 7 (1), 221-231 (2017).</li><li>Chellappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+membrane+proteins,+Spt23p+and+Mga2p,+play+distinct+roles+in+the+activation+of+Saccharomyces+cerevisiae+OLE1+gene+expression.+Fatty+acid-mediated+regulation+of+Mga2p+activity+is+independent+of+its+proteolytic+processing+into+a+soluble+transcription+activator.">The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator.</a> J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).</li><li>Abramova, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+mechanisms+controlling+expression+of+the+DAN/TIR+mannoprotein+genes+during+anaerobic+remodeling+of+the+cell+wall+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).</li><li>Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SREBP+Pathway+Responds+to+Sterols+and+Functions+as+an+Oxygen+Sensor+in+Fission+Yeast.">SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast.</a> Cell. 120 (6), 831-842 (2005).</li><li>Gaisne, M., B&#233;cam, A. M., Verdi&#232;re, J., Herbert, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+&amp;#34;natural&amp;#34;+mutation+in+Saccharomyces+cerevisiae+strains+derived+from+S288c+affects+the+complex+regulatory+gene+HAP1+(CYP1).">A &amp;#34;natural&amp;#34; mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1).</a> Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data.">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis.">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat2:+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions,+deletions+and+gene+fusions.">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).</li><li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTSeq--A+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data.">HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).</li><li>. R: A Language and Environment for Statistical Computing Available from: <a target="_blank" href="https://www.R-project.org">https://www.R-project.org</a> (2015)</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Brown, T., Mackey, K., Du, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RNA+by+Northern+and+Slot+Blot+Hybridization.">Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).</li><li>Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).</li><li>Cherry, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+Genome+Database:+the+genomics+resource+of+budding+yeast.">Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast.</a> Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).</li><li>Hothorn, T., Everitt, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Handbook of Statistical Analyses using R. , (2014).</li><li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data.">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).</li><li>Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cluster+analysis+and+display+of+genome-wide+expression+patterns.">Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).</li><li>Davies, B. S. J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Role+for+Sterol+Levels+in+Oxygen+Sensing+in+Saccharomyces+cerevisiae.">A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).</li><li>Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+Recombination+is+Activated+at+Early+Time+Points+Following+Exposure+to+Cobalt+Chloride+Induced+Hypoxic+Conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).</li><li>Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+Snf7p+and+Rim101p+in+the+transcriptional+regulation+of+TIR1+and+other+anaerobically+upregulated+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).</li><li>Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Chromatin+and+Transcriptional+Landscape+of+Native+Saccharomyces+cerevisiae+Telomeres+and+Subtelomeric+Domains.">The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains.</a> Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).</li><li>Collart, M. A., Oliviero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+yeast+RNA.">Preparation of yeast RNA.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).</li><li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+FASTQ+data+with+Galaxy.">Manipulation of FASTQ data with Galaxy.</a> Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).</li><li>Martini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=timeClip:+pathway+analysis+for+time+course+data+without+replicates.">timeClip: pathway analysis for time course data without replicates.</a> BMC Bioinf. 15, (2014).</li><li>Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+series+expression+analyses+using+RNA-seq:+a+statistical+approach.">Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach.</a> BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste estudo, os níveis de RNAm para todos os genes foi medido durante hipóxia em levedura S. cerevisiae. O objetivo foi analisar as mudanças de expressão de gene como global devido ao crescimento em um ambiente controlado de perto-anóxica. Várias medidas foram tomadas para garantir que o método descrito aqui foi cuidadosamente controlada e reprodutível. Primeiro, as células foram expostas a um ambiente hipóxico precisamente definido: 99,999% N2 em mídia rica (YPD). Outros estudos de hipóx...

Muitos organismos respondem a hipoxia, ou O baixo2, alterando a expressão de gene a 1,2,3. Esta resposta ajuda a lidar com a falta de um substrato fundamental para a respiração aeróbia e para diversas reações biossintéticas, mas também com uma mudança de estado redox 4células. Vários estudos de microarray, realizados em S. cerevisiae mostram que os níveis de RNAm de centenas de genes mudam em resposta a hipóxia 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. recentemente, RNA-seq era usado para caracterizar as mudanças de expressão do gene ao longo do tempo durante a hipóxia 13. Aqui, os detalhes experimentais são apresentados e discutidos.
Hipóxia pode ser conseguida de várias maneiras, cada uma produzindo um nível diferente de O2. Aqui, hipóxia foi estabelecida por continuamente fluindo ultra-alta-pureza N2 balões, que reduz a [O2] imediatamente dissolvido com cinética reprodutíveis 10. É possível que há algumas2 moléculas O presentes que contribuem para a expressão de gene e metabolismo, mas este ambiente é considerado muito perto anaeróbica. Na ausência de O2, as células de levedura não heme biossintetize, ergosterol e ácidos graxos insaturados 4,12,14. Assim, estudos anteriores incluíram estes metabólitos quando crescer o fermento sem oxigênio 5,10,15. No entanto, muitas respostas hipóxicos são mediadas por esgotamento destes metabolitos e assim reabastecer os inverte o gene hipóxica expressão respostas 12,16. Para imitar a hipóxia natural, estes metabólitos não foram adicionados aos meios de comunicação. No pouco tempo que as células foram expostas a hipóxia sem a presença desses metabólitos essenciais, não havia nenhum aumento perceptível na morte celular (dados não mostrados) nem uma resposta de estresse prolongado 13.
A resposta também é dependente da cepa e o seu genótipo. Especialmente importantes são os alelos dos reguladores conhecidos do hipóxica respostas 2. O fundo de tensão S288C é altamente desejado para que os resultados podem ser comparados a outros estudos genômicos realizados com esta estirpe. No entanto, o S288C contém um alelo de perda-de-função parcial do HAP1 gene 17, um regulador transcricional crítico para a resposta a hipoxia. Este alelo foi reparado em S288C utilizando uma sua cópia do Σ1278b Coe fundo 11.
Expressão gênica é altamente dependente do ambiente celular. Assim, ao realizar a análise do mRNA de todo o genoma, é importante manter um ambiente de constante ao mesmo tempo variando de outro parâmetro como tempo, estímulo ou genótipo. Para alcançar resultados altamente reprodutíveis, considere estas três práticas para o estudo e todas suas réplicas biológicas ou técnicas. Em primeiro lugar, a mesma experimenter(s) deve realizar o estudo, desde que as práticas técnicas podem variar entre experimentadores. Em segundo lugar, o mesmo lote dos ingredientes deve ser usado nos meios de comunicação de crescimento como cada lote tem uma composição ligeiramente diferente que pode afetar a expressão do gene. Em terceiro lugar, para minimizar os efeitos do ciclo celular, cada ponto de tempo deve consistir de células assíncronas na fase log de média de crescimento (1-2 x 107 células/mL).
Quando caracterizando uma resposta complexa como a expressão de gene resposta à hipoxia, um curso de tempo é vantajoso para determinar a cinética de diversos eventos. Pontos de tempo específico devem ser escolhidos que irá capturar as principais alterações da resposta. Neste estudo, foram observados pontos de tempo entre 0 e 4 h, porque experiências passadas revelaram generalizadas alterações na expressão gênica durante este período 13.
Para medir a expressão gênica global, RNA-seq foi usado 18,19. Este método usa o sequenciamento de última geração para determinar a abundância relativa de transcrição do gene cada. Em comparação com análise de microarray de DNA, RNA-seq apresenta maior sensibilidade (para detectar menos abundantes transcrições), uma maior gama dinâmica (para medir alterações maiores de dobra) e reprodutibilidade superior (para seguir com precisão a expressão gênica ao longo do tempo). Normalmente, o RNA celular mais é RNA ribossomal, que muitos métodos têm sido desenvolvidos para enriquecer específicas do RNA espécie 20. Aqui, grânulos de poli-T foram utilizados para purificar A poli-contendo transcrições de mRNA, embora os diversos comercialmente - disponíveis kits de depleção de rRNA podem também ser eficazes no enriquecimento do mRNA.
Caracterizou-se aqui, a resposta de expressão do gene de S. cerevisiae à hipoxia. As células foram expostas à hipoxia e então amostradas em oito pontos de tempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 e 240 min). Para confirmar a reprodutibilidade e identificar estatisticamente alteradas transcrições, realizaram-se três repetições biológicas. RNA foi extraído por ruptura mecânica e purificação da coluna e processado para análise de RNA-seq. Pós-sequenciamento pipeline é descrito e scripts de programação são fornecidos que permitem a replicação exata das análises realizadas. Especificamente, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, o ambiente estatístico R 24e o pacote de DESeq2 25 foram usados para processar os dados de RNA-seq e identificar 607 genes que mudam significativamente durante hipóxia. Análise de componentes principais (PCA) e expressão gênica das repetições indicaram a reprodutibilidade da técnica. Clustering e heatmaps revelou cinética de expressão abrangente, enquanto a análise do gene ontology (GO) mostrou que muitos processos celulares, como a respiração aeróbia, são enriquecidos no conjunto de genes regulados de oxigênio.

<table><tbody><tr><td>Enclosed dry incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4000</td><td>Set at 30 &amp;deg;C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.</td></tr><tr><td>Micro-analysis Filter Holder</td><td>Millipore</td><td>XX1002530</td><td>25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask</td></tr><tr><td>Strong vacuum</td><td>Edwards</td><td>E-LAB 2</td><td>The &amp;ldquo;house&amp;rdquo; vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.</td></tr><tr><td>1,000 mL flask</td><td></td><td></td><td>To act as vacuum trap.</td></tr><tr><td>~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in</td><td>Tygon</td><td>38TT</td><td>Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.</td></tr><tr><td>High-pressure N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td></td><td></td><td>99.999% purity, &gt;1,000 psi, with a regulator and gas flow controller</td></tr><tr><td>Autoclaved 500 mL flask</td><td></td><td></td><td>Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.</td></tr><tr><td>Autoclaved 250 mL flasks</td><td></td><td></td><td>Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.</td></tr><tr><td>Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter)</td><td></td><td></td><td>Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.</td></tr><tr><td>Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm</td><td></td><td></td><td>Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.</td></tr><tr><td>~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.</td></tr><tr><td>Sterile filter discs</td><td>Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>25 mm diameter, 0.45 &amp;micro;m pore size, one for each time point</td></tr><tr><td>Sterile dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (~100 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL cuvettes</td><td></td><td></td><td>For measuring OD600 (i.e., cell concentration)</td></tr><tr><td>50 mL sterile centrifuge tubes</td><td></td><td></td><td>One for each time point</td></tr><tr><td>Clean and sterile tweezers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>For freezing cells</td></tr><tr><td>acid-washed beads</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>Keep at 4 &amp;deg;C for lysing cells</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>For RNA column purification</td></tr><tr><td>Qiagen RLT buffer</td><td></td><td></td><td>Prepare by adding 10 &amp;micro;L of &amp;beta;-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>2 mL collection tubes</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RW1</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>DNase I stock and working solutions</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 &amp;micro;L of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 &amp;deg;C) in single-use aliquots (80 &amp;micro;L each). The stock solution should not be thawed and refrozen.</td></tr><tr><td>Buffer RDD</td><td>Qiagen</td><td></td><td>included in the Qiagen DNase Kit</td></tr><tr><td>Ice cold 2 mL screw-cap tubes</td><td></td><td></td><td>For lysing cells during RNA extraction</td></tr><tr><td>bead mill homogenizer</td><td>Biospec Mini-Beadbeater-24</td><td>112011</td><td>Keep in cold room</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>DF0118</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>BD</td><td>DF0886</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>for liquid YPD media</td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32856</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32853</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Quant-iTTM RNA Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32855</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>for measuring nucleic acid concentration</td></tr><tr><td>Commercial electrophoresis system</td><td>Agilent</td><td>Bioanalyzer 2100</td><td>for measuring nucleic acid quality</td></tr><tr><td>Next-generation sequencer</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500</td><td>for sequencing libraries</td></tr><tr><td>automated liquid handling system</td><td>Wafergen</td><td>Apollo 324</td><td>for creating sequencing libraries</td></tr><tr><td>PrepX PolyA mRNA Isolation Kit</td><td>Wafergen</td><td>400047</td><td>for isolating mRNA from total RNA</td></tr><tr><td>PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit</td><td>Wafergen</td><td>400039</td><td>for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA</td></tr><tr><td>Barcode Splitter</td><td></td><td></td><td>https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&amp;amp;changeset_revision=e7b7cdc1834d</td></tr><tr><td>Samtools, which includes the gzip command</td><td></td><td></td><td>http://www.htslib.org/download/</td></tr><tr><td>Trimmomatic</td><td></td><td></td><td>http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Bowtie2 (installed before TopHat)</td><td></td><td></td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td></tr><tr><td>TopHat</td><td></td><td></td><td>https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml</td></tr><tr><td>HTSeq</td><td></td><td></td><td>http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html</td></tr><tr><td>R (installed before R Studio)</td><td></td><td></td><td>https://cran.rstudio.com</td></tr><tr><td>R Studio (free version)</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr></tbody></table>

measuring mrna levels over time during the yeast s. cerevisiae hypoxic response

Complexas mudanças na expressão gênica tipicamente mediam uma grande parcela de uma resposta celular. Cada gene pode alterar a expressão com cinética original como o gene é regulamentado pelo sincronismo particular de um dos muitos estímulos, sinalização de percursos ou efeitos secundários. A fim de capturar o gene todo resposta de expressão à hipoxia em levedura S. cerevisiae, análise de RNA-seq foi usada para monitorizar os níveis de mRNA de genes todos em horários específicos, após a exposição à hipoxia. Hipóxia foi estabelecida pelo crescimento de células de gás de2 ~ 100% N. Importante, ao contrário de outros estudos hipóxicos, ergosterol e ácidos graxos insaturados não foram adicionados para a mídia porque estes metabólitos afetam a expressão genética. Pontos de tempo foram escolhidos na faixa de 0 - 4 h após hipoxia porque esse período captura as grandes mudanças na expressão gênica. Em cada ponto de tempo, mid log hipóxicos células foram rapidamente filtrada e congelado, limitar a exposição ao2 e concomitante as mudanças na expressão gênica. O RNA total foi extraído de células e usado para enriquecer para mRNA, que depois foi convertido em cDNA. A partir deste cDNA, multiplex bibliotecas foram criadas e oito ou mais amostras foram sequenciadas em uma pista de um sequenciador de última geração. Um pipeline pós-sequenciamento é descrito, que inclui o aparamento de base de qualidade, ler o mapeamento e determinar o número de leituras por gene. DESeq2 dentro do ambiente de estatística R foi usado para identificar genes que alteram significativamente em qualquer um dos pontos de tempo hipóxica. A análise de três réplicas biológicas revelou grande reprodutibilidade, genes da cinética diferente e um grande número de esperado O2-regulado genes. Esses métodos podem ser usados para estudar como as células de vários organismos respondem à hipoxia ao longo do tempo e adaptados para estudar a expressão gênica durante outras respostas celulares.

O curso de tempo de hipóxia e RNA-seq análise foram realizadas independentemente de três vezes. Para examinar a reprodutibilidade de as três repetições, dados da expressão do gene para todos os genes foi analisados usando análise de componente Principal (PCA). A Figura 2 mostra como as amostras mudam durante os dois primeiros componentes principais, que juntos representam 58,9% da variabilidade. Esta análise indicou que cada curso do tempo exibe alte...

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Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Aqui, apresentamos um protocolo utilizando RNA-seq para monitorar os níveis do mRNA ao longo do tempo durante a hipoxia resposta das células de S. cerevisiae . Esse método pode ser adaptado para analisar a expressão gênica durante qualquer resposta celular.

Medição de níveis de mRNA ao longo do tempo durante a levedura s. cerevisiae hipóxica resposta

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

measuring-mrna-levels-over-time-during-yeast-s-cerevisiae-hypoxic

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

8.2K visualizações.  Rowan School of Osteopathic Medicine. Aqui, apresentamos um protocolo utilizando RNA-seq para monitorar os níveis do mRNA ao longo do tempo durante a hipoxia resposta das células de S. cerevisiae . Esse método pode ser adaptado para analisar a expressão gênica durante qualquer resposta celular.

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Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Bioquímica

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Genética

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A mitochondrial genome of baker&#8217;s yeast encodes eight proteins: three subunits of the cytochrome c oxidase (Cox1p, Cox2p, and Cox3p), three subunits of the ATP synthase (Atp6p, Atp8p, and Atp9p), a subunit of the ubiquinol-cytochrome c oxidoreductase enzyme, cytochrome b (Cytb), and mitochondrial ribosomal protein Var1p. The purpose of the method described here is to specifically label these proteins with 35S methionine, separate them by electrophoresis and visualize the signals as discrete bands on the screen. The procedure involves several steps. First, yeast cells are cultured in a galactose-containing medium until they reach the late logarithmic growth stage. Next, cycloheximide treatment blocks cytoplasmic translation and allows 35S methionine incorporation only in mitochondrial translation products. Then, all proteins are extracted from yeast cells and separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Finally, the gel is dried and incubated with the storage phosphor screen. The screen is scanned on a phosphorimager revealing the bands. The method can be applied to compare the biosynthesis rate of a single polypeptide in the mitochondria of a mutant yeast strain versus the wild type, which is useful for studying mitochondrial gene expression defects. This protocol gives valuable information about the translation rate of all yeast mitochondrial mRNAs. However, it requires several controls and additional experiments to make proper conclusions.

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Baker&#8217;s yeast mitochondrial genome encodes eight polypeptides. The goal of the current protocol is to label all of them and subsequently visualize them as separate bands.

Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

In Vivo Monitoring of Transcriptional Activity During Metabolic Transition Using a Bioluminescent Reporter in Yeast

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is particularly relevant for survival in fluctuating environments such as those found in beer fermentation. However, sugar transitions are an environmental variable that is challenging to predict and detect, impacting the outcome of beer fermentations. This protocol describes an in vivo system to monitor transcriptional activation associated with the glucose-to-maltose metabolic shift in Saccharomyces eubayanus that applies to different wild Saccharomyces yeast strains. 
The system employs an episomal bioluminescent transcriptional reporter for maltose metabolism, focusing on MAL32, since it provides a good readout for metabolic shifts, as studied in S. cerevisiae. For this, yeast strains were transformed with plasmids containing the MAL32 regulatory region from S. eubayanus, controlling the expression of a gene encoding for a destabilized version of firefly luciferase1, and a hygromycin resistance gene used exclusively during transformation to ensure plasmid acquisition. Following selection, transformed yeast cells can be cultured under non-selective conditions, as the episomal plasmid remains stable in culture conditions for up to 7 days. 
This system was validated under a complex sugar environment in microfermentation assays, confirming the effectiveness of the luciferase reporter in informing metabolic transitions. Samples were collected regularly and analyzed with a luminometer, providing continuous insights into yeast responses. While broadly applicable, this protocol is particularly valuable for assessing yeast performance under fermentation conditions, where metabolic changes pose a significant challenge. Additionally, this methodology can be adapted by selecting alternative promoters to explore a broader range of responses to environmental changes, allowing characterization as well as optimization of wild yeast strains for diverse industrial applications.

This protocol employs a bioluminescent reporter, allowing measurements of transcriptional activity in Saccharomyces eubayanus to monitor the glucose-to-maltose transition, enabling real-time analysis of metabolic adaptations and supporting strain optimization for industrial fermentation under diverse conditions.

In vivo Monitoramento da atividade transcricional durante a transição metabólica usando um repórter bioluminescente em levedura

Sequential sugar consumption, from a preferred sugar source to a less preferred one, represents a critical metabolic adaptation in yeast, which is ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Biologia

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Acquiring Fluorescence Time-lapse Movies of Budding Yeast and Analyzing Single-cell Dynamics using GRAFTS

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies depicting the temporal dependence of gene expression provide insight into the dynamics of its regulation; however, there are many technical challenges to obtaining and analyzing fluorescence movies of single cells. We describe here a simple protocol using a commercially available microfluidic culture device to generate such data, and a MATLAB-based, graphical user interface (GUI) -based software package to quantify the fluorescence images. The software segments and tracks cells, enables the user to visually curate errors in the data, and automatically assigns lineage and division times. The GUI further analyzes the time series to produce whole cell traces as well as their first and second time derivatives. While the software was designed for S. cerevisiae, its modularity and versatility should allow it to serve as a platform for studying other cell types with few modifications.

We present a simple protocol to obtain fluorescence microscopy movies of growing yeast cells, and a GUI-based software package to extract single-cell time series data. The analysis includes automated lineage and division time assignment integrated with visual inspection and manual curation of tracked data.

Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos

Fluorescence time-lapse microscopy has become a powerful tool in the study of many biological processes at the single-cell level. In particular, movies ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

Medição do mRNA Decay Preços em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Usando<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Medição de níveis de mRNA ao longo do tempo durante a levedura s. cerevisiae hipóxica resposta

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

Saccharomyces cerevisiae Metabólica de rotulagem com 4-thiouracil e a quantificação dos recém sintetizado mRNA como um Proxy para a RNA polimerase II atividade

Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

In vivo Monitoramento da atividade transcricional durante a transição metabólica usando um repórter bioluminescente em levedura

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência

Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos

A quantificação temporal da expressão MAPK induzida em células de levedura Solteiro

Medição do mRNA Decay Preços em

ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento