O objetivo deste procedimento é orientar a produção, cristalização e determinação estrutural do IKK1-alfa humano, a fim de compreender a base mecanicista de sua função de sinalização e estabelecer plataformas para o design racional de drogas. Esse método deve ajudar os pesquisadores a determinar a estrutura do IKK1, que forneceria respostas às principais consultas no campo da sinalização imunológica. Esta técnica descreve um caminho simplificado para a obtenção de cristais de proteínas IKK, que são bastante refratários à cristalização e para fornecer várias informações críticas na superação de gargalos na determinação das estruturas.
Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão, porque gerar quantidades miligramas de proteína solúvel e bem comportada requer sua expressão em células de insetos, e a cristalização pode ser feita sob apenas uma janela altamente estreita de condições. O procedimento de substituição molecular utilizado na determinação da estrutura do IKK1 também pode ser muito complicado, especialmente devido à má propriedade de deflexão dos cristais, não no local da unidade assimétrica contendo muitas moléculas IKK1 na ausência de modelos de busca adequados. Demonstrando os procedimentos serão Kyle Shumate e Sonjiala Hotchkiss, estudantes do meu laboratório.
No primeiro dia, as células de placa Sf9 em dois mililitros de sf903 meio de células de insetos, em cada poço de uma placa de seis poços e incubam a 27 graus Celsius. Passe as células quando atingem uma densidade de duas a três vezes 10 para as seis células por mililitro em suspensão, diluindo-as para mídia fresca, a uma densidade de aproximadamente seis vezes 10 a cinco. No segundo dia, diluem oito microliters de reagente de transfecção Sf9 em 100 microliters de SF-903 ou Grace's Insect Medium.
Em seguida, vórtice a mistura brevemente. Em um tubo separado, dilui um micrograma de bacmídeo recombinante purificado em 100 microliters do mesmo meio. Combine o DNA diluído e o reagente de transfecção.
Depois de incubar em temperatura ambiente por 15 a 30 minutos, retire o meio do poço. Em seguida, adicione um mililitro de meio fresco. Em seguida, adicione a mistura de reagente de transfecção de DNA diluído nas células, ajustando o tamanho da gota de tal forma que não desaloja células aderentes.
Depois de seis horas, adicione 1,5 mililitros de meio fresco em cima das células. Incubar as células a 27 graus Celsius, verificando os poços periodicamente a cada 12 horas para sinais de infecção viral. No quinto dia, remova o meio contendo células, 60 a 72 horas após a infecção.
Depois de transferir o meio para tubos, centrífuga por cinco minutos a 500 vezes g e quatro graus Celsius. Quando terminar, salve o supernaspe, que é a pilha de vírus P1. No primeiro dia, resuspende a cápsula de célula His-IKK1 previamente preparada em 40 mililitros de tampão de lise.
Coloque a suspensão celular no gelo elise as células por sônica em ciclos de 60% a 70% de serviço e de cinco a 10 pulsos de duração de 30 segundos em um intervalo superior a um minuto. Esclareça o lise por centrifugação maior ou igual a 28.000 g por 45 minutos a quatro graus Celsius. Depois de preparar uma resina Nickel-NTA Agarose, de acordo com o protocolo de texto, elute a proteína alfa IKK1 marcada sob fluxo gravitacional usando 20 mililitros de tampão de elução.
Colete de uma a 1,5 mililitro frações. Depois de combinar as frações que contêm a proteína, digerir a amostra com protease TEV durante a noite a quatro graus Celsius. Na manhã do segundo dia, incubar a proteína com um milimolar de ATP, na presença de cloreto de magnésio, beta-glicerofosfato, flúor de sódio e ortovanadato de sódio por uma hora a 27 graus Celsius.
Após a incubação, filtre a solução proteica através de um filtro de 0,45 mícnico. Em seguida, carregue aproximadamente seis mililitros da amostra em uma coluna de exclusão de tamanho preparatória de 120 mililitros, anexada a um sistema automatizado de cromatografia líquida. Após o equilíbrio, execute a cromatografia de exclusão de tamanho a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto e colete frações de dois mililitros.
Durante a corrida, monitore a elução em 280 e 254 nanômetros. Depois de puxar as frações puras, concentre-se em um concentrador centrífuga de corte de peso molecular de 30 quilos, seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, dispense alíquotas de 25 microliter da proteína concentrada e congele em nitrogênio líquido.
Usando um robô, pipeta de 80 a 100 microlitres de um reagente de cristalização no reservatório de uma placa de 96 poços. Utilizando um robô de cristalização, dispense e misture 0,2 a 0,25 microliters de IKK1 e seu complexo inibidor com o mesmo volume de solução do reservatório. Imediatamente após a configuração das gotas, sele cada placa com pelísagens opticamente claras para evitar a evaporação.
Incubar uma placa a 18 graus Celsius e a outra placa a quatro graus Celsius em uma sala fria. Use um microscópio estéreo com um polarizador para verificar a aparência de cristal em cada gota, todos os dias, durante os primeiros sete dias e depois em intervalos mais longos. Depois de preparar o IKK1 e seu complexo inibidor como descrito anteriormente, transfira as soluções do poço para cada poço de uma placa de 24 poços.
Coloque de um a 1,5 microliters de solução de poço em uma mancha de vidro limpa. Adicione um volume igual de IKK1 e seu complexo inibidor ao deslizamento de tampas de vidro e misture suavemente por pipetação para cima e para baixo três a quatro vezes. Depois de aplicar graxa nos anéis de cada poço da placa, gire a tampa de vidro e coloque no poço respectivo com fórceps.
Em seguida, sele o poço pressionando para baixo na tampa de vidro. Depois de configurar todas as gotas na placa de 24 poços, incubar na sala fria, no escuro. Ocasionalmente verifique as gotas sob um microscópio para aparência e crescimento de cristais.
Uma vez que o crescimento do cristal esteja completo, remova suavemente a tampa de vidro contendo o cristal e coloque-o sobre uma superfície sólida com a gota de cristal voltada para cima. Adicione suavemente 10 microliters de crio uma solução em cima da gota e misture suavemente por pipetação para que o cristal não seja tocado. Usando um microscópio, remova lentamente um pouco de líquido do cristal e mantenha cerca de cinco a oito microlitros da solução.
Adicione suavemente 2,5 a quatro microliters de solução crio-B na gota e misture suavemente por pipetação. Cubra a tampa de vidro com uma pequena placa de Petrie para evitar o fluxo de ar direto sobre o cristal. Depois de esperar cinco minutos, escolha cuidadosamente um único cristal da queda em um crioloop apropriado montado em uma base adequada.
Congele o cristal em nitrogênio líquido. Em seguida, armazene o cristal contendo crioloop em um disco imerso em nitrogênio líquido em um frasco de Dewar até estar pronto para difração de raios-X no síncrotron. Após extensos ensaios com várias variantes diferentes do IKK1, os cristais foram obtidos com uma construção truncada, que exibia propriedades adequadas de raios-X apenas na presença do inibidor IKK XII.
O efeito combinado de dados de raios-X de baixa resolução com intensidades fracas, um grande número de moléculas IKK1 na unidade assimétrica e variação conformacional do modelo monomérico-dimérico IKK1, em comparação com os modelos conhecidos IKK2, dificultou a obtenção de uma solução de substituição molecular, IKK1, e determinar sua estrutura. Diferentes estruturas IKK2 indicaram diferentes orientações inter-monômeros dentro de seus dimers de modo que a distância entre os carbonos alfa de P578 nos dois domínios de quinase, em quatro modelos diferentes dimer, variou entre 39 e 61 angstroms. A obtenção de um modelo de pesquisa útil foi possível devido ao mapa de microscopia crioelétron de baixa resolução e a um modelo de alta precisão dos domínios IKK1 que poderia ser gerado com base em uma estrutura IKK2 de alta resolução.
O modelo inicial indicava uma orientação do domínio quinase girada 24 graus em relação ao de um monômero IKK2 e uma abertura n-terminal de 58 angstroms. Usando um dos dimers com a abertura de 52 angstrom como modelo, seis centavos na unidade assimétrica foram localizados. Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em alguns meses, se for executada corretamente.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a obtenção de uma proteína solúvel, ativa e bem comportada é o primeiro passo crítico. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão geral de todos os passos que precisam ser seguidos em detalhes minuciosos, para ter sucesso em cristalizar e determinar a estrutura da proteína IKK1. Aprendendo este procedimento, ainda há estruturas de outras proteínas familiares IKK que também podem ser determinadas a fim de responder a perguntas adicionais sobre a sinalização quinase-mitogen.
