Name: treatment of ligament constructs with exercise-conditioned serum: a translational tissue engineering model
Uploaded: 2017-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do CRSNG (DWDW), uma Bolsa de Fundação ARCS (AL) e uma UC Davis College of Biological Sciences grant (KB).

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O presente manuscrito descreve um modelo de tecido ligamento que é uma plataforma experimental útil para pesquisadores com um amplo espectro de tópicos de pesquisa, do desenvolvimento de tecidos a questões de tradução / clínica. O modelo de ligamento manipulado descrito aqui é baseado em um protocolo versátil que pode ser adaptado em vários pontos ao longo do fluxo de trabalho ( Figura 1 e Seção de Discussão ). Além disso, a natureza inerentemente reducionista do ambiente in vitro pode ser aproximada do domínio fisiológico, completando meios de alimentação com soro humano ou animal condicionado. As construções podem ser formadas usando fibroblastos de várias fontes Embora a metodologia e os resultados representativos aqui apresentados sejam baseados no uso de fibroblastos primários de ACL, o protocolo de isolamento celular pode ser ajustado para a coleta de outros tipos de fibroblastos primários. Como descritoNa Figura 4 , os ligamentos manipulados formados com células primárias isoladas de jovens doadores humanos mostram baixa variabilidade do doador. As células primárias são limitadas pelo isolamento inicial e restrição de passagem; O uso de linhas celulares pode melhorar a reprodutibilidade de experiências. O uso de outros tipos de células pode exigir modificações nos meios de cultura celular e na formulação de gel de fibrina. Por exemplo, observamos que as células estaminais mesenquimais humanas (MSCs) não conseguem formar tecidos lineares entre as âncoras de cimento de brushite ao longo de 2 semanas, enquanto os fibroblastos tendinosos flexores digitais superiores equinos, células eróticas da medula óssea eqüina, fibroblastos do tendão embrionário de pinto , E os MSC C3H10T1 / 2 murinos rapidamente se contraem e digerem o gel de fibrina para formar um tecido linear (observações não publicadas). Esse contraste pode ser uma conseqüência das diferenças na contratilidade celular, na proliferação e na produção de enzimas fibrinolíticas. Aplicação de produtos químicosE estimulação mecânica No método aqui descrito, o tecido à base de fibrina se forma em torno de âncoras de cimento de escoveteria, permitindo a aplicação de estimulação mecânica através de um biorreator de alongamento 11 , bem como para testes de tração no ponto final. A presença de interface de cimento e tecido mole de brushite (entesis) também apresenta uma oportunidade para maior investigação e melhoria 22 , 26 (ver seção de aplicações clínicas abaixo). Neste ambiente in vitro , a contribuição de fatores químicos e mecânicos pode ser mais prontamente identificada; Um exemplo disso é mostrado na Figura 5 , pelo qual o efeito do ambiente sérico pós-exercício foi separado dos estímulos mecânicos do exercício. Estudos-piloto podem ser necessários para determinar o prazo das intervenções experimentais, a composição dos tratamentos e os pontos finais apropriados para esperar uma mudança observável. FoPor exemplo, no estudo soro pós-exercício 1 , o comprimento do tratamento experimental foi restringido pelo suprimento de soro usado para suplementar a mídia, a partir da qual as construções foram alimentadas a cada dois dias. Além disso, durante a segunda semana de cultura, o meio de cultura foi suplementado com soro de repouso ou pós-exercício com ácido ascórbico e L-prolina mantida enquanto o TGF-β1 foi removido. TGF-β1 é um fator de crescimento pró-fibrótico conhecido que aumenta no soro após o exercício 27 . Portanto, para evitar obscurecer os efeitos relacionados ao TGF-β1 do soro pós-exercício, essa citocina não foi mantida nos meios de cultura. Este modelo de ligamento manipulado também pode ser usado para testar o efeito do estiramento mecânico. Ao englobar apertos modelados reversos para segurar as extremidades da âncora do cimento de brushite (semelhante ao testador de tração uniaxial representado na Figura 1 ), os biorreatores de estiramento podem ser projetados para acomodar eng<html> Ligamentos ineficazes. Nosso laboratório já usou este modelo para investigar a resposta de sinalização molecular de ligamentos manipulados ao estiramento de tensão uniaxial em um biorreator customizado 11 que proporcionará uma melhor compreensão para o projeto racional de um paradigma de alongamento in vitro ou mesmo, potencialmente, in vivo Estiramento / atividade / aplicações terapêuticas. Avaliação de ligamentos artificiais Tal como acontece com a cultura monocamada tradicional, as construções 3D podem ser testadas quanto à expressão de genes / proteínas; Além disso, sua morfologia 3D também oferece a oportunidade de avaliar mudanças funcionais e morfológicas e as construções podem ser mantidas em cultura para estudos de longo prazo ( Figura 3 ). Enquanto os ligamentos manipulados não são equivalentes aos ligamentos nativos e maduros, eles têm semelhança com o desenvolvimento de tendões / ligamentos e se comportam de forma semelhante ao tecido nativo em resposta a nutrientes&quot;26, fatores de crescimento 10 , hormônios 25 e exercício 11 , 28. Assim, enquanto o cuidado é garantido antes de fazer amplas generalizações de qualquer modelo in vitro , os resultados do teste de construção do ligamento podem revelar ou informar um mecanismo fisiológico particular que de outra forma poderia ser Impossível investigar in vivo. Suplemento de mídia de alimentação com soro condicionado para um modelo flexível e dinâmico com aplicações amplas O metaboloma do soro humano é um meio de cerca de 4.500 compostos, incluindo, entre outros, glicoproteínas, lipoproteínas, derivados lipídicos, substratos energéticos, metabolitos, vitaminas, enzimas, hormônios, neurotransmissores e uma infinidade de blocos de construção / intermediários. 29 A inspeção adicional do metabolome do soro humano de acordo com as classes compostos 29 revela additiBenefícios da integração de soro experimental em experiências in vitro. Ou seja, a maioria dos ~ 4500 compostos no soro são hidrofóbicos ou derivados de lípidos, sublinhando a importância das proteínas de ligação para transporte / solubilização. Segue-se que a recapitulação experimental da dinâmica do transporte composto endógeno e, portanto, a biodisponibilidade e as interações composto-alvo, seria quase impossível. Assim, o soro experimental é particularmente eficaz para o estudo de compostos que são conhecidos por depender de moléculas acessórias para solubilização, transporte, ligação alvo e mecanismo de ação. Nosso laboratório tem um interesse de longa data nos benefícios para a saúde do exercício. O exercício melhora a função celular e orgânica em uma variedade de tecidos em todo o corpo 12 , um efeito que pode ser atribuído a uma variedade de fatores (por exemplo, IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-like 15 ,Exossos 16 , 17 ) que são liberados para a circulação sistêmica. O meio bioquímico pós-exercício reflete os fatores liberados tanto da contração de hormônios sensíveis ao exercício do músculo esquelético quanto de fatores que são liberados como resultado da estimulação do sistema nervoso simpático das glândulas secretoras ( por exemplo , cortisol e catecolaminas da glândula supra-renal 18 e crescimento Hormônio da hipófise anterior 19 ). Recentemente usamos um modelo de soro pré e pós-exercício para investigar os efeitos do meio bioquímico induzido pelo exercício no tecido de engenharia. 1 Embora permaneçam inúmeras questões de pesquisa importantes relacionadas ao exercício, o modelo não é, de forma alguma, limitado dessa maneira. Por exemplo, o soro pode ser obtido, seja de fontes animais ou humanas, após intervenções dietéticas ou farmacológicas, ou de diferentes faixas etárias ou população clínicaS 30 . Desta forma, os compostos de interesse exógenos ou endógenos estarão presentes no soro e nos meios de tratamento, em quantidades biodisponíveis e interagirão com o tecido alvo em conjunto com o meio endógeno ( ou seja , em um contexto mais fisiológico). Esta abordagem é dinâmica, uma vez que é altamente provável que uma determinada intervenção exerça um efeito multi-órgão (e multi-composto) e, assim, o meio fisiológico será co-modificado. Embora esta abordagem ofereça certos desafios, uma vez que múltiplas variáveis ​​bioquímicas sistêmicas são alteradas simultaneamente, é uma abordagem que pode ajudar a superar as desvantagens da metodologia experimental puramente reducionista 31 , 32 . Em conjunto, a implementação de soro condicionado junto com tecido tecido biomimético in vitro pode ser usado como ferramenta para questões de fisiologia, nutrição e pesquisa clínica. <stronG&gt; Aplicações clínicas são numerosas O modelo de engenharia de tecidos apresentado aqui pode ser usado para investigar questões de pesquisa anatômica e clínica que os modelos in vitro tradicionais não podem. Um ligamento ou tendão in vivo contém uma região de transição de tecido macio para difícil chamada entesis. A entesis, que é vulnerável à lesão mecânica relacionada ao estresse 33 , pode ser estudada em seção transversal através de técnicas histoquímicas e de microscopia eletrônica 22 , 26 . Esta interface única é duplamente importante para aqueles com mobilidade baixa ou restrita, uma vez que a inatividade física prejudica a capacidade do tecido conjuntivo de transferir carga para regiões de baixa a alta conformidade 34 , resultando em uma diminuição geral da conformidade tecidual e aumento do risco de lesões. Nosso laboratório usou recentemente esse modelo de engenharia de tecidos 25 &lt;/ Sup&gt; para modelar outra população, atletas do sexo feminino, que estão em risco de lesões do tecido conjuntivo: a incidência de lesão do LCA é aproximadamente cinco vezes maior do que as suas homólogas masculinas 35 . Os mecanismos potenciais subjacentes a essa disparidade baseada no sexo em lesões foram investigados pelo tratamento de construções de ligamentos com concentrações fisiológicas do hormônio sexual feminino, estrogênio, em concentrações que imitavam estágios do ciclo menstrual. Curiosamente, altas concentrações de estrogênio inibiram a expressão gênica e a atividade da lysl oxidase, a enzima primária responsável pela criação de reticências lisina-lisina na matriz colágena de ligamentos e tendões. Importante, 48 h de alto teor de estrogênio (para simular a fase folicular) diminuíram a rigidez da construção do ligamento sem alterar a densidade de colágeno das construções. Do ponto de vista fisiológico, isso sugere que o aumento do laxismo do ligamento nas fêmeas pode ser devido, pelo menos em parte, a diminuiçãoFormação de cross-link. De uma perspectiva experimental, esses achados 25 destacam a utilidade do modelo de construção 3D, que permitiu a análise da atividade de reticulação funcional. Do ponto de vista clínico, este modelo agora pode ser usado para detectar rapidamente intervenções que podem prevenir os efeitos negativos do estrogênio da função do ligamento. Observações de encerramento Aqui apresentamos uma metodologia detalhada para a formação de ligamentos manipulados e sua utilidade como modelo de tecido 3D in vitro . O modelo é altamente adaptável a uma ampla gama de objetivos, proporcionando flexibilidade no tipo de células, intervenções e medidas de resultado de interesse. A suplementação de meios de alimentação com soro condicionado adiciona um contexto fisiológico que não pode ser alcançado em um ambiente tradicional in vitro , melhorando a modelagem da fisiologia in vivo . Em resumo, acreditamos que este seja um modo amplamente aplicávelCom implicações emocionantes para promover os campos da fisiologia e engenharia de tecidos.

As lesões do tendão e do ligamento são comuns e podem ter consequências debilitantes na mobilidade normal e na qualidade de vida. A intervenção cirúrgica é muitas vezes necessária, mas pode ter um sucesso limitado e variado 4 , 5 . A compreensão atual de como os tendões e os ligamentos se desenvolvem, amadurece e responde às lesões é incompleta e, portanto, são necessários modelos de pesquisa efetivos para fornecer informações sobre o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes 5 . Para resolver esta lacuna de conhecimento, modelos animais podem ser utilizados, mas os estudos in vivo são inerentemente complexos com dificuldade em controlar o meio ambiente e direcionar diretamente as intervenções para o tecido pretendido. Em contraste, o ambiente experimental pode ser facilmente controlado e monitorado in vitro com a cultura de células monocamadas tradicionais. No entanto, esta técnica pode simplificar demais o ambiente químico e mecânico e, portanto, não pode recapituarAtrasar o comportamento in vivo das células. A engenharia de tecido é capaz de se casar com as vantagens do ambiente complexo in vivo em modelos animais com o controle do ambiente in vitro e fornece uma ferramenta adicional para estudar fisiologia. Além disso, armados com uma melhor compreensão do desenvolvimento do ligamento, a engenharia de tecido também pode fornecer uma fonte de tecido de enxerto quando a reconstrução cirúrgica é necessária 6 . Assim, o método aqui descrito valida um tecido de engenharia 3D in vitro que pode ser usado para estudar a função e a morfologia do ligamento. As construções de tendões ou ligamentos à base de fibrina foram utilizadas como modelo in vitro para estudar processos fisiológicos, incluindo fibrilogênese de colágeno 7 e desenvolvimento de tendões 8 , bem como aplicações de tradução em que sua utilidade como tecido de enxerto foi avaliada em um modelo de ovelha de cru anteriorReconstrução do ligamento ciar (ACL) 9 . Nosso laboratório já estabeleceu um modelo de ligamento de engenharia 3D que abrange duas escovas, um material substituto de ossos de fosfato de cálcio, âncoras de cimento. Este modelo pode ser submetido a diferentes condições experimentais com facilidade, simplesmente complementando os meios de cultura com fatores biológicos 10 ou aplicando estimulação mecânica 11 . Importante, esse modelo de ligamento ósseo a osso permite a análise aprofundada da entesis, a interface entre os elementos do ossos e ossos, que é suscetível a lesões. No estudo destacado 1 aqui para apresentar esta metodologia, estávamos interessados ​​no efeito de mudanças induzidas pelo exercício no meio bioquímico sobre a função do ligamento. O exercício melhora a função celular e orgânica em uma variedade de tecidos em todo o corpo 2 , 3 , </suP&gt; 12 , um efeito que pode ser atribuído à liberação de vários conhecidos (por exemplo, IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-like 15 , exossomos 16 , 17 ) e outros fatores bioquímicos desconhecidos liberados para a circulação sistêmica . Além disso, o meio bioquímico pós-exercício é enriquecido com hormônios sensíveis ao exercício, cuja liberação é estimulada pela estimulação do sistema nervoso simpático das glândulas secretoras ( por exemplo , cortisol e catecolaminas da glândula supra-renal 18 e hormônio do crescimento da hipófise anterior 19 ). No entanto, i n vivo , é impossível diferenciar os efeitos do estímulo mecânico do exercício das alterações bioquímicas induzidas pelo exercício. Embora alguns estudos tenham caracterizado o aumento esperado de certos hormônios circulantes e citocinas em resposta a exercíciosComo mencionado acima, existem muitos fatores, conhecidos e desconhecidos, para recapitular fielmente in vitro. Ou seja, isolar alguns fatores para um estudo in vitro aborda inadequadamente a complexidade da resposta bioquímica. Neste estudo, investigamos como as mudanças no meio bioquímico sérico, provocadas pelo exercício, afetam a função do ligamento manipulado. Para isolar os efeitos das alterações bioquímicas, obtivemos soro de participantes humanos antes e depois de um exercício de resistência e usamos o tratamento de ligamentos de engenharia 3D formados usando fibroblastos de ligamento cruzado anterior humano (ACL). Usando este modelo, podemos obter dados funcionais, incluindo efeitos sobre propriedades mecânicas e conteúdo de colágeno, além de quantificar os efeitos na sinalização molecular.

<table><tbody><tr><td>Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20</td><td>Entomoravia</td><td>N/A</td><td>For brushite cement anchors</td></tr><tr><td>&amp;beta;-tricalcium phosphate</td><td>Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK)</td><td>N/A</td><td>For brushite cement anchors</td></tr><tr><td>o-phosphoric acid, 85% (w/w)</td><td>EMD Millipore</td><td>PX0995</td><td>For brushite cement anchors</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275-500g</td><td>For brushite cement anchors</td></tr><tr><td>Falcon 35 mm tissue culture dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772A</td><td>For silicone-coated plates</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer kit</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>For silicone-coated plates</td></tr><tr><td>1x Phosphate-buffered saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td>For cell isolation and expansion</td></tr><tr><td>100x antibiotic/antimycotic solution</td><td>VWR</td><td>45000-616</td><td>For cell isolation</td></tr><tr><td>Type II collagenase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td>For cell isolation</td></tr><tr><td>100x penicillin/streptomycin solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>For cell isolation</td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m pore, polyethersulfone, gamma irradiated</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>For reagent sterilization</td></tr><tr><td>DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine</td><td>VWR</td><td>10-013-CV</td><td>For cell and tissue culture</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>BioSera</td><td>FBS2000</td><td>Component of tissue digestion media and growth media</td></tr><tr><td>Penicillin G Potassium Salt</td><td>MP Biomedicals</td><td>0219453680 - 100 MU</td><td>Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 mm x 20 mm)</td><td>VWR</td><td>82050-598</td><td>For cell culture</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td>For cell isolation</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>For cell freezing media</td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td>For cell freezing</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Red Plastic 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>367820</td><td>For human serum collection</td></tr><tr><td>Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22 G x 1 inch Needle</td><td>Fisher Scientific</td><td>354221</td><td>For human serum collection</td></tr><tr><td>Thrombin, bovine origin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648-1KU</td><td>For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 &amp;mu;m, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Fibrinogen, bovine origin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 &amp;mu;m, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Aprotinin from bovine lung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3428</td><td>For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 &amp;mu;m, aliquot, and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>6-Aminohexanoic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>07260-100g</td><td>For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 &amp;mu;m, aliquot, and store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td>Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 &amp;mu;m and store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>L-proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 &amp;mu;m and store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Transforming growth factor-&amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer&#039;s instructions at a concentration of 10 &amp;mu;g/mL. Aliquot and store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Stericup-GP, 0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m, polyethersulfone, 250&amp;nbsp;mL, radio-sterilized</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>For reagent sterilization</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Dilute in water to 6 M</td></tr><tr><td>4-Dimethylaminobenzaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39070-50g</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Chloramine-T trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402869-100g</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>trans-4-Hydroxy-L-proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H54409-100g</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>1-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>279544-1L</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Perchloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421-250ml</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Acetic acid, glacial</td><td>EMD Millipore</td><td>AX0073-9</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Toluene, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-1L</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr><tr><td>Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-656</td><td>For hydroxyproline assay</td></tr></tbody></table>

treatment of ligament constructs with exercise-conditioned serum: a translational tissue engineering model

As experiências in vitro são essenciais para compreender os mecanismos biológicos; No entanto, o fosso entre a cultura de tecidos monocamada e a fisiologia humana é grande, e a tradução de achados é frequentemente fraca. Assim, há uma ampla oportunidade para abordagens experimentais alternativas. Aqui apresentamos uma abordagem em que células humanas são isoladas de remanescentes de tecido de ligamento cruzado anterior humano, expandidos em cultura e usados ​​para formar ligamentos manipulados. O exercício altera o meio bioquímico no sangue, de modo que a função de muitos tecidos, órgãos e processos corporais é melhorada. Nesta experiência, o meio de cultura de construção do ligamento foi suplementado com soro humano experimental que foi &quot;condicionado&quot; pelo exercício. Assim, a intervenção é mais biologicamente relevante, uma vez que um tecido experimental é exposto ao meio bioquímico endógeno completo, incluindo proteínas de ligação e compostos adjuntos que podem ser alterados em conjunto com a atividade de umAgente desconhecido de interesse. Após o tratamento, os ligamentos manipulados podem ser analisados ​​quanto à função mecânica, teor de colágeno, morfologia e bioquímica celular. No geral, existem quatro vantagens principais em relação à cultura monocapas e modelos animais tradicionais, do modelo fisiológico do tecido ligamentar que é apresentado aqui. Primeiro, as construções do ligamento são tridimensionais, permitindo a quantificação de propriedades mecânicas ( isto é , função), como o esforço de tração final, a carga de tração máxima e o módulo. Em segundo lugar, o enthesis, a interface entre os elementos do osso e dos ossos podem ser examinados em detalhes e dentro do contexto funcional. Em terceiro lugar, a preparação de mídia com soro pós-exercício permite que os efeitos do meio bioquímico induzido pelo exercício, que é responsável pela ampla gama de benefícios para a saúde do exercício, sejam investigados de forma imparcial. Finalmente, este modelo experimental avança a pesquisa científica de forma humana e ética, substituindo o uso deAnimais, um mandato central dos Institutos Nacionais de Saúde, do Centro de Controle de Doenças e da Administração de Alimentos e Medicamentos.

Visão geral da formação de ligamentos manipulados e intervenção experimental A Figura 1 mostra uma visão geral da formação de ligamentos manipulados. Cimento de brushite, um material substituto ósseo 22 é preparado combinando uma solução de ácido ortofosfórico / ácido cítrico com fosfato de β-tricálcio em poços cilíndricos. Alternativamente, se não estiverem medindo diretamente a função mecânica dos tecidos, as suturas de seda 3-0 podem ser usadas como âncoras na formação de um tecido. Estes são fixados a 12 mm de distância em placas de 35 mm revestidos de silicone e esterilizados por imersão em etanol a 70%. Os fibroblastos são isolados dos remanescentes do ligamento cruzado anterior obtidos durante a cirurgia de reconstrução do LCA. Após a expansão, 2,5 x 10 5 células são encapsuladas em um gel de fibrina formado no prato fixado por âncora de cimento de brushite. Após a formação, a construção do ligamentoPodem ser examinadas alterações de propriedades mecânicas, conteúdo de colágeno, proliferação celular, expressão gênica, níveis de proteína e morfologia tecidual. Ao longo da cultura, as células contraem o gel de fibrina e formam um tecido linear entre as duas âncoras ( Figura 2A ). Após 1-2 dias de cultura, as células aderiram ao gel de fibrina, processos de células estendidas e começaram a exercer forças de tração ( Figura 2B ). À medida que o gel de fibrina é contraído por forças de tração e discriminado por enzimas celulares, a tensão é gerada entre os dois pontos de ancoragem e nossas células se alinham paralelamente a este eixo ( Figura 2B ) e começam a depositar colágeno. Após 4-5 dias, as construções se contraíram em torno das âncoras formando um tecido cilíndrico linear ( Figura 2A , neste momento estímulos externos podem ser aplicados ao sistema (intervNeste momento, evita interromper o processo de formação de tecido linear). As intervenções podem consistir em suplementar o meio de cultura com soro humano ou animal após uma dada intervenção, citocinas exógenas e fatores de crescimento, empregando estimulação mecânica ou alterando outros fatores ambientais, como a tensão do oxigênio. Utilizando meio de crescimento (DMEM com 10% de FBS e 100 U / mL de penicilina) suplementado com ácido ascórbico 200 μM, L-prolina 50 μM e TGF-β1 5 ng / mL, determinamos que a proliferação celular continua ao longo de uma cultura de 2 semanas Período ( Figura 2C ) e, de fato, o microscópio de luz revela um tecido denso contendo células altamente alinhadas aos 14 dias de cultura ( Figura 2B ). Avaliação de ligamentos artificiais No final do período de cultura, os ligamentos manipulados podem ser avaliados em uma variedadeDe maneiras. Uma grande vantagem deste sistema é a capacidade de determinar mudanças funcionais no tecido através de testes mecânicos, uma avaliação vital dada a função mecânica do ligamento nativo. O teste de tração uniaxial pode ser utilizado para medir as propriedades mecânicas, incluindo carga a falha, resistência à tração final e módulo de Young. As propriedades viscoelásticas também podem ser medidas com relaxamento do estresse e testes de fluência. A Figura 3A descreve um ligamento manipulado mantido em alças moldadas reversas em um testador de tração uniaxial custom-built. A aderência direita é anexada a um transdutor de força para medir a carga através do ligamento, pois o tecido é forçado a falhar. A Figura 3B mostra um gráfico representativo de tensão-deformação para uma prova de falha. Após serem submetidos a testes mecânicos, as mesmas construções podem ser secas e processadas para um ensaio de hidroxiprolina 23 para avaliar o teor total de colágeno, bem como outros biocheEnsaios mecânicos. Com um número suficiente de amostras adicionais por condição, pode-se realizar um exame completo de uma intervenção experimental, incluindo seus efeitos sobre a proliferação celular, a expressão de genes e proteínas e a morfologia histológica. Enquanto 14 dias é um ponto final típico para nossos estudos, os ligamentos manipulados continuam a melhorar suas propriedades mecânicas e conteúdo de colágeno através de 28 dias de cultura como mostrado na Figura 3C e podem sobreviver por pelo menos 3 meses em cultura 24 . A variabilidade dos dadores é uma consideração importante para a repetibilidade experimental. A Figura 4 mostra um experimento representativo relatado por Lee et al. 25 comparando 7 dadores de ACL diferentes (n = 3 machos e n = 4 fêmeas) demonstrando propriedades típicas de tração e conteúdo de colágeno após uma cultura de 2 semanas descrita anteriormente<html> Meios de crescimento suplementados. Usando células de coleções similares de ACL, idade do doador, tempo após lesão, gênero, etc., os ligamentos manipulados demonstram baixa variabilidade entre dadores e características semelhantes entre doadores do sexo masculino e feminino, com exceção da diferença na fração de colágeno. No estudo acima mencionado, os ligamentos manipulados foram utilizados como um modelo in vitro para investigar por que as mulheres têm um risco significativamente maior de lesão do ACL do que os homens e demonstraram que os fibroblastos de ACL isolados de dadores do sexo feminino não possuem, inerentemente, ligamentos mais fracos e menos colaginosos 25 . O impacto do meio sérico pós-exercício na função do ligamento in vitro Nós já demonstraram a capacidade dos ligamentos manipulados para serem utilizados na sonda de processos fisiológicos 1 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 25. Na experiência representativa a seguir, conforme relatado por West et al. 1 , determinamos os efeitos bioquímicos do exercício sobre a função do ligamento e destacamos a metodologia e os achados aqui. Nós formamos ligamentos manipulados usando células ACL humanas e aplicamos uma intervenção, no dia 7 da cultura, consistindo em meio de cultura condicionado com soro humano coletado pré ou pós-exercício. Resumidamente, recrutamos jovens jovens saudáveis ​​e colecionamos amostras de sangue antes e depois de um ataque agudo de exercícios de resistência que aumenta hormônios circulantes e citocinas, incluindo hormônio de crescimento humano (GH). O soro humano foi isolado de amostras de sangue pré e pós-exercício e utilizado no lugar do soro bovino fetal nos meios de cultura para a segunda semana de cultura de ligamentos manipulados ( Figura 5A ). As amostras de soro pré e pós-exercício foram analisadas utilizando ELISA para alterações na GH e no fator de crescimento semelhante a insulina (IGF-1), aCuja concentração pode ser alterada pelo exercício ( Figura 5B ). Esta informação foi utilizada para correlacionar os efeitos séricos nos ligamentos manipulados com alterações no soro em resposta ao exercício. Após um período de cultura de 14 dias, as construções do ligamento foram avaliadas usando testes mecânicos e determinação de hidroxiprolina do teor de colágeno e demonstraram um aumento significativo na carga máxima de tração e no conteúdo de colágeno em resposta ao soro pós-exercício. Com o objetivo de avaliar se esse efeito estava relacionado a libertações induzidas pelo exercício de GH ou IGF-1, os ligamentos manipulados foram formados em um experimento separado e tratados com uma resposta à dose de GH recombinante humano ou IGF-1. Curiosamente, enquanto a GH sérica aumentou no sangue ( Figura 5B- i), o aumento progressivo da concentração de GH recombinante nos meios de cultura não aumentou o teor de colágeno ( Figura 5D -i) ou mecânicoPropriedades (dados não mostrados) em ligamentos manipulados. Em contraste, os níveis séricos de IGF-1 não aumentaram após o exercício, mas um experimento dose-resposta revelou que os níveis crescentes nos meios de cultura melhoraram o conteúdo de colágeno das construções do ligamento ( Figura 4D -ii). Assim, enquanto o exercício resultou em aumentos robustos no GH pós-exercício, o experimento dose-resposta usando rhGH aumenta a dúvida quanto ao fato de GH ser diretamente responsável pelo aprimoramento fenotípico dos ligamentos manipulados (pelo menos, a isoforma de 22 kDa por si só não Parece ser responsável). Por outro lado, enquanto que o IGF-1 no soro não foi alterado aos 15 minutos após o exercício, o teste de rhIGF-1 em uma ampla gama de concentrações revelou que o IGF-1 é capaz de melhorar o conteúdo de colágeno; No entanto, deve-se notar que o aumento das concentrações de rhIGF-1 através de uma faixa que estimou níveis fisiológicos não aumentou significativamente o teor de colágeno. Assim, o ambiente soro pós-exercício únicoFoi importante para melhorar a mecânica e o colágeno dos ligamentos manipulados. No estudo destacado aqui 1 , o volume de soro experimental foi limitado devido a considerações éticas; Então, os bioensaios 2D de curto prazo, que apresentaram menor demanda de soro, foram utilizados para estimular ainda mais os mecanismos moleculares responsáveis ​​pelo aumento do colágeno que foi observado. Os fibroblastos de ACL foram cultivados em confluência em placas de 6 poços e tratados durante 1 hora com soro de repouso ou pós-exercício e comparados com respostas de dose de GH recombinante, IGF-1, TGF-β1 e a ativação de alvos no PI3K / mTORC1 As vias de sinalização ERK1 / 2 e Smad foram determinadas. Na presença de soro pós-exercício, a via PI3K / mTORC1 e ERK1 / 2 mostrou maior ativação, avaliada por fosforilação de S6K ( Figura 5D -i) e ERK1 / 2 ( Figura 5D -ii), respectivamente.Em comparação com as respostas de dose de hormônio e citoquina, enquanto a GH teve um pequeno efeito positivo na sinalização do mTOR ( Figura 5D- i) e o IGF-1 mostrou um efeito positivo na menor dose, os três tratamentos de GH, IGF-1 e TGF -β1 não representou o aumento na sinalização PI3K / mTORC1 e ERK1 / 2. Em conjunto, nosso modelo de ligamento de engenharia 3D e dados de bioensaio 2D sugerem que o ambiente sérico pós-exercício é capaz de melhorar a função de ligamento e o conteúdo de colágeno manipulados através da ativação das vias PI3K / mTORC1 e ERK1 / 2. Em resumo, usando um modelo de ligamento manipulado combinado com soro condicionado ao exercício físico, conseguimos: i) investigar o efeito do ambiente sérico pós-exercício na função do ligamento manipulado e colágeno, ii) correlacionar as alterações no fenótipo do ligamento com alterações na concentração de hormônio sérico, Com o objetivo de determinar quais mudanças no soro levaram a changEm ligamentos artificiais e iii) além do alcance do trabalho usando bioensaios 2D para sondar alvos moleculares do meio bioquímico sérico para determinar mecanismos moleculares que são ativados pelo soro pós-exercício que levam a melhorias na função do ligamento. <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig1.jpg" /> Figura 1: Visão geral da formação e uso de ligamentos manipulados. As âncoras de cimento Brushite são fabricadas e fixadas em placas revestidas de silicone. Os fibroblastos primários são isolados e expandidos a partir de restos ACL. Os ligamentos de engenharia são formados pela encapsulação de fibroblastos em um gel de fibrina em torno de duas âncoras de cimento de escovado. Os ligamentos de engenharia são cultivados e tratados com os estímulos químicos ou mecânicos específicos ( por exemplo , através de um biorreator) desejados. No ponto final desejado, os ligamentos manipulados podem ser coletados e avaliados para mecânicaL propriedades, expressão gênica, conteúdo de colágeno, expressão protéica e histologia. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55339/55339fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig2.jpg" /> Figura 2. Os fibroblastos do ligamento primário formam um ligamento manipulado ósseo a osso baseado em fibrina que abrange duas âncoras de cimento de escoveteria. ( A ) Ao longo do tempo, os fibroblastos contraem o gel de fibrina em torno das âncoras de cimento de escoveteria formando um tecido linear. ( B ) Nos primeiros três dias, as células se ligam ao gel de fibrina e exercem forças de tração, alinhando as células com o eixo longo da construção. Durante 14 dias, as células formam um tecido altamente alinhado. Barra de escala = 160 μm. ( C ) O conteúdo de DNA dos ligamentos manipulados continua a aumentar oVer 14 dias em cultura à medida que as células proliferam. Os dados são apresentados como média ± DP com n = 3-4 construções por grupo. Grupos. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55339/55339fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig3.jpg" /> Figura 3: As propriedades mecânicas do ligamento manipulado e o conteúdo de colágeno melhoram ao longo do tempo. ( A ) As construções do ligamento são ensaiadas uniaxialmente para determinar o efeito de uma dada intervenção na função do ligamento. Conforme mostrado, dois apertos moldados reversos e 3D imprimem âncoras de forma recíproca que são encapsuladas pelo nervo de engenharia. As âncoras são acopladas a um motor de passo e a um transdutor de força para gerar curvas de tensão / deformação do tecido testado, permitindo que as propriedades mecânicas possam ser determinadas. ( B &lt;/ Strong&gt;) Curva de tensão-deformação representativa de um ligamento de engenharia tenso a falha. Ao longo de 28 dias, ( C ) resistência à tração máxima (UTS), ( D ) carga de tração máxima (MTL), ( E ) Módulo de Young e ( F ) fração de colágeno continuam a melhorar. Os dados são apresentados como média ± DP com n = 5 construções por grupo. * Indica diferença significativa de todos os outros grupos. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55339/55339fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig4.jpg" /> Figura 4: Os ligamentos manipulados podem ser avaliados quanto à funcionalidade e conteúdo bioquímico, apresentando baixa variabilidade do doador. Ligou-se ligamentos foram formados 7 dadores diferentes (n = 3 machos, n = 4 fêmeas). Após 2 semanas o(Cultura), foram avaliadas quanto às diferenças na ( A ) carga de tração máxima, ( B ) resistência à tração máxima (UTS), ( C ) Módulo de Young, ( D ) área de seção transversal (CSA), ( E ) conteúdo total de colágeno por Construir e ( F ) colágeno como uma fração de massa seca. Os dados são apresentados como média ± DP e significância estatística foi com o teste t de Student. * Indica diferença significativa de outros grupos (p &lt;0,05). Figura adaptada de Lee et al. 25 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55339/55339fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55339/55339fig5.jpg" /> Figura 5. Os ligamentos manipulados demonstram mudanças mecânicas e bioquímicas em resposta ao bioloIntervenções gísticas. ( A ) O soro foi isolado de desenhos de sangue coletados de indivíduos pré (RestTx) e pós-exercício (ExTx) e utilizados para tratar ligamentos manipulados durante a segunda semana de cultura. ( B ) (i) hormônio de crescimento humano (GH) e (ii) níveis de fator de crescimento de insulina (IGF) -1 no restante e soro de exercício foram quantificados através de ELISA. ( C ) Os ligamentos de engenharia tratados com ExTx demonstraram (i) conteúdo de colágeno melhorado (i) e (ii) carga de tração máxima. O significado estatístico das comparações em pares (RestTx e ExTx) foi analisado por um teste t com nível de significância definido em p &lt;0,05. ( D ) Uma dose-resposta de (i) GH e (ii) IGF-1 foi usado para determinar possíveis contribuições desses fatores para as mudanças no conteúdo de colágeno devido à ExTx. E) Os bioensaios 2D foram utilizados para comparar os efeitos do aumento das doses de GH, RestTx e ExTx em alvos de sinalização molecular, como a fosforilação de (i) S6K Thr389 e (ii) ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 . A comparação estatística de mais de dois grupos experimentais foi realizada com ANOVA e HSD de Tukey. Os dados são apresentados como apresentados como média ± DP. * Indica uma diferença significativa do controle (p &lt;0,05) e § indica diferença significativa de 150 ng / mL e 300 ng / mL de IGF-1. Figura adaptada de West et al. 1 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55339/55339fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Tratamento de construções ligamentares com soro condicionado por exercício: um modelo translacional de engenharia de tecidos | Bioengenharia | Vídeo

Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Apresentamos um modelo de tecido ligamentar em que as construções tridimensionais são tratadas com o soro humano exercido pelo exercício e analisadas quanto ao teor de colágeno, função e bioquímica celular.

Tratamento de Estruturas Ligamentares com Soro Condicionado por Exercício: Um Modelo Translacional de Engenharia de Tecidos

In vitro experiments are essential to understand biological mechanisms; however, the gap between monolayer tissue culture and human physiology is large, ...

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13.5K visualizações.  University of California, Davis.  Apresentamos um modelo de tecido ligamentar em que as construções tridimensionais são tratadas com o soro humano exercido pelo exercício e analisadas quanto ao teor de colágeno, função e bioquímica celular. 

Vídeo: Treatment of Ligament Constructs with Exercise-conditioned Serum: A Translational Tissue Engineering Model

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

Projeto de um biorreator Carregando Mecânica Biaxial para Engenharia de Tecidos

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Bioengenharia

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim to use these principles to create tissues with predefined collagen architectures. A full understanding of the exact underlying processes of collagen remodeling to control the final tissue architecture, however, is lacking. In particular, little is known about the (re)orientation of collagen fibers in response to changes in tissue mechanical loading conditions. We developed an in&#160;vitro model system, consisting of biaxially-constrained myofibroblast-seeded fibrin constructs, to further elucidate collagen (re)orientation in response to i) reverting biaxial to uniaxial static loading conditions and ii) cyclic uniaxial loading of the biaxially-constrained constructs before and after a change in loading direction, with use of the Flexcell FX4000T loading device. Time-lapse confocal imaging is used to visualize collagen (re)orientation in a nondestructive manner.
Cell and collagen organization in the constructs can be visualized in real-time, and an internal reference system allows us to relocate cells and collagen structures for time-lapse analysis. Various aspects of the model system can be adjusted, like cell source or use of healthy and diseased cells. Additives can be used to further elucidate mechanisms underlying collagen remodeling, by for example adding MMPs or blocking integrins. Shape and size of the construct can be easily adapted to specific needs, resulting in a highly tunable model system to study cell and collagen (re)organization.

This model system starts from a myofibroblast-populated fibrin gel that can be used to study endogenous collagen (re)organization real-time in a nondestructive manner. The model system is very tunable, as it can be used with different cell sources, medium additives, and can be adapted easily to specific needs.

Engenharia baseada em fibrina construções de tecido de miofibroblastos e de aplicação de restrições e tensão para induzir a organização das células e colágeno (Re)

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical deficiencies that impair function and stability. Current options for the treatment of partial ACL tears range from nonoperative, conservative management to multiple surgical options, such as: thermal modification, single-bundle repair, complete reconstruction, and reconstruction of the damaged portion of the native ligament. Few studies, if any, have demonstrated any single method for management to be consistently superior, and in many cases patients continue to demonstrate persistent instability and other comorbidities.
The goal of this study is to identify a potential cell source for utilization in the development of a tissue engineered patch that could be implemented in the repair of a partially torn ACL. A novel protocol was developed for the expansion of cells derived from patients undergoing ACL reconstruction. To isolate the cells, minced hACL tissue obtained during ACL reconstruction was digested in a Collagenase solution. Expansion was performed using DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% penicillin/streptomycin (P/S). The cells were then stored at -80 &#186;C or in liquid nitrogen in a freezing medium consisting of DMSO, FBS and the expansion medium. After thawing, the hACL derived cells were then seeded onto a tissue engineered scaffold, PLAGA (Poly lactic-co-glycolic acid) and control Tissue culture polystyrene (TCPS). After 7 days, SEM was performed to compare cellular adhesion to the PLAGA versus the control TCPS. Cellular morphology was evaluated using immunofluorescence staining. SEM (Scanning Electron Microscope) micrographs demonstrated that cells grew and adhered on both PLAGA and TCPS surfaces and were confluent over the entire surfaces by day 7. Immunofluorescence staining showed normal, non-stressed morphological patterns on both surfaces. This technique is promising for applications in ACL regeneration and reconstruction.

Surgical Retrieval, Isolation and In vitro Expansion of Human Anterior Cruciate Ligament-derived Cells for Tissue Engineering Applications

For future applications as a patch to repair partial tears of the Anterior Cruciate Ligament (ACL), human ACL derived cells were isolated from tissue obtained during reconstructive procedures, expanded in vitro and grown on tissue engineered scaffolds. Cellular adhesion and morphology was then performed to confirm biocompatibility on scaffold surface.

Recuperação cirúrgica, isolamento e<em&gt; In vitro</em&gt; Expansão de humanos anteriores Cruciate células do ligamento derivados para aplicações em engenharia de tecidos

Injury to the ACL is a commonly encountered problem in active individuals. Even partial tears of this intra-articular knee ligament lead to biomechanical ...

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Uma nova técnica de sutura tenorrhaphy com enxerto de colágeno projetado por tecido para reparar defeitos grandes do tendão

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical stimuli. The current understanding of fibrotic processes, including cardiac fibrosis, remains poor, which hampers the development of new anti-fibrotic therapies. Controllable and reliable human model systems are crucial for a better understanding of fibrosis pathology. This is a highly reproducible and scalable protocol to generate engineered connective tissues (ECT) in a 48-well casting plate to facilitate studies of fibroblasts and the pathophysiology of fibrotic tissue in a 3-dimensional (3D) environment. ECT are generated around the poles with tunable stiffness, allowing for studies under a defined biomechanical load. Under the defined loading conditions, phenotypic adaptations controlled by cell-matrix interactions can be studied. Parallel testing is feasible in the 48-well format with the opportunity for the time-course analysis of multiple parameters, such as tissue compaction and contraction against the load. From these parameters, biomechanical properties such as tissue stiffness and elasticity can be studied.

Presented here is a protocol to generate engineered connective tissues for a parallel culture of 48 tissues in a multi-well plate with double poles, suitable for mechanistic studies, disease modeling, and screening applications. The protocol is compatible with fibroblasts from different organs and species and is exemplified here with human primary cardiac fibroblasts.

Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...

Fabricação de conjuntos de tendões de camundongos para estudar interações celulares em doenças

Engineering Tendon Assembloids to Probe Cellular Crosstalk in Disease and Repair

Tendons enable locomotion by transferring muscle forces to bones. They rely on a tough tendon core comprising collagen fibers and stromal cell populations. This load-bearing core is encompassed, nourished, and repaired by a synovial-like tissue layer comprising the extrinsic tendon compartment. Despite this sophisticated design, tendon injuries are common, and clinical treatment still relies on physiotherapy and surgery. The limitations of available experimental model systems have slowed the development of novel disease-modifying treatments and relapse-preventing clinical regimes. 
In vivo human studies are limited to comparing healthy tendons to end-stage diseased or ruptured tissues sampled during repair surgery and do not allow the longitudinal study of the underlying tendon disease. In vivo animal models also present important limits regarding opaque physiological complexity, the ethical burden on the animals, and large economic costs associated with their use. Further, in vivo animal models are poorly suited to systematic probing of drugs and multicellular, multi-tissue interaction pathways. Simpler in vitro model systems have also fallen short. One major reason is a failure to adequately replicate the three-dimensional mechanical loading necessary to meaningfully study tendon cells and their function. 
The new 3D model system presented here alleviates some of these issues by exploiting murine tail tendon core explants. Importantly, these explants are easily accessible in large numbers from a single mouse, retain 3D in situ loading patterns at the cellular level, and feature an in vivo-like extracellular matrix. In this protocol, step-by-step instructions are given on how to augment tendon core explants with collagen hydrogels laden with muscle-derived endothelial cells, tendon-derived fibroblasts, and bone marrow-derived macrophages to substitute disease- and injury-activated cell populations within the extrinsic tendon compartment. It is demonstrated how the resulting tendon assembloids can be challenged mechanically or through defined microenvironmental stimuli to investigate emerging multicellular crosstalk during disease and injury.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de tendões desenvolvendo conjuntos de camundongos para entender os mecanismos celulares

Here, we present an assembloid model system to mimic tendon cellular crosstalk between the load-bearing tendon core tissue and an extrinsic compartment containing cell populations activated by disease and injury. As an important use case, we demonstrate how the system can be deployed to probe disease-relevant activation of extrinsic endothelial cells.

Tratamento de Estruturas Ligamentares com Soro Condicionado por Exercício: Um Modelo Translacional de Engenharia de Tecidos

Resumo

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Projeto de um biorreator Carregando Mecânica Biaxial para Engenharia de Tecidos

Engenharia baseada em fibrina construções de tecido de miofibroblastos e de aplicação de restrições e tensão para induzir a organização das células e colágeno (Re)

Recuperação cirúrgica, isolamento e

Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos

Engenharia 3D celularizados Colágeno Gel para Vascular Regeneração Tecidual

Uma nova técnica de sutura tenorrhaphy com enxerto de colágeno projetado por tecido para reparar defeitos grandes do tendão

Tecido conjuntivo de engenharia humana derivada do fibroblasto para aplicações de triagem

Engenharia de Assemblóides de Tendão para Sondar Crosstalk Celular em Doenças e Reparos

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