Name: mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis
Uploaded: 2017-01-07T18:00:00.000+00:00
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Os autores não têm confirmações.

1. Preparação de Trabalho Aptamer a Bolsa <ol><li> Seguir as instruções do fabricante e dissolve-se o oligonucleótido (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, a sequência de referência 18) em água, alcançando uma concentração final de 100 uM. </li><li> Preparar a solução de aptâmero de trabalho por diluição da oligonucleótido a 200 nm com tampão de ligação (Tris 20 mM, pH 7,6; NaCl 300 mM; MgCl2 5 mM; 0,01% Tween 20). </li><li> Incubar a mistura durante 2 min a 90 ° C, deixar a amostra arrefecer imediatamente para baixo sobre o gelo, e usar a amostra à temperatura ambiente. </li></ol> 2. Preparação da série de diluição Ligand <ol><li> Para cada ligando (trifosfato de adenosina (ATP), difosfato de adenosina (ADP), monofosfato de adenosina (AMP), adenina, guanosina trifosfato (GTP), trifosfato de citosina (CTP), desoxiadenosina-trifosfato (dATP), e s-adenosilmetionina (SAM) ; estoque 10 mM cada), preparar uma diluti série de 16 passosem em 200 ul tubos micro reação. NOTA: A centrifugação de ações ligando por 5 min a 14.000 xg pode ajudar a remover agregados. Baixo volume, tubos de reacção de ligação baixas são recomendadas para evitar a adsorção de moléculas com as paredes do tubo. </li><li> Comece com uma concentração máxima de, pelo menos, 50 vezes mais elevada do que a afinidade estimada e reduzir a concentração do ligando em 50% em cada passo de diluição. NOTA: A ferramenta concentração localizador implementado no software de controle simula dados de ligação e ajuda a encontrar o intervalo de concentração correta para a série de diluição. </li><li> Encher 20 ul de estoque o ligando (10 mM) no tubo 1. Adicionar 10 uL de tampão de ligação em tubos de reacção aptâmero micro 2-16. </li><li> Transferência de 10 ml de tubo 1 para o tubo 2 e misturar bem, pipetando para cima e para baixo várias vezes. Transferir 10 mL para o próximo tubo e repetir esta diluição para os tubos restantes. </li><li> Descartar o excesso de 10 ul a partir do último tubo. Evitar qualquer befeitos de diluição pode ser prejudicado. O tampão no tubo 1 e em tubos de 2-16 deve ser idêntica. </li></ol> 3. Preparação da Mistura final Reacção <ol><li> Preparar as reacções de ligação individuais com um volume de 20 ul (10 ul de solução de trabalho do aptâmero + 10 ul de diluição do respectivo ligando) para minimizar erros de pipetagem. Um volume de apenas 4 l é su fi ciente para encher o capilar. </li><li> Adicionar 10 ul da solução de trabalho de 200 nM de aptâmero de 10 ul de cada diluição de ligando e misturar bem por pipetagem para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Incubar as amostras durante 5 minutos a temperatura ambiente e encher as amostras padrão em capilares por meio de imersão dos capilares para a amostra. tempos de incubação mais longos podem ser necessários para algumas interacções; no entanto, 5 minutos é adequado para a maioria. Toque os capilares apenas sobre os lados, não na parte do meio, em que a medição óptica irá ser feita. </li><li> Coloque os capilares Onto thbandeja capilar e e iniciar o dispositivo MST. </li></ol> 4. Iniciar o dispositivo MST NOTA: O aparelho oferece dois pacotes de software pré-instalado, o &#39;&#39; &quot;software para a configuração técnica das condições experimentais e de controle &#39;&#39; análise de&quot; software para a interpretação dos dados produzidos. <ol><li> Antes de colocar a bandeja do capilar para o dispositivo MST, inicie o software de controle e ajustar a temperatura desejada geral, selecionando &#39;&#39; permitem controle de temperatura manual &quot;no &#39;&#39; controle de temperatura&quot; menu suspenso. Ajustar a temperatura para 25 ° C no presente modo. NOTA: Os instrumentos MST pode ser 22 a 45 ° C de temperatura controlada. </li><li> Aguarde até que a temperatura para atingir o nível esperado e, em seguida, colocar a bandeja do capilar para o dispositivo MST. </li><li> Ajuste o canal de LED para &#39;&#39; vermelho &quot;para corantes Cy5 e ajustar a potência de LED para ganhar uma fl uorescence sinal de 300 a 1000 unidades de fluorescência a do dispositivo com um sensor de MST padrão. 25% de energia LED é utilizado neste estudo. NOTA: 6.000 a 18.000 unidades de fluorescência são recomendados para o MST com um sensor de alta sensibilidade. </li></ol> 5. Capilar de digitalização <ol><li> Realize uma verificação capilar para verificar aspectos diferentes de qualidade da amostra, escolhendo a posição capilar no software &quot;Control&quot; e clicar em &quot;Start Scan cap&quot; antes de iniciar a medição MST. </li><li> Inspecione a varredura capilar para fluorescência realce / têmpera e efeitos degola (em forma de U ou achatadas picos) no software. NOTA: Mais detalhes sobre a detecção e tratamento de fluorescência e efeitos degola pode ser encontrada na discussão. </li></ol> 6. Medição MST NOTA: Antes de iniciar a medição MST, certifique-se de excluir degola efeitos, realce / efeitos de têmpera, ouerros de pipetagem, e garantir que a digitalização capilar indica que o sinal de fluorescência é su fi ciente. Para mais detalhes, veja a discussão. <ol><li> Atribuir os concentrações de ligando a partir da série de diluição para a respectiva posição capilar no software &quot;&quot; controle &quot;Considere o passo de diluição da mistura do aptâmero e o ligando. (1: 1). </li><li> Digite a maior concentração de ligando (5 mM) para capilar # 1, selecione o tipo de diluição correta (aqui, 1: 1), clique sobre a concentração máxima e use a função arrastar para atribuir automaticamente as concentrações restantes capilares # 2- 16. A concentração mais baixa é de 152,6 nm. </li><li> Introduza a concentração de aptâmero uorescente FL (aqui, 100 nM) na respectiva secção do software de controlo. </li><li> Use as configurações padrão, que detectam a fluorescência durante 5 segundos, registrar o MST durante 30 segundos, e registrar a fluorescência por mais 5 segundos após a inativação do laser t<html> o monitorar a difusão volta das moléculas. </li><li> Ajustar a potência do laser para 20% na respectiva secção do software de controlo. NOTA: A fim de receber a melhor relação sinal-ruído e para evitar os efeitos não específicos, uma potência de laser de 20-40% é recomendada. Em casos específicos, a potência do laser maior pode ser necessária para obter uma boa separação de moléculas não ligadas e ligados. </li><li> Salve o experimento depois de selecionar a pasta de destino e iniciar a medição do MST, premindo o botão &#39;&#39; de medição Iniciar MST &quot;. NOTA: O arquivo .ntp será gerado na pasta de destino. Usando esta configuração, uma medida dura 10-15 min. </li><li> Repetir o procedimento experimental pelo menos duas vezes para uma determinação mais precisa do valor de CE 50. NOTA: Para testar a reprodutibilidade técnica, os mesmos capilares podem ser digitalizados várias vezes (repete técnicas). </li></ol> 7. Análise de Dados MST nt &quot;&gt; NOTA: O software de análise permite a análise de dados sobre a fl y durante a medição O software de análise de traça os traços de tempo MST e mudanças no normalizada fluorescência (norma F) versus a concentração do ligando 37.. <ol><li> Inicie o software de análise de MST (Análise MO.Affinity) e carregar o arquivo .ntp da pasta de destino. Selecione &quot;MST&quot; como o tipo de análise no menu de seleção de dados. Nota: Em caso de efeitos de fluorescência dependente do ligando, a fluorescência inicial pode ser escolhida para análise. </li><li> Adicionar o respectivo prazo (s) técnica ou biológica com uma nova análise por arrastar-e-soltar ou pressionando o botão &quot;+&quot; abaixo do respectivo prazo experimental. </li><li> Pressione o botão informações abaixo do respectivo prazo experimental para obter informações sobre as propriedades do experimento, os traços do MST, varredura capilar, forma capilar, fluorescência inicial e taxa de branqueamento. Nota: Estes dados brutos podem alpor isso ser inspecionados em etapas posteriores da análise. </li><li> Inspecione visualmente os vestígios do MST para efeitos de agregação e precipitação, visível como colisões e picos. NOTA: Para mais informações sobre a detecção e tratamento dos efeitos de agregação, leia a discussão. </li><li> inspecionar visualmente a varredura capilar e a sobreposição de forma capilar para efeitos de adsorção, visível como picos achatadas ou em forma de U. inspecionar visualmente a varredura capilar e a fluorescência inicial para efeitos de fluorescência. inspecionar visualmente a taxa de branqueamento para efeitos fotodegradação. </li><li> Alternar para o modo de dose-resposta e altere a configuração de análise para o modo &quot;expert&quot; pressionando o respectivo botão. Selecione &quot;T-Jump&quot;, como a estratégia de avaliação MST. </li><li> Selecione o modelo de &quot;Hill&quot; para a curva fi tting. Os parâmetros de ligação será automaticamente calculado. Normalizar os dados, escolhendo o respectivo tipo de normalização no menu &quot;comparar os resultados&quot;. exportar odados tanto como um .xls ou .pdf. NOTA: A tabela abaixo do gráfico de ligação resume os parâmetros obrigatórios calculados. </li></ol>

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controles de qualidade: Inespecífica colagem / adsorção do material da amostra para as superfícies, bem como os efeitos de agregação, ter uma influência dramática na qualidade dos dados de afinidade. No entanto, apenas algumas tecnologias state-of-the-art oferecem opções precisas e rápidas para monitorar e evitar esses efeitos. MST oferece controlos de qualidade integrados que detectam e ajudar a ultrapassar estes problemas, permitindo a optimização gradual da configuração técni...

A interacção entre as moléculas é a base da natureza. Assim, os cientistas em diversas áreas de pesquisa básica e aplicada tentar entender os princípios fundamentais de interacções moleculares de diferentes tipos. MicroScale termoforese (MST) permite aos cientistas realizar a caracterização rápida, precisa e de custo eficiente e de qualidade controlada de interações moleculares em solução, com uma livre escolha de buffers. Já existem mais de 1.000 publicações utilizando MST, a partir de 2016 sozinho, descrevendo diferentes tipos de análises, incluindo rastreios de bibliotecas, a ligação validações de eventos, ensaios de competição, e experimentos com múltiplos parceiros de ligação 1-8. Em geral, o MST permite o estudo dos parâmetros de ligação clássicos, tais como a afinidade de ligação (pM para mM), estequiometria, e termodinâmica, de qualquer tipo de interacção molecular. Uma grande vantagem de MST é a possibilidade de estudar eventos de ligação independentes do tamanho dos parceiros de interacção. mesmo chalinteracções entre lenging aptâmeros de ácidos nucleicos pequenos (15-30 nt) e alvos, tais como pequenas moléculas, drogas, antibióticos, ou metabolitos podem ser quantificados. Atuais tecnologias state-of-the-art para caracterizar as interações aptâmero-alvo são ou lab-intenso e altamente complexa ou não quantificar aptâmero-pequena molécula interações 9,10. Superfície Plasmon Resonance (SPR) à base de ensaios de 11,12 e abordagens calorimétricos verdadeiramente livre de rótulo, como Calorimetria isotérmica de titulação (ITC) 13-15, eluição isocrática 16, o equilíbrio infiltração 17,18, em linha sondagem 19, distribuição do gel mudar ensaios, stopped- fluxo de fluorescência espectroscopia 20,21, anisotropia de fluorescência (FA) 22,23, uma única molécula de fluorescência de imagem 24,25, e Bio-camada de interferometria (BLI) 26 também são ou imprecisa ou incompatível com a molécula do aptâmero-small interacções. Outros principal questões de estes métodos são de baixa sensibilidade, o consumo elevado de amostras, imobilização, as limitações de transporte de massa em superfícies, e / ou restrições de buffer. Apenas algumas destas tecnologias oferecem controles integrados para efeitos de agregação e de adsorção. MST representa uma ferramenta poderosa para os cientistas para superar esta limitação para estudar as interacções entre os aptâmeros e pequenas moléculas 27-29, bem como outros objectivos, tais como proteínas de 30-33. A tecnologia baseia-se no movimento de moléculas através de gradientes de temperatura. Este movimento dirigido, chamado &quot;termoforese,&quot; depende do tamanho, carga, e camada de hidratação da molécula 34,35. A ligação de um ligando para a molécula irá alterar directamente, pelo menos, um destes parâmetros, o que resulta em uma mobilidade alterada thermophoretic. Ligantes com tamanhos pequenos podem não ter um impacto considerável em termos de mudança de tamanho do não ligado ao estado ligado, mas eles podem ter dr<html> efeitos AMATIC sobre a camada de hidratação e / ou carga. As mudanças no movimento das moléculas após thermophoretic interacções com o parceiro de ligação permite a quantificação dos parâmetros de ligação de base 2,7,34,36,37. Tal como representado na Figura 1A, o dispositivo consiste MST de um laser infravermelho focalizada sobre a amostra, dentro dos capilares de vidro utilizando a mesma óptica como para a detecção de fluorescência. O movimento thermophoretic de proteínas através da fluorescência intrínseca dos resíduos de triptofano 6 ou de um parceiro de interacção 3,8 marcado por fluorescência podem ser monitorizadas enquanto o laser estabelece um gradiente de temperatura (AT de 2-6 ° C). A diferença de temperatura, resultando em espaço, AT, conduz à depleção ou da acumulação de moléculas na zona de temperatura elevada, que pode ser quantificado pelo coeficiente Soret (S T): g &quot;/&gt; c representa quente a concentração na região aquecida, e c frio é a concentração na região fria inicial. Como mostrado na Figura 1B, uma típica MST os resultados da experiência em um perfil de movimento MST (traço do tempo), que consiste em diferentes fases, que podem ser separadas pelos respectivos prazos. A fluorescência é medida inicial nos primeiros 5 s na ausência do gradiente de temperatura para definir a fluorescência a partir preciso e para verificar a fotobranqueamento ou photoenhancement. O salto de temperatura (T-Jump) representa a fase em que a fluorescência mudanças antes do movimento thermophoretic. Essa redução inicial na fluorescência depende de mudanças dependentes do calor de fl uorophore rendimento quântico. A fase termoforese segue, em que as reduções de fluorescência (ou aumento), devido ao movimento das moléculas de thermophoretic até que a distribuição em estado estacionário é atingido.O TJump reversa e concomitante difusão de moléculas de volta uorescent fl pode ser observado como indicado na figura 1B após o laser é desligado. De modo a aceder aos parâmetros de ligação de base, diferentes razões molares dos parceiros de interacção são analisados ​​e comparados. Tipicamente, 16 diferentes proporções são estudadas numa experiência MST, enquanto que a molécula visível óptico é mantido constante e é fornecido com uma quantidade crescente de ligando não marcado. A interacção entre os dois parceiros de ligação induz alterações na termoforese, e, assim, na fluorescência normalizada, F norma, que é calculada como se segue: <img alt="Equação" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F quente e fria F representam em média intensidades fluorescência na de fi nidas pontos no tempo dos traços do MST. As afinidades de ligação (Kd ou valores de EC50) pode ser calculada por Curve encaixe (Figura 1C). No geral, o MST é uma ferramenta poderosa para estudar interações moleculares de qualquer tipo. Este manuscrito oferece um protocolo para caracterizar a interação desafio entre a pequena molécula de trifosfato de adenosina (ATP; 0,5 kDa) e do 25-nt curta ssDNA aptâmero DH25.42 (7,9 kDa). Ao longo do manuscrito, o local de ligação do aptâmero na molécula de ATP é mapeado para baixo para o grupo de adenina do ATP.

<table><tbody><tr><td>Aptamer binding buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 0.01% Tween-20</td></tr><tr><td>Fluorescently labeled ATP aptamer</td><td>IDT, Leuven, Belgium</td><td></td><td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-&lt;br/&gt;ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2383</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2754</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2252</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A8626</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A7007</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>11934511001</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>C1506</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>G8877</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Monolith NT.115&amp;nbsp;</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-G008</td><td>Blue/Red Channel&lt;br/&gt; MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 capillaries Standard</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR tubes</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.affinity analysis v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

Neste estudo, o MST foi aplicado para caracterizar o local de ligação do aptâmero ADN DH25.42 18 em ATP. Em contraste com outros estudos que caracterizam a interacção de ATP ou ATP-imitando as moléculas pequenas com as proteínas marcadas aleatoriamente com um ou mais fluoróforos 38-40, este estudo inclui uma versão marcada do aptâmero 7,9 kDa ADNcs com uma molécula de Cy5 na extremidade 5&#39; . Diferentes derivados de ATP e de moléculas relacionadas, to...

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Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Mapear o sítio de ligação de um Aptamer no ATP Usando MicroScale termoforese

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

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Research

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Biochemistry

10.5K visualizações.  2bind GmbH. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

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Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

Seleção de Aptamer de DNA de ligação éster de ácido ftálico, caracterização e aplicação de um Aptasensor eletroquímica

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Química

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Bioquímica

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

Um ensaio de ligação de proteínas de superfície celular baseado em citometria de fluxo para avaliar a seletividade e a especificidade de um Aptamer anticancerígeno

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Pesquisa do câncer

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified through an in vitro selection process called Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) to recognize a wide variety of targets, from small molecules to proteins and other macromolecules 2-4. Aptamers have properties that are well suited for in vivo diagnostic and/or therapeutic applications: Besides good specificity and affinity, they are easily synthesized, survive more rigorous processing conditions, they are poorly immunogenic, and their relatively small size can result in facile penetration of tissues.
Aptamers that are identified through the standard SELEX process usually comprise ~80 nucleotides (nt), since they are typically selected from nucleic acid libraries with ~40 nt long randomized regions plus fixed primer sites of ~20 nt on each side. The fixed primer sequences thus can comprise nearly ~50% of the library sequences, and therefore may positively or negatively compromise identification of aptamers in the selection process 3, although bioinformatics approaches suggest that the fixed sequences do not contribute significantly to aptamer structure after selection 5. To address these potential problems, primer sequences have been blocked by complementary oligonucleotides or switched to different sequences midway during the rounds of SELEX 6, or they have been trimmed to 6-9 nt 7, 8. Wen and Gray 9 designed a primer-free genomic SELEX method, in which the primer sequences were completely removed from the library before selection and were then regenerated to allow amplification of the selected genomic fragments. However, to employ the technique, a unique genomic library has to be constructed, which possesses limited diversity, and regeneration after rounds of selection relies on a linear reamplification step. Alternatively, efforts to circumvent problems caused by fixed primer sequences using high efficiency partitioning are met with problems regarding PCR amplification 10.
We have developed a primer-free (PF) selection method that significantly simplifies SELEX procedures and effectively eliminates primer-interference problems 11, 12. The protocols work in a straightforward manner. The central random region of the library is purified without extraneous flanking sequences and is bound to a suitable target (for example to a purified protein or complex mixtures such as cell lines). Then the bound sequences are obtained, reunited with flanking sequences, and re-amplified to generate selected sub-libraries. As an example, here we selected aptamers to S100B, a protein marker for melanoma. Binding assays showed Kd s in the 10-7 - 10-8 M range after a few rounds of selection, and we demonstrate that the aptamers function effectively in a sandwich binding format.

SELEX protocols comprise multiple rounds of selection, each of which require regeneration of bound ligands, which in turn require fixed primer sequences flanking the random library regions. These fixed primer sequences can interfere with the selection process (false positives and negatives). Here we present a primer-free protocol.

Primer-Free Seleção Aptamer usando uma biblioteca de DNA Aleatório

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Biologia

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

Determinando a associação termodinâmica e cinética de um aptamer de DNA e tetraciclina usando calorimetria de titulação isotérmica

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Aptamer-Based Target Detection Facilitated by a 3-Stage G-Quadruplex Isothermal Exponential Amplification Reaction

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules with signal-generation capability. For the system described herein, target recognition through an aptameric domain, Stem II of a modified hammerhead ribozyme, activates the self-cleaving ribozyme by stabilizing the initially unstructured construct. The cis-cleaving RNA acts at the junction of Stem III and Stem I, creating two cleavage products. The longer cleavage product primes an isothermal exponential amplification reaction (EXPAR) of the two similar catalytically active G-quadruplexes. Those resulting amplification products catalyze peroxidase reduction, which is coupled to the reduction of a colorimetric substrate with an output that the naked eye can detect. The 3-part system described in the present study improves detection modalities such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) by producing a visually detectable signal for indicating the presence of as low as 0.5 &#181;M theophylline in as little as 15 min.

The present protocol demonstrates the use of a fast, 3-stage, aptamer-based exponential amplification assay to detect targets. Sample preparation, signal amplification, and color development are covered to implement this system to recognize the presence of theophylline over that of caffeine.

Detecção de alvos baseada em aptâmero facilitada por uma reação de amplificação exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 estágios

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules ...

Bioengenharia

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Um método para selecionar Aptamers de comutação Estrutura Aplicado a um colorimétrico nanopartículas de ouro Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Differential Scanning Calorimetry to Study DNA Aptamer-Thermolabile Ligand Interaction

Source: Mittermaier, A. K., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55959">Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates differential scanning calorimetry &#8212; a technique to study the interaction between a biomolecule and a ligand. The binding of a DNA aptamer and a thermolabile ligand is studied by applying repeated heating and cooling cycles to the sample and obtaining scans for thermodynamic analysis.

Calorimetria Exploratória Diferencial para Estudo da Interação DNA Aptamer-Ligante Termolábil

Source: Mittermaier, A. K., et al. Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions. ...