יש המחברים לא בתודות.

1. הכנה של Stock עבודת Aptamer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעל על פי הוראות היצרן ו לפזר את oligonucleotide (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, רצף בהפניה 18) במים, להגיע לריכוז סופי של 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרון עובד aptamer ידי דילול המניות oligonucleotide 200 ננומטר עם חיץ מחייב (20 מ&quot;מ טריס, pH 7.6; 300 מ&quot;מ NaCl; 5 מ&quot;מ MgCl 2; 0.01% Tween20). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת במשך 2 דקות ב 90 מעלות צלזיוס, בואו המדגם מיד להתקרר על קרח, ולהשתמש מדגם בטמפרטורת החדר. </li></ol> 2. הכנת סדרת הדילול ליגנד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל ליגנד (אדנוזין אדנוזין (ATP), diphosphate אדנוזין (ADP), monophosphate אדנוזין (AMP), אדנין, אדנוזין guanosine (GTP), אדנוזין ציטוזין (CTP), אדנוזין deoxyadenosine (dATP), ומתיונין S-adenosyl (SAM) ; 10 מ&quot;מ מניות כל אחת), להכין diluti סדר 16 שלביםעל ב 200 צינורות התגובה מיקרו μl. הערה: צנטריפוגה של מניות ליגנד במשך 5 דקות ב 14,000 XG עשוי לעזור כדי להסיר אגרגטים. נפח נמוך, צינורות תגובה מחייבת נמוכים מומלצים להימנע ספיחה של מולקולות על קירות הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל עם ריכוז מרבי של לפחות 50 פעמים גבוהות יותר מאשר הזיקה המוערכת ולהפחית את הריכוז ליגנד ב -50% בכל שלב דילול. הערה: הכלי מאתר הריכוז מיושם תוכנות שליטת מדמת נתונים מחייבים ועוזרת במציאת טווח הריכוז הנכון עבור סדרת הדילול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו 20 μl של המניה ליגנד (10 מ&quot;מ) צינור 1. הוסף 10 μl של חיץ מחייב aptamer לתוך צינורות התגובה מיקרו 2 עד 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 10 μl של צינור 1 צינור 2 ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. העבר 10 μL אל הצינור הבא וחזרו דילול זה עבור הצינורות הנותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את עודף 10 μl מהצינור האחרון. הימנע מכל bתופעות דילול uffer. המאגר בצינור 1 ו צינורות 2-16 חייב להיות זהה. </li></ol> 3. הכנה של מיקס התגובה האחרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התגובות מחייבות אדם עם נפח של 20 μl (10 μl של פתרון עובד aptamer + 10 μl של הדילול ליגנד בהתאמה) כדי למזער שגיאות pipetting. נפח של רק 4 μl הוא יעיל fi סוף ל- Fi ll הנימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של הפתרון עובד aptamer 200 ננומטר עד 10 μl של דילול כל ליגנד ומערבבים היטב על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הדגימות במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר וסיבי ll הדגימות מתפצלות לנימים סטנדרטיים על ידי טבילת הנימים לתוך המדגם. פעמי דגירה כבר עשויות להיות נחוצות עבור אינטראקציות כמה; עם זאת, 5 דקות הוא מתאים ביותר. גע הנימים רק בצדדים, לא על החלק האמצעי, שבו המדידה האופטית תילקח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הנימים על הדואר נימי מגש ולהתחיל מכשיר MST. </li></ol> 4. הפעלת התקן MST הערה: המכשיר מספק שתי חבילות תוכנה שהותקנה מראש, ה &#39; &quot;תוכנה עבור ההגדרות הטכניות של תנאי הניסוי ואת השליטה&#39; &#39;ניתוח&quot; &quot;תוכנה עבור הפרשנות של הנתונים המיוצר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הצבת מגש הנימים לתוך מכשיר MST, להפעיל את התוכנה מלאה להתאים את הטמפרטורה הכללית רצויה על ידי הבחירה ב &#39;&#39; לאפשר בקרת טמפרטורה ידנית &quot;ב &#39;&#39; בקרת טמפרטורה&quot; התפריט הנפתח. כוונו את הטמפרטורה ל 25 מעלות צלזיוס בדרך זו. הערה: מכשירי MST יכולים להיות מבוקר טמפרטורה מ 22 עד 45 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה הטמפרטורה להגיע לרמה הצפויה ולאחר מכן למקם את מגש הנימים לתוך מכשיר MST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את ערוץ LED כדי &#39;&#39; אדום &quot;עבור צבע Cy5 ולהתאים את כוח LED להשיג fl uorescencאות e של 300 עד 1,000 יחידות קרינה במכשיר MST עם חיישן רגיל. 25% כוח LED משמש במחקר זה. הערה: 6,000 עד 18,000 יחידות קרינה מומלצות לשימוש MST עם חיישן רגישות גבוהה. </li></ol> 5. נימי סריקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע סריקת נימים לבדוק היבטים שונים באיכות של המדגם על ידי בחירת מיקום הנימים על תוכנת &quot;שליטה&quot; ולחיצה על &quot;התחל סריקת כובע&quot; לפני תחילת מדידת MST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הסריקה נימי להגברת קרינה / מרווה ואפקטים דבקים (בצורת U או נמחצה על פסגות) בתוכנה. הערה: פרטים נוספים על זיהוי והטיפול של קרינה ותופעות דבקות ניתן למצוא בדיון. </li></ol> 6. מדידת MST הערה: לפני שמתחיל את מדידת MST, הקפד לכלול דבק אפקטים, שיפור / אפקטים מרווים, אוטעויות pipetting, ולהבטיח כי סריקת הנימים מציינת כי אות fl uorescence היא הסוף יעיל fi. לפרטים נוספים, ראה דיון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקצה את ריכוז ליגנד מסדרת הדילול לתפקיד נימי בהתאמה בתוכנת &#39;&#39; השליטה &quot;לשקול את צעד הדילול של ערבוב aptamer ליגנד. (1: 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הריכוז הגבוה ביותר של ליגנד (5 המ&quot;מ) עבור נימי # 1, בחר את סוג הדילול הנכון (כאן, 1: 1), לחץ על הריכוז המרבי, ולהשתמש בפונקציית גרור להקצות הריכוזים הנותרים באופן אוטומטי נימים # 2 16. הריכוז הנמוך ביותר הוא 152.6 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הריכוז של aptamer uorescent fl (כאן, 100 ננומטר) בסעיף בהתאמה של תוכנות שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהגדרות ברירת המחדל, אשר לזהות את uorescence fl למשך 5 שניות, להקליט את MST למשך 30 שניות, ולהקליט את הקרינה במשך שניות 5 נוספות לאחר האיון של t הליזר<html> o לפקח על דיפוזיה האחורי של מולקולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את כוח לייזר עד 20% בגזרה בהתאמה של תוכנות שליטה. הערה: כדי לקבל את יחס אות לרעש הטוב ביותר ועל מנת למנוע תופעות נוקבות, כוח ליזר של 20-40% מומלץ. במקרים מסוימים, כוח ליזר גבוה יותר עשוי להידרש לקבל הפרדה טובה של מולקולות מאוגדות וכרוכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הניסוי לאחר בחירת תיקיית היעד ולהתחיל מדידת MST ידי לחיצה על כפתור &#39;&#39; התחל MST המדידה &quot;. הערה: קובץ .ntp יופק בתיקיית היעד. באמצעות התקנה זו, מדידה אחת נמשכת 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ההליך הניסיוני לפחות פעמים לשם קביעה מדויקת יותר של הערך 50 EC. הערה: על מנת לבחון את השחזור הטכני, באותה הנימים ניתן לסרוק מספר פעמים (חזרות טכניות). </li></ol> 7. MST ניתוח נתונים NT &quot;&gt; הערה: תוכנת הניתוח מאפשרת ניתוח של נתונים על y fl במהלך מדידת תוכנת ניתוח מגרשי עקבות MST הזמן ושינויי uorescence fl המנורמל (נורמת F) לעומת הריכוז ליגנד 37.. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנת ניתוח MST (ניתוח MO.Affinity) ולטעון את הקובץ .ntp מתיקיית היעד. בחר &quot;MST&quot; כסוג ניתוח בתפריט מבחר נתונים. הערה: במקרה של תופעות קרינה תלויה ליגנד, הקרינה הראשונית ניתן לבחור לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את הריצה טכנית או ביולוגית בהתאמה (ים) ניתוח חדש על ידי גרירה ושחרור או על ידי לחיצה על הכפתור &quot;+&quot; להלן בטווח הניסיון בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן המידע שלהלן בטווח הניסיון בהתאמה כדי להשיג מידע על המאפיינים של הניסוי, עקבות MST, סריקת נימים, צורה נימי, קרינה ראשונית, וקצב לבן. הערה: נתונים גולמיים אלה יכולים אלכך להיבדק, בשלבים מאוחרים יותר של ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראייה לבדוק את עקבות MST לתופעות צבירה משקעים, נראה כמו בליטות קוצים. הערה: לקבלת מידע נוסף על זיהוי וטיפול של תופעות צבירה, לקרוא את הדיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראייה לבדוק את הסריקה נימי ואת שכבת צורה נימי עבור אפקטי ספיחה, גלויה כמו פסגות שטוחות או בצורת U. ראייה לבדוק את הסריקה נימי ואת הקרינה הראשונית לתופעות הקרינה. ראייה לבדוק את שיעור ההלבנה עבור photobleaching אפקטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעבר למצב מנת התגובה ולשנות את הגדרת הניתוח למצב &quot;מומחה&quot; על ידי לחיצה על הכפתור בהתאמה. בחר &quot;T-קפיצה&quot; כאסטרטגית הערכת MST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הדגם &quot;היל&quot; עבור tting fi העקומה. הפרמטרים מחייבים יחושבו אוטומטית. לנרמל את הנתונים על ידי בחירת בהתאמה לסוג של נורמליזציה בתפריט &quot;להשוות את התוצאות&quot;. יצואנתונים אם במסגרת .xls או pdf. הערה: הטבלה מתחת לגרף המחייב מסכמת את הפרמטרים מחייבים המחושבים. </li></ol>

CE ו- TS הם עובדי 2bind GmbH, המספקת שירותים אנליטיים biophysical. עמלות פרסום עבור מאמר וידאו זה משולמות על ידי 2bind GmbH.

בקרות איכות: דבק נוקבים / ספיחה של חומר מדגם למשטחים, וכן תופעות צבירה, יש השפעה דרמטית על איכות נתוני הזיקה. עם זאת, רק המדינה- of-the-art כמה טכנולוגיות מציעות אפשרויות מדויקות ומהירות לפקח למנוע את ההשפעות הללו. MST מציעה בקרת איכות משול...

אינטראקציה בין המולקולות היא הבסיס של הטבע. לפיכך, מדענים בתחומים רבים של מחקר בסיסי ויישומים לנסות להבין את עקרונות היסוד של אינטראקציות מולקולריות מסוגים שונים. Microscale Thermophoresis (MST) מאפשרת למדענים לבצע את מהירה מדויקת, יעילה וחסכונית, ואיכות שבשליטת אפיון של אינטראקציות מולקולריות בתמיסה, עם בחירה חופשית של מאגרים. יש כבר יותר מ -1,000 פרסומים באמצעות MST, משנת 2016 בלבד, המתאר סוגים שונים של ניתוחים, כוללים סריקות ספרייה, מחייב אימותי אירוע, מבחני תחרות, וניסויים עם שותפים מחייבים מספר 1-8. באופן כללי, MST מתיר חקר הפרמטרים המחייבים הקלסיים, כגון זיקה מחייבת (PM כדי מ&quot;מ), ורכב, ותרמודינאמיקה, מכל סוג של אינטראקציה מולקולרית. יתרון גדול של MST הוא היכולת ללמוד אירועים מחייבים תלות בגודל של שותפי האינטראקציה. אפילו chalאינטראקציות lenging בין aptamers חומצות גרעין קטן (15-30 NT) ויעדים כגון מולקולות קטנות, תרופות, אנטיביוטיקה, או מטבוליטים ניתן לכמת. נוכח המדינה- of-the-art טכנולוגיות לאפיין אינטראקציות aptamer-היעד הם או מעבדה קשות ומורכבות מאוד או להיכשל לכמת aptamer-מולקולה קטנה קשרי גומלין 9,10. Surface Plasmon תהודה (SPR) מבוססי מבחני 11,12 וגישות קלוריות ללא תווית באמת, כגון Calorimetry טיטרציה איזו תרמים (ITC) 13-15, elution isocratic 16, ltration fi שיווי משקל 17,18, ב-קו חיטוט 19, ג&#39;ל משמרת מבחנים, והשתתק fl זרימת uorescence ספקטרוסקופיה 20,21, אנאיזוטרופיה קרינה (FA) 22,23, uorescence ההדמיה fl מולקולה בודדת 24,25, ו interferometry ביו השכבתי (BLI) 26 גם אם לא מדויקים או לא תואמים עם מולקולת aptamer-קטן יחסי גומלין. principa אחרסוגיות l של שיטות אלו רגישות נמוכה, צריכת דגימה גבוהה, חוסר תנועה, מגבלות להסעת המונים על משטחים, ו / או הגבלות חיץ. רק מעטי טכנולוגיות אלה מספקים בקרות משולבות אפקטי צבירת ספיחה. MST מהווה כלי רב עוצמה עבור המדענים להתגבר על מגבלה זו כדי לחקור את יחסי הגומלין בין aptamers ומולקולות קטנות 27-29, כמו גם מטרות אחרות כגון חלבונים 30-33. הטכנולוגיה מתבססת על תנועת מולקולות באמצעות הדרגתיים טמפרטורה. התנועה מכוונת זו, המכונה &quot;thermophoresis,&quot; תלוי בגודל, פריצה, ופצצת הידרציה של המולקולה 34,35. עקידת ליגנד למולקולה תשנה במישרין לפחות אחד הפרמטרים האלה, וכתוצאה מכך ניידות thermophoretic השתנה. הליגנדים עם מידות קטנות לא שיכולים להשפיע בצורה מהותית מבחינת שינוי הגודל מתוך המאוגד אל המדינה הנכנסת, אבל הם יכולים להיות dr<html> תופעות amatic על הקליפה הידרציה ו / או תשלום. השינויים בתנועה thermophoretic של מולקולות לאחר אינטראקציות עם שותף מחייב מאפשרת כימות של פרמטרים מחייבים בסיסיים 2,7,34,36,37. כפי שמתואר באיור 1A, מכשיר MST מורכב ליזר אינפרא אדום הממוקד על המדגם בתוך נימי הזכוכית באמצעות אותו אופטיקה ובאשר גילוי קרינה. התנועה thermophoretic של חלבונים באמצעות uorescence fl הפנימי של tryptophans 6 או של 3,8 שותף אינטראקציה שכותרתו fluorescently ניתן לנטר בזמן הלייזר קובע שיפוע הטמפרטורה (ΔT של 2-6 מעלות צלזיוס). הבדל הטמפרטורה והתוצאה הוא יותר שטח, ΔT, מוביל הדלדול או ההצטברות של מולקולות בתחום הטמפרטורה גבוהה, אשר ניתן לכמת ידי Soret COEF fi יעיל (S T): ז &quot;/&gt; ג חם מייצג את הריכוז באזור המחומם, וקרת c היא הריכוז באזור הקר הראשוני. כפי שניתן לראות בתרשים 1B, תוצאות ניסוי MST טיפוסיות פרופיל תנועת MST (זכר זמן), מורכב שלבים שונים, אשר יכול להיות מופרד על ידי לוחות הזמנים שלהם. הקרינה הראשונית נמדדה ב -5 s הראשונה בהיעדרו של שיפוע הטמפרטורה כדי להגדיר את הקרינה החל מדויקת כדי לבדוק photobleaching או photoenhancement. קפיצת הטמפרטורה (T-Jump) מייצגת את השלב שבו שינויי הקרינה לפני תנועת thermophoretic. ירידה ראשונית זו קרינה תלויה בשינויים חומים תלויה של fl uorophore תשואת קוונטים. שלב thermophoresis כדלקמן, שבו ירידות הקרינה (או עליות) עקב תנועת thermophoretic של המולקולות עד החלוקה היציבה הוא הגיע.TJump הפוכה דיפוזיה בחזרה קשורה של מולקולות uorescent fl ניתן לצפות כמצוין באיור 1B לאחר הלייזר מכובה. כדי לגשת פרמטרים מחייבים בסיסיים, יחסי טוחנת שונים של השותפים באינטראקציה מנותחים ומשווים. בדרך כלל, 16 יחסים שונים נלמדים בניסוי אחד MST, ואילו מולקולת הגלוי האופטית נשמרה קבועה מסופקת עם כמות הולכת וגדלה של ליגנד ללא תווית. האינטראקציה בין שני השותפים מחייבים גורמת לשינויי thermophoresis, ומכאן גם uorescence fl המנורמל, נורמת F, אשר מחושבת כדלקמן: <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/55070/55070eq2.jpg" /> F חם וקר F מייצג ממוצעי עוצמות fl uorescence ב דה fi מועד לפי שעון נד של עקבות MST. זיקות מחייבות (ד K או EC 50 ערכים) יכולות להיות מחושבות על ידי הכמתמ&quot;כהולם דואר (תרשים 1C). בסך הכל, MST הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור אינטראקציות מולקולריות מכל סוג שהוא. כתב יד זה מציע פרוטוקול לאפיין את האינטראקציה המאתגרת בין אדנוזין אדנוזין המולקולה הקטן (ATP; 0.5 KDA) ואת 25-NT הקצר ssDNA aptamer DH25.42 (7.9 KDA). במהלך של כתב היד, אתר הקישור של aptamer על מולקולת ATP ממופה אל קבוצת אדנין של ATP.

<table><tbody><tr><td>Aptamer binding buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;; 0.01% Tween-20</td></tr><tr><td>Fluorescently labeled ATP aptamer</td><td>IDT, Leuven, Belgium</td><td></td><td>sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT-&lt;br/&gt;ATTGCGGAGGAAGG-3</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2383</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2754</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>AMP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A2252</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A8626</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>SAM</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>A7007</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>dATP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>11934511001</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>C1506</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma Aldrich, Germany&amp;nbsp;</td><td>G8877</td><td>10 mM stock solutions stored at - 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Monolith NT.115&amp;nbsp;</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-G008</td><td>Blue/Red Channel&lt;br/&gt; MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector</td></tr><tr><td>Monolith NT.115 capillaries Standard</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td>MO-K002</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR tubes</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>30124537</td><td></td></tr><tr><td>Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MO.affinity analysis v2.1.1</td><td>NanoTemper Technologies, Munich, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph 4.5.2</td><td>Synergy Software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping the binding site of an aptamer on atp using microscale thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

במחקר זה, MST יושמה לאפיין את אתר הקישור של aptamer DH25.42 DNA 18 על ATP. בניגוד למחקרים אחרים המאפיינים את האינטראקציה של ATP או ה- ATP-מחק מולקולות קטנות עם חלבונים שכותרתו אקראית עם fluorophores אחד או יותר 38-40, מחקר זה כולל גרסה שכותרתו של aptamer 7.9 kDa ssDNA עם מול...

Watch this Scientific Journal Video about Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis at JoVE.com

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

מיפוי אתר הקישור של Aptamer על ATP שימוש microscale Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

mapping-binding-site-an-aptamer-on-atp-using-microscale

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K Views.  2bind GmbH. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Video: Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Phthalic Acid Ester-Binding DNA Aptamer Selection, Characterization, and Application to an Electrochemical Aptasensor

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the rapid growing of congeners. DNA aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward highly hydrophobic small molecule targets, such as PAEs, is rarely reported. This work describes a bead-based method designed to select group-specific DNA aptamers to PAEs. The amino group functionalized dibutyl phthalate (DBP-NH2) as the anchor target was synthesized and immobilized on the epoxy-activated agarose beads, allowing the display of the phthalic ester group at the surface of the immobilization matrix, and therefore the selection of the group-specific binders. We determined the dissociation constants of the aptamer candidates by quantitative polymerization chain reaction coupled with magnetic separation. The relative affinities and selectivity of the aptamers to other PAEs were determined by the competitive assays, where the aptamer candidates were pre-bounded to the DBP-NH2 attached magnetic beads and released to the supernatant upon incubation with the tested PAEs or other potential interfering substances. The competitive assay was applied because it provided a facile affinity comparison among PAEs that had no functional groups for surface immobilization. Finally, we demonstrated the fabrication of an electrochemical aptasensor and used it for ultrasensitive and selective detection of bis(2-ethylhexyl) phthalate. This protocol provides insights for the aptamer discovery of other hydrophobic small molecules.

A protocol for the in vitro selection and characterization of group-specific phthalic acid ester- binding DNA aptamers is presented. The application of the selected aptamer in an electrochemical aptasensor is also included.

חומצה פתלית אסתר מחייב DNA Aptamer ובחירת, אפיון, ליישום Aptasensor אלקטרוכימי

Phthalic acid esters (PAEs) areone of the major groups of persistent organic pollutants. The group-specific detection of PAEs is highly desired due to the ...

Chemistry

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

שימוש בתרמופורזה מיקרומטרית למדידת אינטראקציות בין חלבון לליפיד

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target protein. Due to its several advantages over monoclonal antibodies, aptamer development has gained enormous popularity among cancer researchers. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) is the most common method of developing aptamers specific for proteins of interest. Following SELEX, a quick and efficient binding assay accelerates the process of identification, confirming the selectivity and specificity of the aptamer. 
This paper explains a step-by-step flow cytometric-based binding assay of an aptamer specific for epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM). The transmembrane glycoprotein EpCAM is overexpressed in most carcinomas and plays roles in cancer initiation, progression, and metastasis. Therefore, it is a valuable candidate for targeted drug delivery to tumors. To evaluate the selectivity and specificity of the aptamer to the membrane-bound EpCAM, EpCAM-positive and -negative cells are required. Additionally, a non-binding EpCAM aptamer with a similar length and 2-dimensional (2D) structure to the EpCAM-binding aptamer is required. The binding assay includes different buffers (blocking buffer, wash buffer, incubation buffer, and FACS buffer) and incubation steps. 
The aptamer is incubated with the cell lines. Following the incubation and washing steps, the cells will be evaluated using a sensitive flow cytometry assay. Analysis of the results shows the binding of the EpCAM-specific aptamer to EpCAM-positive cells and not the EpCAM-negative cells. In EpCAM-positive cells, this is depicted as a band shift in the binding of the EpCAM aptamer to the right compared to the non-binding aptamer control. In EpCAM-negative cells, the corresponding bands of EpCAM-binding and -non-binding aptamers overlap. This demonstrates the selectivity and specificity of the EpCAM aptamer. While this protocol is focused on the EpCAM aptamer, the protocol is applicable to other published aptamers.

A necessary step in anticancer aptamer development is to test its binding to the target. We demonstrate a flow cytometric-based assay to study this binding, emphasizing the importance of including a negative control aptamer and cancer cells that are positive or negative for that particular protein.&#160;

בדיקת קשירה של חלבון פני התא המבוסס על ציטומטריה של זרימה להערכת סלקטיביות וספציפיות של אפטמר אנטי-סרטני

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Cancer Research

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified through an in vitro selection process called Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) to recognize a wide variety of targets, from small molecules to proteins and other macromolecules 2-4. Aptamers have properties that are well suited for in vivo diagnostic and/or therapeutic applications: Besides good specificity and affinity, they are easily synthesized, survive more rigorous processing conditions, they are poorly immunogenic, and their relatively small size can result in facile penetration of tissues.
Aptamers that are identified through the standard SELEX process usually comprise ~80 nucleotides (nt), since they are typically selected from nucleic acid libraries with ~40 nt long randomized regions plus fixed primer sites of ~20 nt on each side. The fixed primer sequences thus can comprise nearly ~50% of the library sequences, and therefore may positively or negatively compromise identification of aptamers in the selection process 3, although bioinformatics approaches suggest that the fixed sequences do not contribute significantly to aptamer structure after selection 5. To address these potential problems, primer sequences have been blocked by complementary oligonucleotides or switched to different sequences midway during the rounds of SELEX 6, or they have been trimmed to 6-9 nt 7, 8. Wen and Gray 9 designed a primer-free genomic SELEX method, in which the primer sequences were completely removed from the library before selection and were then regenerated to allow amplification of the selected genomic fragments. However, to employ the technique, a unique genomic library has to be constructed, which possesses limited diversity, and regeneration after rounds of selection relies on a linear reamplification step. Alternatively, efforts to circumvent problems caused by fixed primer sequences using high efficiency partitioning are met with problems regarding PCR amplification 10.
We have developed a primer-free (PF) selection method that significantly simplifies SELEX procedures and effectively eliminates primer-interference problems 11, 12. The protocols work in a straightforward manner. The central random region of the library is purified without extraneous flanking sequences and is bound to a suitable target (for example to a purified protein or complex mixtures such as cell lines). Then the bound sequences are obtained, reunited with flanking sequences, and re-amplified to generate selected sub-libraries. As an example, here we selected aptamers to S100B, a protein marker for melanoma. Binding assays showed Kd s in the 10-7 - 10-8 M range after a few rounds of selection, and we demonstrate that the aptamers function effectively in a sandwich binding format.

SELEX protocols comprise multiple rounds of selection, each of which require regeneration of bound ligands, which in turn require fixed primer sequences flanking the random library regions. These fixed primer sequences can interfere with the selection process (false positives and negatives). Here we present a primer-free protocol.

פריימר ללא aptamer לבחירה באמצעות ספריית ה-DNA אקראיים

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Biology

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for application. Due to the drastic differences between the aptamer and small molecules, scientists need to put much effort into characterizing their binding properties. Isothermal Titration Calorimetry (ITC) is a powerful approach for this purpose. ITC goes beyond determining disassociation constants (Kd) and can provide the enthalpy changes and binding stoichiometry of the interaction between two molecules in the solution phase. This approach conducts continuous titration using label-free molecules and records released heat over time upon the binding events produced by each titration, so the process can sensitively measure the binding between macromolecules and their small targets. Herein, the article introduces a step-by-step procedure of the ITC measurement of a selected aptamer with a small target, tetracycline. This example proves the versatility of the technique and its potential for other applications.

The present protocol describes the use of Isothermal Titration Calorimetry (ITC) to analyze the association and dissociation kinetics of the binding between a DNA aptamer and tetracycline, including sample preparation, running standards and samples, and interpreting the resulting data.

קביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Aptamer-Based Target Detection Facilitated by a 3-Stage G-Quadruplex Isothermal Exponential Amplification Reaction

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules with signal-generation capability. For the system described herein, target recognition through an aptameric domain, Stem II of a modified hammerhead ribozyme, activates the self-cleaving ribozyme by stabilizing the initially unstructured construct. The cis-cleaving RNA acts at the junction of Stem III and Stem I, creating two cleavage products. The longer cleavage product primes an isothermal exponential amplification reaction (EXPAR) of the two similar catalytically active G-quadruplexes. Those resulting amplification products catalyze peroxidase reduction, which is coupled to the reduction of a colorimetric substrate with an output that the naked eye can detect. The 3-part system described in the present study improves detection modalities such as enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) by producing a visually detectable signal for indicating the presence of as low as 0.5 &#181;M theophylline in as little as 15 min.

The present protocol demonstrates the use of a fast, 3-stage, aptamer-based exponential amplification assay to detect targets. Sample preparation, signal amplification, and color development are covered to implement this system to recognize the presence of theophylline over that of caffeine.

זיהוי מטרות מבוסס Aptamer המתאפשר על ידי תגובת הגברה מעריכית איזותרמית G-Quadruplex תלת-שלבית

Aptamers are target-recognition molecules that bind with high affinity and specificity. These characteristics can be leveraged to control other molecules ...

Bioengineering

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Differential Scanning Calorimetry to Study DNA Aptamer-Thermolabile Ligand Interaction

Source: Mittermaier, A. K., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55959">Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates differential scanning calorimetry &#8212; a technique to study the interaction between a biomolecule and a ligand. The binding of a DNA aptamer and a thermolabile ligand is studied by applying repeated heating and cooling cycles to the sample and obtaining scans for thermodynamic analysis.

סריקה דיפרנציאלית קלורימטריה לחקר DNA Aptamer-Thermolabile Ligand אינטראקציה

Source: Mittermaier, A. K., et al. Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions. ...