Name: a simple way to measure alterations in reward-seeking behavior using drosophila melanogaster
Uploaded: 2016-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
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Agradecemos U. Heberlein e A. Devineni para discussões de longa duração e assessoria técnica. Agradecemos também aos membros do laboratório Shohat-Ophir, A. Benzur, L. Kazaz, e O. Shalom, pela ajuda em demonstrar o método. Um reconhecimento especial vai para Eliezer Costi para o estabelecimento dos sistemas de mosca no laboratório. Este trabalho foi apoiado pelo Israel Science Foundation (384/14) e Marie Curie carreira Bolsas de Integração (CIG 631.127).

Nota: Visão geral do desenho experimental: O delineamento experimental inclui um protocolo adaptado para a supressão de corte 7-9 em que as moscas macho são expostos a experiências gratificantes e nonrewarding em 3 sessões de treino consecutivas ao longo de 4 d. No final da fase de experiência, as moscas são testados num ensaio de consumo voluntário de etanol em duas escolha para 3-4 d. O protocolo aqui inclui vários passos preparatórios, alguns dos quais pode ser efectuada previamente, para ser utilizado em mais do que uma experiência, enquanto outros devem ter lugar de uma forma atempada, antes do início da experiência (Tabela 1). 1. Passos preparatórios <ol><li> Preparando o sistema de alimentação capilar <ol><li> Aquece-se uma agulha G 27, e usá-lo para perfurar pequenos orifícios ao longo de um frasco (Figura 1). </li><li> Cortar o bujão do frasco de metade (transversalmente), utilizando uma lâmina de barbear. Mark quatro pontos sobre a superfície do bujão, criando um square forma a posicionar os suportes em capilares. Utilize uma agulha de 18 G para fazer orifícios 4 através do tampão (Figura 1b). </li><li> Usar uma lâmina de barbear para cortar micropipetas de modo que eles podem segurar firmemente capilares de vidro 5? L, que servem como adaptadores. </li><li> Insira 4 adaptadores capilares nos plugues preparadas. </li><li> Marque a posição dos 2 etanol- e dois capilares contendo nonethanol sobre a ficha. Nota: Recomenda-se manter as posições dos 2 tipos de capilares consistentes em todos os frascos. Prestar atenção ao tamanho dos furos, como grandes furos permitem a fuga de moscas fora dos frascos. Além disso, é recomendável usar o lado mais liso da ficha (normalmente oposto ao lado de corte) como o lado que está voltado para baixo quando inserida para dentro do frasco, como o corte do tampão cria algumas fibras pequenas, soltas que as moscas podem ficar presos em . </li><li> Preparar um grande número de tubos de ensaio e adaptadores a serem usados ​​para o sistema de alimentação capilar (CAF)experiências descritas no passo 2.3. </li></ol></li><li> Preparando frascos de alimentos em pequena vidro <ol><li> Um dia antes de coletar as moscas (passo 1.4), arranjar 200 frascos de vidro em prateleiras tubo de microcentrífuga. Melt voar alimentos (de acordo com a receita melaço de farinha de milho, consulte a Tabela de Materiais), utilizando um forno de microondas. Despeje 2 mL de alimentos voar em frascos de vidro (tentar não manchar a comida nas paredes do frasco). Deixe a endurecer comida, e cobrir os frascos com filme plástico. NOTA: Os frascos de vidro contendo o alimento pode ser mantida a 4 ° C durante várias semanas. </li><li> No dia da coleta de mosca, dê os frascos fora da geladeira e deixá-los chegar RT antes de usá-los para abrigar moscas. NOTA: Se frascos de alimentos são várias semanas de idade, certifique-se de que a comida ainda está intacto e não separado do frasco, como as moscas podem ser presos nas fendas entre a comida e o vidro. </li></ol></li><li> Fazendo solução estoque de alimentos para o ensaio de alimentação capilar <ol><li> para prépare a solução estoque de alimentos (5% de sacarose e 5% de extracto de levedura), dissolve-se 5,88 g de extracto de levedura e 5,88 g de sacarose em 100 ml de água destilada. Nota: A solução estoque é altamente propenso à contaminação. Portanto, recomenda-se a autoclave lo (121 ° C, 30 min, e sem um ciclo de secagem) e alíquota de 850 uL em que alíquotas de trabalho para ser mantida a 4 ° C até uso posterior. A concentração de ingredientes na solução estoque é 5,88% e irá atingir a concentração final de 5% após a adição de 15% de etanol ou de água (150 uL em 850 uL de solução de alimentos premade) imediatamente antes da sua utilização no passo 2.3. </li></ol></li><li> Coletando moscas experimentais <ol><li> Colete 200 moscas macho naive usando uma almofada de CO 2. Nota: Use qualquer estirpe de laboratório relevante para a questão experimental. 250 moscas podem ser facilmente coletadas de cinco garrafas de moscas na sua fase de eclosão escolha. Ao coletar as moscas, prestar muita atenção ao colmoscas onar que eclosed recentemente (moscas-olhando virgens: moscas brilhantes, com um ponto de mecônio em seu abdômen). moscas experimentais devem ser mantidos individualmente em pequenos frascos de vidro contendo alimentos e envelhecida a 3-4 d velho antes de ser utilizado na experiência. </li><li> Use tampões macios para fechar os frascos. Observação: O mesmo plugues macios será muito útil para a fase de treinamento, quando por meio de aspiração boca para inserir as fêmeas para dentro e fora dos frascos durante a fase de experiência. </li></ol></li><li> Coletando moscas instrutor NOTA: Todas as moscas recolhidos devem ser mantidos em um 12 h / 12 h de luz / obscuridade incubadora a 25 ° C e 70% de umidade relativa (UR). A 12 h / 12 h de luz / escuro de ciclo pode ser alterado para um tempo de partida conveniente. <ol><li> moscas instrutor de fêmeas virgens <ol><li> Colete 500 virgem instrutor fêmea voa a partir de um estoque WT ou um estoque virginator para uso como fêmeas receptivas virgens. Mantenha as moscas fêmeas em grupos de 25 por de tamanho regular frasco alimentos, e todosow-los à idade de 3-4 d idade antes de os utilizar no experimento. </li></ol></li><li> Acasaladas moscas instrutor do sexo feminino <ol><li> Colete 300 moscas fêmeas virgens de um estoque WT ou um estoque virginator se submeter acasalamento antes da fase de treinamento (passo 1.6.1). NOTA: moscas fêmeas são mantidos em grupos de 10 fêmeas por frasco de tamanho regular de alimentos e envelhecida a 3-4 d velho antes de ser utilizado na experiência. </li></ol></li><li> moscas macho usado para gerar moscas instrutor do sexo feminino acasalados <ol><li> Colete 150 moscas macho (não necessariamente virgem). NOTA: As moscas são mantidos em grupos de 15 machos por frasco de alimentos de tamanho regular e envelhecido ao 3-4 d idade antes de ser emparelhado com a fêmea virgem voa para criar as fêmeas acasaladas instrutor. </li></ol></li></ol></li><li> Gerando moscas fêmea instrutor acasaladas <ol><li> Para gerar feminina acoplado voa para ser usado como formadores, grupos de pares de 10 do sexo feminino virgem voa com 15 do sexo masculino voa lançando um frasco contendo macho em uma fêmea-Containing frasco 16-18 h antes da fase de treinamento (passo 2.1) 10. NOTA: Este deve normalmente ter lugar na noite antes da sessão de treino. A 1.5: 1 relação entre o macho voa para moscas fêmeas assegura que todas as mulheres será acoplado. </li><li> No dia da experiência, separar as fêmeas acasaladas dos machos por aspiração os machos para fora do frasco utilizando um aspirador de boca. Realizar esse direito antes do início de cada dia de treinamento. </li></ol></li></ol> 2. Passos Experimentais <ol><li> Configurando a fase de experiência <ol><li> Iniciar a experiência o mais próximo possível para o início da fase de luz na incubadora. Coloque as fêmeas instrutor (ambos virgens e acasaladas) na câmara de comportamento. NOTA: Recomenda-se a realizar o experimento em uma câmara de comportamento, ou em qualquer ambiente isolado que é calmo e definido para 25 ° C e 60 - 65% RH. Mantendo a umidade acima de 50% é muito importante, uma vez que o comportamento de corte e acasalamentos depender de detecção de feromonas, que é conhecido por ser sensível à humidade. </li></ol></li><li> Expondo moscas macho para experiências gratificantes e nonrewarding <ol><li> Disponha os frascos de vidro contendo as moscas macho individuais em prateleiras de microcentrífuga, posicionando os frascos ao longo das margens do rack. NOTA: Este acordo permite o experimentador de observar facilmente os pares de moscas que se submetem a cópula sem levar os frascos fora do rack. </li><li> Prepare (conforme descrito na etapa 2.2.1) 2 grupos de 100 frascos de vidro contendo único macho voa em prateleiras separadas para homens submetidos a experiências de acasalamento gratificantes e nonrewarding (ou seja rejeitado e acasaladas). </li><li> fêmeas instrutor aspirado e adicioná-los a cada frasco contendo as moscas macho. Definir o temporizador para 1 h. Começando com o grupo rejeitado, adicionar uma fêmea acoplado a cada frasco. Em seguida, passar para os machos a serem acasaladas e adicionar uma fêmea virgem a cada frasco. </li><li> Observe atentamente os encontros de acasalamentopara certificar-se de que os machos que interagem com fêmeas virgens acasalar com sucesso dentro da primeira hora e que os machos que interagem com as fêmeas acasaladas anteriormente não acasalar. Para monitorar a coorte rejeitada no decurso de 1 h, defina um segundo temporizador durante 15 min e assistir os machos a cada 15 min. </li><li> Descarregar os machos da coorte rejeitou que conseguiu acasalar e os homens da coorte acoplado que não terminou até o acasalamento até o final da primeira sessão de treinamento. </li><li> Terminar a primeira sessão de treinamento, aspirando os formadores do sexo feminino anteriormente acasalados em um frasco regulares mosca comida, e mantê-los para a próxima sessão condicionado. Siga este passo, aspirando suavemente as fêmeas do grupo masculino acoplado. </li><li> Deixe as moscas descansar por 1 hora. </li><li> Repita os passos 2.2.3 - 2.2.7 duas vezes. </li><li> Repita o treino nas etapas 2.2.3 - 2.2.8 todos os dias por mais 3 d. </li></ol></li><li> Gravação de consumo (CAFE) <ol><li> No final do último EstadoEmg sessão (quarto dia), aspirar os homens solteiros e agrupá-los em frascos de alimentação capilar. Use um plug macio para cobrir o frasco de alimentação capilar ao inserir as moscas, e substituí-lo rapidamente com o capilar plugue alimentador de ready-made, após ter sido inserido todas as moscas. Grupo 6 - 8 moscas de cada um dos grupos experimentais para um frasco, criando não menos do que 8 frascos por condição. </li><li> Molhar os tampões suavemente adicionando 5 ml de água para a parte superior do obturador. Tenha cuidado ao adicionar a água para evitar o derramamento nos frascos. Adicionar igual volume de água a cada frasco. NOTA: Este passo é feito para reduzir a evaporação dos capilares. Portanto, é repetida todos os dias durante o resto da experiência. Dependendo da humidade relativa, os dias seguintes podem requerer menos água a ser adicionada para as velas. </li><li> Preparar duas soluções alimentares separadas por adição de etanol ou água para as alíquotas de estoque de alimentos para criar uma concentração final de 15%. </li><li> Para preencher o capillAries com as duas soluções de alimentos, criação de 5 uL de alimentos líquidos em gotas uma tira de filme de laboratório e permitir que a solução para encher o capilar até que ele atinja a marca de 5 uL. Certifique-se de usar o fim claro do capilar, que é perto da linha de marca preta 5 mL. NOTA: Para encher vários capilares de uma só vez, é possível ligar 6 - 8 adaptadores capilares em conjunto e utilizá-los como uma inserção para segurar os capilares. </li><li> Toque os capilares suavemente na faixa de parafina para posicionar a solução alimentar exatamente na marca preta. Selar os capilares por imersão do final de cada capilar em pequenas gotas de óleo mineral. Este passo minimiza o potencial de evaporação da solução de alimentação. </li><li> Inserir dois capilares contendo etanol e dois capilares nonethanol contendo através dos adaptadores 4 / detentores na ficha até os lados expostos dos capilares apenas espreitar a partir do interior do frasco (1 mm ou menos a partir da superfície do bujão). NOTA:Manter a abertura dos capilares perto do plugue molhada reduz a evaporação e permite fácil acesso aos alimentos, como moscas normalmente sentar-se sobre as fichas e desça na capilar exposto para se alimentar. </li><li> Além de frascos que contêm moscas experimentais, prepare um frasco simulada sem moscas. Este controlo serve para avaliar evaporação natural. NOTA: Tente manter relativamente igual posicionamento da abertura capilar em comparação com as velas, como as diferenças podem levar à evaporação variável e enganosa dados de consumo. Manter a umidade adequada durante o experimento e posicionar as aberturas capilares, tanto quanto possível para o plug molhado, como baixa umidade e grande distância entre o plug molhado pode tanto resultar em evaporação descontrolada. </li><li> Grave a posição relativa do líquido em cada um dos vasos capilares no que diz respeito à linha de marca negra em milímetros com uma régua, e escrever esses valores para baixo. NOTA: Se a solução está posicionada exatamente no l pretoINE, o valor deve ser igual a zero, e se ele for superior ou inferior, que deve ser valores positivos ou negativos, respectivamente. Os níveis iniciais do líquido definir os pontos de referência para os valores de consumo final, o / n. </li><li> Definir os frascos de volta na incubadora durante 24 h. Substituir os capilares numa altura constante ao longo de toda a experiência. </li><li> Remover os capilares suavemente a partir dos frascos e medir os níveis de líquido no que diz respeito à linha de marcação preta. </li><li> Verifique cuidadosamente o nível do líquido no frasco simulada. NOTA: Se os níveis caíram mais de 2 mm, isso indica que a evaporação é alta e os níveis de consumo não são confiáveis. </li><li> Amortecer as fichas cuidadosamente com 2 ml de água e inserir um novo conjunto de capilares, como indicado nos passos 2.3.3 - 2.3.10. Definir os frascos de volta na incubadora durante 24 h. </li></ol></li><li> determinando preferências <ol><li> Calcule o consumo total de cada capilar subtraindo-se o nível final do inível nitial no ponto de partida. </li><li> Combinar os valores de ambos os capilares com o mesmo alimento (isto é, nonethanol capilares separadamente dos capilares contendo etanol). </li><li> Calcular preferência etanol, subtraindo a quantidade consumida a partir dos capilares não-etanol a partir da quantidade consumida a partir dos capilares contendo etanol e dividir o valor por os valores de consumo total de todos os capilares do mesmo frasco. </li><li> Calcular a média dos índices de preferência de todos os frascos do mesmo grupo experimental. <img alt="equação1" src="/files/ftp_upload/54910/54910equation1.jpg" /> NOTA: Nonethanol 1 (NE1), Nonethanol 2 (NE2), Etanol 1 (E1), Etanol 2 (E2), nonethanol Total (NE Total) = NE1 + NE2, etanol Total (E Total) = E1 + E2, soma total Índice de consumo (total Soma) = total NE + total e, e Etanol preferência (PI) </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Here, we illustrate the details of an integrated approach to measure alterations in reward-seeking behavior, based on previous work described by Devineni et al.6 and Shohat-Ophir et al5. The first section of the protocol uses different types of sexual interactions as the experience input, and the second section uses a two-choice feeding assay to assess the effect of experience on the preference to consume ethanol.
As shown by Devineni et al.6, ethanol self-administration in flies is a robust behavior, characterized at first by low and variable preference that increases and becomes more consistent over time. The developing preference may reflect a process through which flies learn to associate the pharmacological effect of ethanol with its position, in spite of its unpleasant taste6 and the aversive responses known to occur during initial exposure to ethanol vapors11. Changing the position of the ethanol-containing capillary on a daily basis results in a constant level of preference, strongly demonstrating the role of learning and suggesting that the flies leave chemical cues next to the preferred capillaries12. In addition, the shape, the slope, and the starting point of the preference curve can be slightly different between experiments, but the overall magnitude of difference between the groups of flies that are exposed to rewarding and non-rewarding experiences is preserved across experiments.
The question of whether flies display preference to consume ethanol for its caloric value or pharmacological properties is still under debate and was examined in the last few years by several independent studies (for a review, see Devineni et al.)13. Taking into account the results obtained from these studies, it is likely that the caloric value of ethanol contributes to the pharmacological effect of ethanol and is not the main reason for the development of preference to consume ethanol.
As this protocol reflects voluntary consumption in groups of flies, the technique is limited to cumulative changes in consumption over at least several hours and is not sensitive enough to reflect short temporal changes in consumption over short time frames (minutes). Other feeding assays, such as FLIC14, flyPAD15, and EXPRESSO16, that can measure the frequency of feeding events and their bout length are technologically superior to the CAFE assay and can therefore provide high-content temporal data of feeding and ethanol preference. Still, compared to other simple two-choice assays that are based on measuring the ingestion of food mixed together with food dyes, the CAFE approach allows the accurate and uninterrupted monitoring of consumption data over several days17,18.
Although described together, each section can be used separately in future applications. The training phase can be used for further downstream analyses of plasticity-related events using real-time PCR, RNAseq, proteomic, and metabolomic screens. Following the training phase, it is also possible to use FLIC14, flyPAD15, or EXPRESSO16 to achieve higher resolution in the consumption data. The two-choice ethanol consumption assay can also serve to study the effect of other external stimuli, such as stress, on the internal state19,20. Additionally, using neurogenetic tools that control neuronal activity as an input experience and ethanol consumption as an output behavior, it can be used to dissect the neuronal circuits that encode internal reward.
Even though the described protocol is relatively simple and does not require sophisticated equipment, there are critical steps that require the most attention to ensure reproducible results. First, it is important to start the experiment with large male flies that eclosed from healthy fly bottles. Secondly, it is essential to make sure that the mated cohort indeed undergo mating and that the rejected cohort do not manage to mate. Lastly, it is important to maintain a well-humidified environment for the entire experiment, with an emphasis on the consumption part. This includes watering the plugs every day with equal amounts of water and keeping the capillary ends in close proximity to the wet plugs.

Modificação do comportamento em resposta à experiência permite animais para ajustar seu comportamento às mudanças no seu ambiente 1. Durante este processo, os animais integrar o seu estado fisiológico interno com as condições variáveis ​​do ambiente externo e, posteriormente, escolher uma ação sobre o outro para aumentar suas chances de sobrevivência e reprodução. Sistemas de recompensa evoluído para motivar comportamentos que são necessários para a sobrevivência dos indivíduos e das espécies, reforçando comportamentos que aumentam a sobrevivência imediata, como comer ou beber, ou aqueles que garantir a sobrevivência a longo prazo, tais como o comportamento sexual ou cuidar de filhos 2. Compostos artificiais como drogas de abuso também afetam os sistemas de recompensa por vias neurais cooptação que medeiam recompensas naturais 2. Durante as duas últimas décadas, a mosca da fruta Drosophila melanogaster tem sido estabelecido como um modelo para estudar o promissor Molecular e mecanismos neuronais que estão moldando os efeitos do etanol sobre o comportamento 3,4. Anteriormente, nós identificamos um subconjunto de neurônios peptidérgicas em moscas (receptor NPF / NPF (R) neurônios) que o casal recompensas naturais, como a experiência sexual, para a motivação de obter recompensas de droga 5. expressão NPF é sensível a ambas as experiências sexuais e recompensas de drogas, tais como a intoxicação por etanol. Alterações nos níveis de expressão NPF são convertidos em alterações em etanol auto-administração 5, onde a alta NPF reduz e baixa NPF aumenta a preferência para consumir etanol. Ativando neurônios NPF é gratificante para as moscas, como eles exibem forte preferência por um odor emparelhado com a ativação, o que também é refletido pelo consumo de etanol reduzida. Mais importante ainda, a activação de neurónios NPF interfere com a capacidade das moscas de modo a formar uma associação positiva entre a intoxicação etanol e um taco de odor. O nexo de causalidade entre o NPF / Rsistema, a memória recompensa, e o consumo de etanol sugere que é possível utilizar etanol auto-administração como uma medida para alterações nos estados de recompensa 5. Nesta publicação, demonstrar uma abordagem integrada para explorar o sistema de recompensa natural, mosca e mudanças ensaiar em estados de recompensa. A abordagem consiste em duas peças separadas, um protocolo de treino para manipular experiências naturais relacionados com a recompensa, seguido por um ensaio de alimentação capilar de dois escolha (CAF) etanol para avaliar a auto-administração como uma estimativa para alterações nos estados de recompensa. O ensaio CAFE é análogo aos ensaios de escolha de dois garrafa utilizados em estudos com roedores para a droga auto-administração e foi mostrado para reflectir determinadas propriedades de comportamento de dependência, como em moscas 6.

<table><tbody><tr><td>Polystyrene 25 x 95 mm Vials</td><td>FlyStuff</td><td>32-109</td><td></td></tr><tr><td>narrow plastic vials flugs</td><td>FlyStuff</td><td>42-102</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Sterile Needle 18 G and 27 G&amp;nbsp;</td><td>can be acquired by any company</td><td></td><td>1.20 X 38 mm (18 G x 1 1/2&quot;) , 0.40 X 13 mm (27 G x 1/2&quot;)</td></tr><tr><td>10 x 75 mm Borosilicate Glass Disposable Culture Tubes</td><td>kimble chase</td><td>73500-1075</td><td></td></tr><tr><td>calibrated pipets 5 &amp;#956;L</td><td>VWR</td><td>53432-706</td><td>color coded white to contain 5 &amp;#956;L</td></tr><tr><td>Mineral Oil&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose, Molecular Biology Grade</td><td>CALBIOCHEM</td><td>573113</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract Powder for microbiology</td><td>can be acquired by any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>standard pipette Tips (micro-pipetts)</td><td>ThermScientific</td><td>T114R-Q</td><td>volume: 0.1 - 20 &amp;#956;L (ultramicro)</td></tr><tr><td>IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs)</td><td>Jaece</td><td>L800-A</td><td>fits opening 6 - 13 mm</td></tr><tr><td>IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs)</td><td>Jaece</td><td>L800-D</td><td>fits opening 35 - 45 mm</td></tr><tr><td>virginator fly stock&amp;nbsp;</td><td>bloomington drosophila stock center</td><td>#24638</td><td></td></tr><tr><td>Narrow Vials, Tray Pack (PS)</td><td>Genesee Scientific Corporation</td><td>&amp;nbsp;# 32-109BR</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Media Recipes and Methods</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm</td><td></td></tr><tr><td>propionic acid</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>phosphoric acid</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>W290017</td><td></td></tr><tr><td>Methl 4-Hydroxybenzoate</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H3647</td><td></td></tr><tr><td>Agar Agar</td><td>can be acquired by any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>corn meal</td><td>can be acquired by any company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grandma&#039;s molasses</td><td>B&amp;amp;G Foods, Inc</td><td>not indicated</td><td></td></tr><tr><td>instant dry yeast</td><td>can be acquired by any company</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a simple way to measure alterations in reward-seeking behavior using drosophila melanogaster

Nós descrevemos um protocolo para a medição do etanol auto-administração em moscas da fruta (Drosophila melanogaster) como um proxy para mudanças nos estados de recompensa. Nós demonstramos uma forma simples de explorar o sistema de recompensa mosca, modificar experiências relacionadas a recompensa natural, e use o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa. A abordagem serve como uma importante ferramenta para estudar os neurônios e genes que desempenham um papel nas mudanças mediada por experiência de estado interno. O protocolo é composto de duas partes distintas: expor as moscas para experiências gratificantes e nonrewarding, e ensaiando o consumo voluntário de etanol como uma medida da motivação para obter uma recompensa de droga. As duas partes podem ser utilizadas de forma independente para induzir a modulação da experiência como um passo inicial para mais ensaios a jusante ou como um ensaio de alimentação de duas escolha independente, respectivamente. O protocolo não requer uma instalação complicada e, portanto, pode ser aplicada em qualquer LABORATORY com ferramentas básicas de cultura de mosca.

FPreviously, Devineni et ai. mostrou que, quando as moscas de fruta são dadas a opção de consumir alimentos contendo etanol, eles exibem uma forte preferência por alimentos contendo etanol sobre nonethanol contendo alimentos 6. Mostrado aqui estão alguns resultados representativos que obtivemos quando se examina a preferência etanol inato de moscas macho ingênuos que não foram submetidos ao protocolo de treinamento. Naïve Canton S moscas macho foram recolhidas na altura da eclosão, envelhecido até 4 dias de idade, e ensaiadas quanto à sua preferência inata para consumir etanol ao longo de 4 d (Figura 2). Analisando as quantidades consumidas de soluções mostra a etanol e contendo nonethanol que voa exibem uma preferência forte para consumir 15% de alimentos etanol sobre alimentos nonethanol (Figura 2). Usando oposição sexualexperiências, já anteriormente demonstrado que as moscas macho que foram autorizados a acasalar em grupos display inferior preferência etanol do que os machos individualmente alojados que foram rejeitadas pelas fêmeas previamente acasaladas ( &quot;rejeitado isolada&quot;) ( &quot;-agrupados acasalado&quot;). Usamos vários controles para desacoplar a experiência de habitação a partir da experiência relacionadas com o acasalamento e mostrou que a preferência diferencial resulta da experiência de acasalamento 5. Usando o protocolo de treinamento descrito aqui, geramos sozinhos-acasaladas e rejeitou moscas macho que foram submetidos a regimes de habitação e de acasalamento semelhantes. Único macho moscas Canton S foram submetidos ao longo de 4 d para experiências de acasalamento díspares. Um grupo de homens foi autorizado a interagir e acasalar com moscas fêmeas virgens (única coorte acoplado), eo outro grupo foi treinado com moscas fêmeas previamente acasaladas (única coorte rejeitado). Após a fase de treinamento, os únicos machos froM a duas coortes foram agrupados (8 / frasco) e colocados nos frascos de alimentação capilar; o seu consumo voluntário de etanol foi registada durante 4 d (Figura 3A). A preferência para consumir etanol foi calculada a partir dos dados de consumo através da fórmula na etapa 2.4 (Figura 3B). Os valores positivos indicam preferência por alimentos contendo etanol, e valores negativos indicam aversão à comida contendo etanol. O presente experimento apoia nossas descobertas anteriores, sugerindo que a experiência sexual, e não condição de moradia, modula o consumo de etanol. acasalamento bem-sucedido aumenta os níveis de recompensa internos, que por sua vez reduz o consumo de etanol. Rejeições, percebidos como uma falta de recompensa, levar a um aumento no comportamento de busca de recompensa (Figura 3B). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54910/54910fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. Representação esquemática do alimentador sistema capilar (CAFE). (A) Esquemas do frasco perfurada com furos para equilibrar a pressão e umidade. (B) Esquema do plug-corte em meia que serve como a base para a inserção dos capilares. (C) Esquema da forma e da localização das placas que servem para manter os vasos capilares. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54910/54910fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54910/54910fig2.jpg" /> Figura 2. Um Exemplo de preferência inata para consumir etanol. Naive machos WT foram agrupados em grupos de 8 machos / frasco, e o seu consumo de soluções e a etanol contendo nonethanol foram registados ao longo de 96 h. As moscas consumida uma quantidade maior de 15% de etanol contendg alimentos (** P &lt;0,01, *** p &lt;0,001, de duas vias medidas repetidas ANOVA com Bonferroni pós-testes, n = 8). Os dados apresentados são a média + SEM ou média - SEM. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54910/54910fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54910/54910fig3.jpg" /> Figura 3. Experiências de acasalamento Opposing mModulate Etanol preferência. (A) Representação esquemática do protocolo combinado. Individuais machos WT virgens são permitidos para acasalar com fêmeas virgens ou são submetidos a 3x sessões de treinamento de supressão de namoro 1h (descrito como &quot;T&quot;), espaçados por 1 h de descanso (descritos como &quot;R&quot;). A formação é repetida durante 4 d. No final de cada dia, as moscas são colocadas na incubadora (descrito como &quot;ON&quot;). Após 4 d de formação, os machos foram colocados em frascos de onde eles poderiam escolher para alimentar a partir decapilares contendo soluções alimentares com ou sem 15% de etanol. (B) Single rejeitado machos apresentaram maior preferência etanol do que os machos acasalaram individuais (** P &lt;0,01, de duas vias para medidas repetidas ANOVA com Bonferroni pós-testes, n = 9, as comparações são entre os grupos de tratamento em toda a 3 d após o fim do Treinamento). Os dados apresentados são a média + SEM ou média - SEM. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54910/54910fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Seção de Referência </td><td> notas </td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> Pode ser utilizado em muitas experiências </td></tr><tr><td> 1.2 </td><td> Podem ser mantidas em 4 ° C, durante várias semanas </td></tr><tr><td> 1.3 </td><td> Tenha em 4 ° C após autoclave </td></tr><tr><td> 1.4 </td><td> Envelhecido a 3 - 4 d antessendo utilizado na experiência </td></tr><tr><td> 1,5 </td><td> Este passo deve ser realizado à noite antes de cada sessão de treinamento </td></tr><tr><td> 2.1 </td><td> Este passo deve ser realizado na manhã de cada sessão de treinamento </td></tr><tr><td> 2.2 </td><td> Para ser repetido em 3 sessões de treino consecutivas ao longo de 4 d </td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> Despejar os plugues com água, medir o consumo e substituir capilares ao longo de 4 d </td></tr><tr><td> 2.4 </td><td> Este passo é feito de cada vez, antes de substituir os capilares durante o ensaio de duas escolha </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Uma visão geral do protocolo que descreve a ordem e tempo de fluxo para os diferentes passos.

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A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Nós descrevemos um protocolo para induzir gratificante e nonrewarding experiências em moscas da fruta (Drosophila melanogaster), utilizando o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

a-simple-way-to-measure-alterations-reward-seeking-behavior-using

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

8.3K visualizações.  Bar-Ilan University.  Nós descrevemos um protocolo para induzir gratificante e nonrewarding experiências em moscas da fruta (Drosophila melanogaster), utilizando o consumo de etanol voluntária como uma medida de mudanças nos estados de recompensa. 

Vídeo: A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, and issues commands to start or stop feeding. Deciphering the processes underlying the decision-making of timely and moderate feeding carries major implications in our understanding of physiological and psychological disorders related to feeding control. Simple, quantitative, and robust methods are required to measure the food ingestion of animals after experimental manipulation, such as forcibly increasing the activities of certain target neurons. Here, we introduced dye-labeling-based feeding assays to facilitate the neurogenetic study of feeding control in adult fruit flies. We review available feeding assays, and then describe our methods step-by-step from setup to analysis, which combine thermogenetic and optogenetic manipulation of neurons controlling feeding motivation with dye-labeled food intake assay. We also discuss the advantages and limitations of our methods, compared with other feeding assays, to help readers choose an appropriate assay.

Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila

Quantitative food-intake assays with dyed food provide a robust and high-throughput means to evaluate feeding motivation. Combining the food consumption assay with thermogenetic and optogenetic screens is a powerful approach to investigate the neural circuits underlying appetite in adult Drosophila melanogaster.

Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila

Food consumption is under the tight control of the brain, which integrates the physiological status, palatability, and nutritional contents of the food, ...

Comportamento

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Aprendizagem associativa apetitiva olfativa em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Neurociência

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Análise do comportamento de forrageamento induzido por açúcar em Drosophila

Tracking Sugar-Elicited Local Searching Behavior in Drosophila

Foraging behavior is essential for the survival of organisms as it enables them to locate and acquire essential food resources. In Drosophila, hunger triggers a distinct search behavior following the consumption of small quantities of a sugar solution. This report presents a simple experimental setup to study sugar-elicited search behavior with the aim of uncovering the underlying mechanisms. Minute quantities of concentrated sugar solution elicit sustained searching behavior in flies. The involvement of path integration in this behavior has been established, as flies utilize their trajectory to return to the sugar location. The most recent findings provide evidence of temporal modulation in the initiation and intensity of the search behavior after sugar intake. We have also used this setup for artificial activation of specific taste-receptor neurons in the pharynx, which elicits the search behavior. The Drosophila neurogenetic toolkit offers a diverse array of tools and techniques that can be combined with the sugar-elicited search behavior paradigm to study the neural and genetic mechanisms underlying foraging. Understanding the neural basis of hunger-driven searching behavior in flies contributes to the field of neurobiology as a whole, offering insights into the regulatory mechanisms that govern feeding behaviors not only in other organisms but also in humans.

Autor em destaque: explorando caminhos comportamentais por meio de insights entre espécies em forrageamento e comunicação

This protocol describes a behavioral assay for recording sugar-elicited search behavior using Drosophila melanogaster. The assay can be utilized to study feeding and foraging-related behaviors, as well as the underlying neuronal mechanisms.

Rastreando o comportamento de busca local provocado pelo açúcar em Drosophila

Foraging behavior is essential for the survival of organisms as it enables them to locate and acquire essential food resources. In Drosophila, hunger ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Usando a<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

High Throughput Ensaio para examinar Preferências de postura de Pessoa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, reductionist, and scalable system for in-depth investigation of motivation using the mating drive of male Drosophila&#160;melanogaster (Drosophila), the methods for which we detail here. The behavioral paradigm centers on the finding that male mating drive decreases alongside fertility over the course of repeated copulations and recovers over ~3 d. In this system, the powerful neurogenetic tools available in the fly converge with the genetic accessibility and putative wiring diagram available for sexual behavior. This convergence allows rapid isolation and interrogation of small neuronal populations with specific motivational functions. Here we detail the design and execution of the satiety assay that is used to measure and alter courtship motivation in the male fly. Using this assay, we also demonstrate that low male mating drive can be overcome by stimulating dopaminergic neurons. The satiety assay is simple, affordable, and robust to influences of genetic background. We expect the satiety assay to generate many new insights into the neurobiology of motivational states.

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

This article describes a behavioral assay that uses male mating drive in Drosophila melanogaster to study motivation. Using this method, researchers can utilize advanced fly neurogenetic techniques to uncover the genetic, molecular, and cellular mechanisms that underlie this motivation.

Uma maneira simples para medir alterações na Recompensa comportamento de busca Usando

Resumo

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Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila

Aprendizagem associativa apetitiva olfativa em

A Single-fly Ensaio para comportamento de forrageamento em

Rastreando o comportamento de busca local provocado pelo açúcar em Drosophila

Rastreando o comportamento de busca local provocado pelo açúcar em Drosophila

Rastreando o comportamento de busca local provocado pelo açúcar em Drosophila

De alta resolução Quantificação do Comportamento Odor-guiada em

High Throughput Ensaio para examinar Preferências de postura de Pessoa

O capilar alimentador ensaio mede ingestão alimentar em

Medir e alterando Acasalamento Drive em Male