Name: observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus
Uploaded: 2016-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus at JoVE.com

Najie Zhu e Liqun Bai contribuíram igualmente para este trabalho. Este trabalho foi financiado pelo Fundo Especial para Pesquisa Científica Florestal na Public Welfare (201204501) ea National Science Foundation Natural da China (31170604, 31270688 e 31570638). Agradecemos ao Dr. Holighaus Gerrit e Dr. Danielle Hickford por suas sugestões úteis sobre Inglês escrito.

1. Aquisição de Virgin Adulto Nematóides <ol><li> Pinewood isolado nematóide e condições de cultura NOTA: O B. xylophilus isolar Nxy61 foi originalmente extraído de uma massoniana Pinus doente na área de Ningbo, província de Zhejiang, na China. <ol><li> Prepare Potato Dextrose Agar (PDA, consulte a Tabela de Materiais) placas para o cultivo de Botrytis cinerea. </li><li> Para inoculação, perfurar um pedaço de tapete de fungos com diâmetro de 10 mm a partir de um tapete de B. cinerea e colocá-lo no meio de uma nova placa de PDA. Cultura de B. cinerea por 5 d, a 25 ° C no escuro. </li><li> Cultura os nematóides de pinho em placa de Petri contendo preparado de B. cinerea a 25 ° C no escuro. </li></ol></li><li> Aquisição de B. xylophilus ovos <ol><li> Coloque um tubo de borracha fixada abaixo de um funil e prender o funil preparado em um rack para montar oaparelho de funil de Baermann. Colocar duas camadas de papel de filtro em vez de gaze na boca do funil. </li><li> Transferir as culturas de fungos com a configuração de funil e adicionar água até o tapete fúngico está imerso. Aguarde 2 h, e nematóides vai sair a partir da cultura fúngica, atravessar o papel de filtro, e se estabelecer na parte mais baixa do funil de Baermann. </li><li> Reunir o primeiro par de gotas de água a partir do fundo do tubo para um tubo de 15 ml e recolher os nemátodos, libertando lentamente o grampo no tubo. </li><li> Centrifugar as colecções acima a 3000 xg durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover a camada superior da água com uma pipeta e ressuspender com 1 ml de estéril duplamente destilada (dd) H 2 O. </li><li> Com uma pipeta, transferir a ressuspensão de cima para um prato de Petri de vidro novo (6 cm de diâmetro). Adicionar 3 ml de estéril dd H2O para a placa de Petri para assegurar que os nemátodos são capazes de nadar livremente. </li><li> Mantenha os nematóides nos glass uma placa de Petri durante 10 minutos a 25 ° C no escuro. Os ovos serão estabelecidas por fêmeas grávidas. Devido à sua superfície a glicoproteína, os ovos serão agarradas ao fundo da placa de Petri de vidro. </li><li> Retire a água e vermes cuidadosamente, sem perturbar os ovos. Adicionar 3 ml de estéril dd H2O ao prato de Petri de vidro imediatamente para evitar que os ovos de secar. </li><li> Repetir o passo 1.2.8 3x para remover todas as larvas e adultos, e obter os ovos puro. Adicionar um extra de 2 ml (5 mL no total) de estéril dd H2O para a placa de Petri. </li></ol></li><li> Aquisição dos juvenis quarta-fase (larvas J4) <ol><li> Chocar os ovos recolhidos durante 24 horas no escuro a 25 ° C para se obter larvas J2. </li><li> Transferir as larvas J2 com uma pipeta para um tubo de 15 ml, de centrifugação a 3000 xg durante 2 min, e remover a camada superior da água. </li><li> Ressuspender as larvas J2 com 200 mL de estéril dd H2O, e depois transferi-los paraa placa PDA contendo B. cinerea. </li><li> Cultura das larvas J2, durante 52 h a 25 ° C no escuro. Neste ponto de tempo, a maioria das larvas J2 terão desenvolvido na fase inicial de larvas J4. </li></ol></li><li> Aquisição de nematóides adultos virgens <ol><li> Prepare uma agulha para pegar nematóides pelo desenho de um capilar de vidro, depois de aquecer-lo sobre um queimador de álcool. NOTA: A ponta da agulha capilar tem normalmente de ser de 50 um de diâmetro, mais ou menos a largura do corpo de um nemátodo adulto, de modo que ele pode ser usado como uma ferramenta para retirar um único nemátodo. </li><li> Montar um funil de Baermann e extrair nematóides das culturas de fungos durante 2 h, como descrito nos passos 1.2.1 - 1.2.3. </li><li> Transfira a J4 com água em um prato limpo Petri. </li><li> Observe os nematóides sob um microscópio estereoscópico e distinguir entre machos e fêmeas por morfologia genital, como descrito por Mamiya e Kiyohara 8 (Figura 1 </strong&gt;). Pegar um nematóide do sexo desejado com a agulha capilar preparada e transferi-lo para a placa de fungos-cultura apropriado para homens ou fêmeas. NOTA: Existem mais mulheres que homens, com a porcentagem de fêmeas em 60 - 70%. A vulva da mulher é obviamente diferente da espícula macho. Em comparação com o adulto, a espícula ou vulva em J4 em estágio inicial é menor, mas eles ainda podem ser facilmente visto e distinto. O nemátodo está sempre em movimento na água, o que, por vezes, aumenta a dificuldade em distinguir machos e fêmeas. </li><li> Cultura das larvas J4 por mais 24 h a 25 ° C no escuro. NOTA: Todos os nematóides deve desenvolver em adultos, mas uma vez que são unmated, eles são considerados como adultos virgens. </li><li> Montar dois funis de Baermann e extrair os adultos virgens de as culturas de fungos durante 2 h, como descrito nos passos 1.2.1 - 1.2.3, e transferir os machos adultas virgens e fêmeas, em duas placas de Petri limpo separadas. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Observação e gravação de vídeo do comportamento de acasalamento <ol><li> Preparar várias lâminas côncavas e adicionar 200 ul de estéril dd H2O a cada um dos seus poços. </li><li> Pegar o macho preparado virgem adulto ou e feminino com uma agulha capilar e colocar apenas um nematóide na água de cada slide côncava. </li><li> Mantenha os adultos virgens no interior do poço durante 1 h para deixá-los se adaptar ao novo ambiente aquoso. </li><li> Emparelhar um macho virgem e feminino, transferindo um deles de um poço para outro usando uma pipeta. </li><li> Observar o comportamento de acasalamento da 1♀ 1♂ combinação + no slide côncava sob microscópio estereoscópico. </li><li> Para analisar a eficiência de acasalamento dos adultos virgens, calcular a sua taxa de cruzamento de sucesso (R) e compará-la com a de pares adultos selecionados aleatoriamente. Calcular R como a percentagem de repetições em que se observou a cópula em comparação com o número total de repetições estudados. </li><li&gt; Para investigar escolha de acasalamento e da concorrência intrasexual, grupo e observar nematóides virgens de duas combinações diferentes: 1♀ + 3♂ e 3♀ + 1♂. </li><li> Para a coleta de dados para análise qualitativa e quantitativa, filmar o comportamento de acasalamento usando microscopia de vídeo. Normalmente, todo o processo de acasalamento, a partir do momento em que os nemátodos são colocadas no poço do slide côncava para o momento em que eles se movem para longe após copulação, é completada dentro de 2 h. Portanto, o processo de acasalamento gravar continuamente durante pelo menos 2 h, como um replicado. Complete pelo menos 30 repetições no total para cada combinação. NOTA: Adicionar mais estéril dd H2O (normalmente 50 uL) a cada 0,5 h ao poço para compensar a evaporação durante o processo de gravação. </li></ol> 3. Recolha de Dados <ol><li> Veja todos os vídeos com cuidado sobre uma tela de computador e caracterizar as sub-comportamentos qualitativamente. </li><li> Medir o tempo de acasalamento usando thfunção e quadro-a-quadro do gravador de vídeo. subtrair manualmente o tempo a partir do ponto final. </li><li> Para a combinação 1♀ + 1♂, analisar cada gravação de vídeo e medir a duração dos seguintes eventos: <ol><li> Medir a duração de busca (ou seja, o tempo a partir de quando o macho e fêmea são introduzidos na cavidade da corrediça côncava para o momento em que se encontram e contactam entre si). </li><li> Medir o tempo de contacto de (isto é, o tempo desde o primeiro contacto com o momento em que o macho é precisamente posicionada na vulva da fêmea para a primeira cópula). </li><li> Medir a duração da cópula (isto é, o tempo a partir de quando o macho é precisamente posicionada na vulva da fêmea até que ele desliza para baixo a partir do corpo da fêmea após a ejaculação). Nota: Alguns nemátodos podem copular várias vezes em 2 h. Em tais casos, medir a duração da cópula da primeira cópula para o final do lasT uma, incluindo o tempo no meio. </li><li> Medir a duração da prolongado (isto é, o período após a cópula até o mergulho macho e fêmea de distância um do outro e estão separados por uma distância de mais do que o comprimento do corpo dos nemátodos (geralmente 1 mm)). </li></ol></li><li> Contagem da freqüência de cópula e duração de cada cópula ea duração média de todas as cópulas em 2 h para cada um dos diferentes combinações (ou seja, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ e 1♀ + 3♂). </li><li> Calcular a taxa de sucesso de acasalamento para o primeiro contato (P) para as diferentes combinações como a taxa de sucesso de acasalamento após o primeiro contato, que é realizado imediatamente e sem qualquer interrupção. Na fase de contacto, vários contatos pode ser observado antes da cópula real. <ol><li> Quando a distância entre dois indivíduos é mais do que o comprimento do corpo, considere um contato para ser terminado. Para uma réplica, ficha P como 100% quando a cópula is observado imediatamente após o primeiro contato, sem interrupção, ou 0,00%, se não foi observada a cópula ou se houve cópula, mas depois de dois ou mais contatos. NOTA: Não foram 30 repetições para cada combinação descrita aqui. </li></ol></li></ol>

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	<li>Tokushige, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursaphelenchus+sp.+in+the+wood+of+dead+pine+trees.">Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees.</a> J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).</li><li>Sun, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursaphelenchus+xylophilus+was+discovered+in+Sun+Yet-sen's+mausoleum+in+Nanjing.">Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing.</a> J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).</li><li>Mota, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+Portugal+and+in+Europe.">First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe.</a> Nematology. 1, 727-734 (1999).</li><li>Robertson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+the+pine+wood+nematode+Bursaphelenchus+xylophlius+Steiner+&amp;+Buhrer,+1934+(Nickle,+1970)+in+Spain.">Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner &amp; Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain.</a> Nematology. 13, 755-757 (2011).</li><li>Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pine+wilt+disease:+a+threat+to+European+forestry.">Pine wilt disease: a threat to European forestry.</a> Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).</li><li>Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursaphelenchus+xylophilus:+opportunities+in+comparative+genomics+and+molecular+host-parasite+interactions.">Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions.</a> Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).</li><li>Mamiya, Y., Furukawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecundity+and+reproduction+of+Bursaphelenchus+lignicolus.">Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus.</a> Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).</li><li>Mamiya, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+Bursaphelenchus+lignicolus.+n.+sp.+(Nematoda:+Aphelenchoididae)+from+pine+wood+and+histophathology+of+nematode-infested+trees.">Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees.</a> Nematologica. 18, 120-124 (1972).</li><li>Liu, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+features+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+the+mating+process.">Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process.</a> Nematology. 16, 895-902 (2014).</li><li>Simon, J. M., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+mate+finding+cue+in+the+hermaphrodite+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).</li><li>Barr, M. M., Garcia, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+mating+behaviour.">Male mating behaviour.</a> The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).</li><li>Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+attraction+and+mating+in+Bursaphelenchus+okinawaensis+and+B.+xylophilus.">Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus.</a> J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Os testes comportamentais são um aspecto fundamental da ecologia química, neurobiologia, biologia molecular e genética. Nematóides e, em particular C. elegans, são usados extensivamente para estudos nessas áreas. O comportamento de acasalamento de C. elegans foi investigada anteriormente 10-11. No entanto, B. xylophilus é gonochoristic e diferente dos hermafroditas C. elegans, e seu processo de acoplamento tem diferentes características comportamentais 9. Recentemente, o comportamento de acasalamento de Bursaphelenchus okinawaensis, uma espécie-irmã hermafroditas de B. xylophilus, foi relatada 12. Embora foram utilizados métodos experimentais diferentes, esta espécie hermafrodita mostrou atração sexual semelhante ao B. xylophilus, e observou-se atracção inter-espécies entre eles. Esta espécie irmã hermafroditas pode ser usado como um modelo para conduzir uma investigação mais aprofundada sobre a biologia do Bursaphelenchus. Este protocolo fornece uma orientação sobre a forma de observar e investigar as características comportamentais de B. xylophilus durante o acasalamento. Os nossos resultados mostraram que o uso de nemátodos adultos virgem é crítico para aumentar a possibilidade de observar o processo de acasalamento com sucesso (Figura 1). Obtenção de larvas J4 e distinguir precisamente seus sexos são dois passos fundamentais importantes para a aquisição de adultos virgens. Sob as nossas condições experimentais (isto é, a 25 ° C no escuro), o período de 52 horas é um tempo apropriado para se obter a partir de larvas J4 J2. No entanto, distinguir o sexo na fase J4 início na maior parte depende da experiência pessoal. Para garantir a precisão, é necessário que as pessoas diferentes para verificar novamente a alocação sexo. As características comportamentais de B. xylophilus durante o processo de acasalamento podem ser descrita qualitativamente e quantitativamente analisada por gravar as durações dos quatro diferemfases otorrinolaringológico, a percentagem de sucesso de acasalamento após o primeiro contato, a frequência de copulação e a duração da cópula de combinações diferentes. Curiosamente, pela primeira vez, observamos escolha de acasalamento por fêmeas e forte concorrência intra-sexual em ambos os sexos masculino e feminino. Não foi observada a promiscuidade; No entanto, isto pode ser devido ao número limitado de nemátodos utilizados na investigação. Este protocolo não só pode ser usado para investigar o comportamento de acasalamento de B. xylophilus, mas também pode ser útil e valioso como uma referência para outros nematóides.

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, is one of the most destructive invasive species, causing the wilting and eventual death of pine trees. This pathogenic nematode is believed to be native to the USA, but it was transported to several countries, including China, Japan, South Korea, and Portugal. Recently, it has also been reported in Spain, killing millions of pine trees at huge economic losses and threatening forest production and ecological stability1-5.
Once a host pine tree is infected by pinewood nematodes, thousands of millions of offspring are propagated rapidly within the trunk. This causes xylem dysfunction, resulting in wilting and eventually in the death of the host tree6. However, there is currently no efficient way to control this disease. Mating behavior might play an important role in the high fecundity of this nematode7. We therefore investigated the mating behavior of B. xylophilus in the laboratory, trying to find an effective way of disturbing its mating and decreasing its fecundity. 
This protocol is intended to introduce the detailed methods of how to obtain the virgin adults of B. xylophilus and how to observe and analyze the mating behavior using a video recorder and a stereomicroscope. This protocol can also be used as a reference for behavioral studies of other nematodes.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;B. xylophilus&lt;/em&gt; isolate &lt;em&gt;Nxy61&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Extracted from &lt;em&gt;Pinus massoniana&lt;/em&gt; in Ningbo area of China</td></tr><tr><td>Grey mold strain</td><td></td><td></td><td>Obtained from Forestry Academy of China</td></tr><tr><td>Baermann funnels</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>falcon tubes</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuge</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipette</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sterile dd H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td>Sterilized by high pressure of steam at 121 &amp;deg;C for 30 min.</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDA medium</td><td>Huankai Bio.</td><td>021050</td><td></td></tr><tr><td>incubator</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glass capillary</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Leica</td><td>LED5000 RL</td><td></td></tr><tr><td>inverted stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>concave slides</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus

Um método para observar e quantificar o comportamento de acasalamento do nemátodo do pinheiro, Bursaphelenchus xylophilus, foi criada sob microscópio estereoscópico. Para melhorar a eficiência de acoplamento de B. Xylophilus e aumentar as chances de observação de acasalamento, os adultos virgens foram cultivadas e utilizadas para a investigação. Os ovos foram obtidas, mantendo os nemátodos em água e permitindo que as fêmeas a pôr ovos durante 10 min. Os juvenis de segundo estádio (J2) foram sincronizadas por incubação dos ovos durante 24 h a 25 ° C no escuro, e o início J4 foram obtidos por cultura do J2 com bolor cinzento, Botrytis cinerea, por outro 52 h. Neste ponto do tempo, a maioria dos nematóides J4 podia ser claramente distinguida como sendo do sexo masculino ou feminino com sua morfologia genital. O macho e fêmea J4 foram recolhidas e cultivadas separadamente em dois pratos de Petri diferentes durante 24 h para obter nemátodos adultos virgens. Um macho e uma fêmea virgem virgem foram emparelhados em uma gota de watER no poço de uma lâmina côncava. O comportamento de acasalamento foi filmado com um gravador de vídeo sob microscópio estereoscópico. todo o período do processo de acasalamento foi de 82,8 ± 3,91 min (média ± SE) e pode ser dividido em 4 fases distintas: pesquisa, contactando, copulando, e remanescentes. Os médios minutos de duração foram 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 e 7,2 ± 0,5, respectivamente. Onze sub-comportamentos foram descritos: cruzeiro, aproximando-se, encontrando, tocando, hooping, localizar, prender, ejacular, separar, quietude, e roaming. Curiosamente, óbvia a concorrência intra-sexual foi observada quando uma fêmea foi agrupada com 3 machos ou um macho com 3 fêmeas. Este protocolo é útil e valioso, não só na investigação do comportamento de acasalamento de B. xylophilus, mas também em atuar como referência para estudos etológicas dos outros nematóides.

A taxa de sucesso de acasalamento (R) de adultos virgem foi de 86,67%, em média, o que foi significativamente mais elevado do que o dos adultos seleccionadas aleatoriamente: 13,33 ± 4,65% (M = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (Figura 2). Esta descoberta sugere que é mais fácil de observar o comportamento de acasalamento de B. xylophilus com adultos virgens do que com adultos selecionados aleatoriamente. Quando um macho foi emparelhado com uma fêmea, todo o processo de acasalamento durou 82,8 min, em média. Todo o processo pode ser descrito por quatro fases distintas: pesquisa, contactando, copulando e persistente. A duração para estes quatro fases foram 21,8 ± 2,0 min, 28,0 ± 1,9 minutos, 25,8 ± 0,7 min e 7,2 ± 0,5 minutos, respectivamente (Figura 3). Em recente publicação, descrevemos as 11 sub-comportamentos como cruzeiro, aproximando-se, encountering, tocando, hooping, localizar, prender, ejacular, separar, quietude, e roaming 9. Quando um macho met dois ou mais fêmeas simultaneamente, o macho parecia para acasalar aleatoriamente com um deles, sem qualquer selecção. No entanto, foi observada a escolha óbvia para o acasalamento feminino B. xylophilus. Quando uma fêmea em contato com um macho, a fêmea tende a tocar na cabeça do macho, corpo, cauda e região genital suavemente com a cabeça e parecia estar avaliando seu potencial parceiro. Se a fêmea não aceitar o macho, a fêmea deixou rapidamente e nadou para outro do sexo masculino para a próxima avaliação. Um dos machos foi então seleccionada pela fêmea para o acasalamento. Acasalamento taxas de sucesso após o primeiro contacto (P) da 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ e 1♀ + 3♂ combinações foram 46,7 ± 9,3%, 80,0 ± 7,4% e 23,4 ± 7,4%, respectivamente, e as diferenças entre eles were significativo (F = 8,21, df = 2, P = 0,0124) (Figura 4). competição intrasexual foi observada em ambos os machos e fêmeas. Quando uma fêmea virgem foi misturado com 3 machos virgens, os machos tentaram se aproximar e em contato com o sexo feminino, tanto quanto possível para ter a chance de acasalar com ela. Quando a vulva foi ocupada por um macho, os outros machos tentou perturbar o macho de acoplamento, utilizando balanços violentos corpo ou arrastando a separá-los. competição intrasexual feminino foi visto como sendo mais ou menos semelhante à concorrência intrasexual masculino. sucesso de acasalamento dependia principalmente da mulher. Quando uma fêmea aceita um macho, o macho movido mais lentamente e enrolado ou mesmo formado um aro, ea fêmea avançou ativamente para tornar mais fácil para o macho para localizar sua vulva e evitar a interferência de outros machos. Se uma fêmea não aceitar um macho,a fêmea tentou livrar dele, mesmo que o macho tinha montado e se posicionou por sua vulva. Por causa da competição intrasexual, frequências copulação da 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ e 1♀ + 3♂ combinações foram de 1,43 ± 0,091, 1,17 ± 0,074 e 1,83 ± 0,074, respectivamente, e as diferenças entre eles eram significativo (F = 14,50, df = 2, P = 0,0001) (Figura 5). Na nossa investigação, a duração da cópula variou grandemente, com um mínimo de 20 s e um máximo de 42 minutos. De acordo com nossos dados, a duração da cópula poderia ser, obviamente diferenciados em dois grupos: cópulas de curto prazo, que durou menos de 5 minutos, e cópulas de longo prazo, que durou mais de 10 min. Foram observadas diferenças óbvias entre os diferentes grupos para a duração média da cópula de curto prazo (F = 3,81, df = 2, P </em&gt; = 0,0296), a cópula longo prazo (M = 179,52, df = 2, P = 0,0001), e todas as copulações (F = 2,93, df = 2, P = 0,0367) (Figura 6). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54842/54842fig1.jpg" /> Figura 1: Genitália do masculino e feminino B. Xylophilus. (A) espícula do macho (seta azul). (B) vulva da fêmea (seta vermelha). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54842/54842fig2.jpg" /> Figura 2: Acoplamento taxa de sucesso de Casais Virgin adultos e casais adultos aleatoriamente selecionados de B. xylophilus. Os valores médios calculados são de 30 repetições. O show barra verticalé o erro padrão. As letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas em P &lt;0,05 quando comparadas pelo teste de Tukey. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54842/54842fig3.jpg" /> Figura 3: Duração das 4 fases do processo de acasalamento de B. xylophilus. Os valores médios calculados são de 30 repetições. A barra vertical mostra o erro padrão. As letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas em P &lt;0,05 quando comparadas pelo teste de Tukey. A duração média da fase cópula é 25,80 ± 0,71 min, o que é de 31,17% de todo o processo de acasalamento. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta fig</a>ure. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54842/54842fig4.jpg" /> Figura 4: Acasalamento sucesso para o primeiro contato de B. xylophilus. Os valores médios calculados a partir de 30 são replicados ± SE. Significa com a mesma letra minúscula dentro de cada coluna não são significativamente diferentes em P &lt;0,05 quando comparadas pelo teste de Diferença significativa Honest de Tukey. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54842/54842fig5.jpg" /> Figura 5: Cópula Frequência de B. xylophilus em grupos diferentes. Os valores médios calculados a partir de 30 são replicados ± SE. Significa com a mesma letra minúscula não são significativamente diferentes em P &lt;0,05 quando compared pelo teste Diferença significativa Honest de Tukey. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54842/54842fig6.jpg" /> Figura 6: Cópula Duração do B. xylophilus. Significa com a mesma letra minúscula dentro de cada conjunto de colunas não são significativamente diferentes em P &lt;0,05 quando comparadas pelo teste de Diferença significativa Honest de Tukey. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54842/54842fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

observation-quantification-mating-behavior-pinewood-nematode

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

9.3K visualizações.  Zhejiang Agricultural & Forestry University. A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

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A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American lobsters. Recent work in exploited crustacean populations (crabs and lobsters) suggests that there are circumstances where mature females are unable to achieve their full reproductive potential due to sperm limitation. To examine this possibility in different regions of the American lobster fishery, a reliable and noninvasive method was developed for sampling large numbers of female lobsters at sea. This method involves inserting a blunt-tipped needle into the female&#39;s seminal receptacle to determine the presence or absence of a sperm plug and to withdraw a sample that can be examined for the presence of sperm. A series of control studies were conducted at the dock and in the laboratory to test the reliability of this technique. These efforts entailed sampling 294 female lobsters to confirm that the presence of a sperm plug was a reliable indicator of sperm within the receptacle and thus, mating. This paper details the methodology and the results obtained from a subset of the total females sampled. Of the 230 female lobsters sampled from George&#39;s Bank and Cape Ann, MA (size range = 71-145 mm in carapace length), 90.3% were positive for sperm. Potential explanations for the absence of sperm in some females include: immaturity (lack of physiological maturity), breakdown of the sperm plug after being used to fertilize a clutch of eggs, and lack of mating activity. The surveys indicate that this technique for examining the mating success of female lobsters is a reliable proxy that can be used in the field to document reproductive activity in natural populations.

A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters Homarus americanus

Fishery-induced changes to exploited crustacean fisheries, such as the American lobster fishery, could potentially influence their reproductive dynamics, leading to a reduction in mating success. This study&#39;s goal was to develop a noninvasive method for ascertaining the mating success of female lobsters that may be physiologically or functionally mature.

Um método não invasivo para<em&gt; Em situ</em&gt; Determinação do sucesso de acasalamento em fêmeas lagostas americanas (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Despite being one of the most productive fisheries in the Northwest Atlantic, much remains unknown about the natural reproductive dynamics of American ...

Ambiente

Field Experiments of Pollination Ecology: The Case of Lycoris sanguinea var. sanguinea

Plant-pollinator interactions have been studied for approximately one hundred years. During that time, many field methods have been developed to clarify the pollination effectiveness of each pollinator for visited flowers. Pollinator observations have been one of the most common methods to identify pollinators, and bagging and cage experiments have been conducted to show the effectiveness of specific pollinators. In a previous study of Lycoris sanguinea var. sanguinea, its effective pollinators, the visitation frequencies of each floral visitor, and its reproductive strategies were not identified. This study reports the observation that small bees visited flowers that were partially opened (breaking buds). To the best of our knowledge, this phenomenon has not been reported previously. Further, this study investigates the hypothesis that small bees can pollinate at that flowering stage. This study demonstrates the basic methods of field experiments in pollination ecology using L. sanguinea var. sanguinea. Pollinator observations and digital video showed the visitation frequencies of each floral visitor. Bagging and cage experiments revealed that these flowers could be pollinated fully and that breaking-bud pollination could be important for the pollination of this plant species. The advantages and disadvantages of each method are discussed, and recent developments, including laboratory experiments, are described.

Field Experiments of Pollination Ecology: The Case of Lycoris sanguinea var. sanguinea

To reveal the pollinator effectiveness of a given plant species, multiple methods of field experiments have been developed. This study demonstrates the basic methods of field experiments for pollination ecology using the case study of Lycoris sanguinea var. sanguinea and the novel pollination mechanism, breaking-bud pollination.

Experimentos de campo de Ecologia da polinização: o caso da<em&gt; Sanguinea de Lycoris</em&gt; Var.<em&gt; sanguinea</em

Plant-pollinator interactions have been studied for approximately one hundred years. During that time, many field methods have been developed to clarify ...

Induction and Evaluation of Inbreeding Crosses Using the Ant, Vollenhovia Emeryi

The genetic and molecular components of the sex-determination cascade have been extensively studied in the honeybee, Apis mellifera, a hymenopteran model organism. However, little is known about the sex-determination mechanisms found in other non-model hymenopteran taxa, such as ants. Because of the complex nature of the life cycles that have evolved in hymenopteran species, it is difficult to maintain and conduct experimental crosses between these organisms in the laboratory. Here, we describe the methods for conducting inbreeding crosses and for evaluating the success of those crosses in ant Vollenhovia emeryi. Inducing inbreeding in the laboratory using V. emeryi, is relatively simple because of the unique biology of the species. Specifically, this species produces androgenetic males, and female reproductives exhibit wing polymorphism, which simplifies identification of the phenotypes in genetic crosses. In addition, evaluating the success of inbreeding is straightforward as males can be produced continuously by inbreeding crosses, while normal males only appear during a well-defined reproductive season in the field. Our protocol allow for using V. emeryi as a model to investigate the genetic and molecular basis of the sex determination system in ant species.

Induction and Evaluation of Inbreeding Crosses Using the Ant, Vollenhovia Emeryi

In this protocol, methods for conducting inbreeding crosses, and for evaluating the success of those crosses, are described for the ant Vollenhovia emeryi. These protocols are important for experiments aimed at understanding the genetic basis of sex determination systems in Hymenoptera.

Indução e avaliação de cruzes de endogamia utilizando o Ant, Vollenhovia Emeryi

The genetic and molecular components of the sex-determination cascade have been extensively studied in the honeybee, Apis mellifera, a hymenopteran model ...

Genética

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors remains poorly understood. In Drosophila melanogaster, environmental cues, such as food availability, affect mating activity offering a tractable system to investigate the mechanisms modulating sexual behavior. In D. melanogaster, environmental cues are often sensed via the chemosensory gustatory and olfactory systems. Here, we present a method to test the effect of environmental chemical cues on mating behavior. The assay consists of a small mating arena containing food medium and a mating couple. The mating frequency for each couple is continuously monitored for 24 h. Here we present the applicability of this assay to test environmental compounds from an external source through a pressurized air system as well as manipulation of the environmental components directly in the mating arena. The use of a pressurized air system is especially useful to test the effect of very volatile compounds, while manipulating components directly in the mating arena can be of value to ascertain a compound's presence. This assay can be adapted to answer questions about the influence of genetic and environmental cues on mating behavior and fecundity as well as other male and female reproductive behaviors.

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

We demonstrate an assay to analyze the environmental and genetic cues that influence mating behavior in the fruit fly Drosophila melanogaster.

Um método para testar o efeito de sugestões ambientais no comportamento de acoplamento em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

Comportamento

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Copepods of the genus Tigriopus, which are common zooplankton in rocky tide pools, show precopulatory mate-guarding behavior where a male clasps a potential mate to form a pair. While this phenomenon has attracted interest of researchers, methods for its analysis have not been well described. Here we describe procedures for: 1) individual culturing and staging of Tigriopus juveniles and adults, and 2) video-based analysis of their mate-guarding behavior. The culturing method enables experimental control of paring experience of animals as well as the ability to track their development before behavioral tests. The analysis method allows quantitative evaluation of several aspects of the mate-guarding behavior, including capturing attempts by males and swimming trajectory of mate-guarding pairs. Although these methods were originally established for ethological studies on Tigriopus, with proper modifications they can also be applied to studies of other zooplankton in different research fields, such as physiology, toxicology, and ecological genetics.

Individual Culturing of Tigriopus Copepods and Quantitative Analysis of Their Mate-guarding Behavior

Mate-guarding behavior plays an important role in reproduction of intertidal copepods of the genus Tigriopus. However, methods for studying this behavior have not been well described. Here we describe methods for: 1) individual culture of virgin Tigriopus animals, and 2) quantitative analysis of their mate-guarding behavior.

Cultivo individual de copépodes Tigriopus e análise quantitativa de seu comportamento companheiro-guarda

Copepods of the genus Tigriopus, which are common zooplankton in rocky tide pools, show precopulatory mate-guarding behavior where a male clasps a ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Neurociência

Dissecção para identificação de insetos migratórios por meio da análise reprodutiva ovariana

Dissection and Grading of Ovarian Development in Wild-Type Female Insects

Migratory insect pests pose serious challenges to food production and security all over the world. The migratory pests can be monitored and captured using searchlight traps. One of the most important techniques for migratory pest forecasting is to identify the migratory species. However, in most cases, it is difficult to get the information just by appearance. Therefore, using knowledge acquired by systematic analysis of the female reproductive system can help to understand the combined anatomic morphology of the ovarian mating sac and ovary developmental grading of wild-type migratory insects captured with searchlight traps. To demonstrate the applicability of this method, ovarian development status and egg grain development stages were directly assessed in Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura, and Spodoptera exigua for the ovarian anatomy, and the ovarian mating sacs were studied in Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Helicoverpa armigera, Athetis lepigone, Mythimna separata, Spodoptera litura, Mamestra brassicae, and Spodoptera exigua, to explore their relationships. This work shows the specific dissection method to predict wild-type migratory insects, comparing the unique reproductive system of different migratory insects. Then, both tissues, namely, the ovary and mating sacs, were further investigated. This method helps to predict the dynamics and the structural development of reproductive systems in wild-type female migratory insects.

Autor em destaque: Análise da anatomia ovariana em insetos migratórios para superar desafios experimentais 

The protocol demonstrates a simple and easy dissection method, suitable for wild-type migratory female insects captured with searchlight traps. This technique can significantly clarify the same species by comparing both reproductive tissues, namely the mating sac and ovarian development of wild-type female insects.

Dissecção e classificação do desenvolvimento ovariano em fêmeas selvagens

Migratory insect pests pose serious challenges to food production and security all over the world. The migratory pests can be monitored and captured using ...

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy and cheap methods to distinguish between individuals in a trial. A standard technique for this is CO2 anaesthesia and then labelling or wing clipping each fly. However, this is invasive and has been shown to affect behavior. Other techniques have used coloration to identify flies. This article presents a simple and non-invasive method for labelling Drosophila that allows them to be individually identified within experiments, using food coloring. This method is used in trials where two males compete to mate with a female. Dyeing allowed quick and easy identification. There was, however, some difference in the strength of the coloration across the three species tested. Data is presented showing the dye has a lower impact on mating behavior than CO2 in Drosophila melanogaster. The impact of CO2 anaesthesia is shown to depend on the species of Drosophila, with D. pseudoobscura and D. subobscura showing no impact, whereas D. melanogaster males had reduced mating success. The dye method presented is applicable to a wide range of experimental designs.

Dyeing Insects for Behavioral Assays: the Mating Behavior of Anesthetized Drosophila

This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.

Tingimento Insetos para Comportamentais Ensaios: o comportamento de acasalamento dos anestesiado<em&gt; Drosophila</em

Mating experiments using Drosophila have contributed greatly to the understanding of sexual selection and behavior. Experiments often require simple, easy ...

Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro,

Resumo

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Um método não invasivo para

Experimentos de campo de Ecologia da polinização: o caso da

Indução e avaliação de cruzes de endogamia utilizando o Ant, Vollenhovia Emeryi

Um método para testar o efeito de sugestões ambientais no comportamento de acoplamento em

Cultivo individual de copépodes Tigriopus e análise quantitativa de seu comportamento companheiro-guarda

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Dissecção e classificação do desenvolvimento ovariano em fêmeas selvagens

Dissecção e classificação do desenvolvimento ovariano em fêmeas selvagens

Dissecção e classificação do desenvolvimento ovariano em fêmeas selvagens

Tingimento Insetos para Comportamentais Ensaios: o comportamento de acasalamento dos anestesiado