Name: building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics
Uploaded: 2016-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics at JoVE.com

LHB foi financiado pelo programa celular PhD Wellcome Trust dinâmico; KAR foi financiado pela subvenção de projecto MRC MR / L002566 / 1 (atribuído a EJR e CLH) e CLH foi financiado pela áruk concessão 19479. Também gostaríamos de agradecer a facilidade Wolfson BioImaging para o conselho de imagem.

Todos os passos dentro do protocolo de seguir a Universidade de cuidados com os animais de Bristol e diretrizes de bem-estar e os do UK Home Office. 1. Visualização de Musculoskeletal anatomia NOTA: Para visualizar a forma dos elementos esqueléticos, para quantificar muscular e para identificar o posicionamento exato dos anexos musculares, imunocoloração (seção 1.1) peixes na idade apropriada para a miosina esquelético (que revela muscular) e colágeno tipo II (para visualizar cartilagem). Alternativamente, visualizar a anatomia do músculo-esquelético usando linhas repórter fluorescentes transgênicos, como o colágeno repórter a1 COL2A1: mCherry 13,14 para visualizar a cartilagem eo lento miosina de cadeia pesada smyhc repórter: GFP 15 para visualizar a posição de anexos musculares (ponto 1.2). linhas alternativas que marcam cartilagem e músculo poderia funcionar igualmente bem. <ol><li> fluorescente Immunostaining <ol><li> Fix larva em excesso de paraformaldeído a 4% (PFA) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 1 h. Lavar em PBS com 0,1% de Tween 20 (PBT) e desidratar em 50% de metanol (MeOH) em PBT e MeOH a 100% durante 5 min, respectivamente. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser tratado de acordo com a folha de segurança material. NOTA: Larva podem ser armazenados em 100% de MeOH até ser necessário. </li><li> Reidratar larva em 50% de MeOH em PBT durante 5 min. Lavar em PBT durante 5 min. </li><li> Permeabilizar larva em 0,25% de tripsina em PBT em gelo durante 5-6 minutos. Lavar em 4x PBT durante 5 minutos cada. </li><li> Bloquear para 2-3 horas em soro 5% em PBT. </li><li> Incubar larva na diluição recomendada de coelho anti-colagénio do tipo 2 e de ratinho anti-miosina anticorpos no soro a 5% em PBT durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. NOTA: O intervalo de diluição recomendada é normalmente na folha de dados de anticorpos. Escolha anticorpos que são dirigidos contra espécies diferentes entre si e que também são difealugar ao tecido. </li><li> Lave 6x larva por 15 minutos em PBT. </li><li> Bloquear durante 1-2 horas em soro 5% em PBT. </li><li> Incubar em anticorpos secundários no escuro. Use marcado por fluorescência anti-rato (550) e anti-coelho (488) anticorpos secundários para uma diluição adequada em 5% de soro e PBT para o anticorpo específico. </li><li> Lavar 6X por 10 minutos cada em PBT e imagem em um microscópio confocal 10X mais rapidamente possível. </li></ol></li><li> Imagiologia Musculoskeletal Geometry <ol><li> Montar as larvas ventrally em uma lamela em agarose morna 0,3-0,5% de baixo ponto de fusão (LMP) em solução de Danieau 16. NOTA: peixes transgénicos terá de ser sedado em 0,02% MS222 (tricaina metanossulfonato, pH 7) antes da montagem e durante o exame. </li><li> Dê uma pilha de imagens confocal da região de interesse usando a lente objetiva de 10X eo zoom digital de cerca de 2,5 vezes. Preparação de imagens do canal verde e vermelho usando a 488 nm e 561 nm lasers respectivamente. Imagem com uma resolução de 512 x 512 com um intervalo entre os planos z de 1,3 mm e 3 médias de linha. A pilha resultante irá compreender de cerca de 100 fatias z. </li><li> Exportar os dados como uma série tiff. Projecções máximas dos elementos do músculo e da cartilagem a partir de uma larva de peixe-zebra 5dpf são mostrados na Figura 1. </li></ol></li></ol> 2. Gerar uma superfície 3D <ol style="margin-left: 40px;"><li> Escolha um conjunto de dados representativo para cada ponto de tempo em 3, 4 e 5 dpf (escolha após a visualização de múltiplas amostras). </li><li> Abrir 3-dimensional pilha tiff e selecione todos os canais de software de análise. Clique direito sobre o canal de cartilagem e selecione filtro de imagem e suavização: Gaussian (Figura 2B). </li><li> Em vista do projeto com o botão direito na imagem filtrada e selecione &#39;segmentação de imagem &quot;e depois&quot; editar nova etiqueta&#39;. Criar um novo rótulo para cada material, ou seja, cartilagem e jonto. Selecione a região de cartilagem da imagem (Figura 2C, sinal branco, esboço roxo) com a ferramenta varinha mágica. Use a ferramenta pincel para remover o ruído dos contornos. NOTA: Se usando a ferramenta varinha mágica, clique em &quot;Todos os slices &#39;. </li><li> Selecione a região em conjunto com a ferramenta pincel e atribuir a um componente de articulação (Figura 2C, contorno azul) </li><li> várias fatias suaves ao mesmo tempo, selecionando a segmentação no menu superior e etiquetas lisas. Botão direito do mouse na imagem e selecione gerar superfície para produzir uma superfície 3D rendem do componente (Figura 2D). </li><li> Clique na superfície e salvar os dados como um arquivo hmascii para importação para software articulada. </li></ol> 3. Cálculo das Forças músculo a ser utilizado no modelo FE <ol style="margin-left: 40px;"><li> Contar o número de fibras musculares de imagens confocal de smyhc: GFP peixes-zebra transgénicos (Figura 1A, seta, 1C) e medir a diameter das fibras para calcular a área de secção transversal (πr 2). </li><li> Identificar força por unidade de área adequado músculo a partir da literatura. A força muscular máxima gerada por unidade de área para os músculos esqueléticos de peixe-zebra larval (40 nN / ^ m 2) foram utilizados 17. </li><li> Calcular as forças para cada grupo muscular anatómica multiplicando o número de fibras e a sua área pela força por unidade de área. Ver Tabela 1. </li></ol> 4. Gerando uma Malha <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importar o modelo 3D gerado na secção 2 (acima) para um pacote de software capaz de gerar uma malha de elementos finitos. </li><li> Gerar A2d malha da cartilagem e superfícies articulares, utilizando a ferramenta envoltório do psiquiatra no menu 2D. Escolha um tamanho de elemento apropriado. Nota: Use um tamanho de elemento entre 1,5-2,5. Se necessário, gerar um intervalo de superfície 2D diferente tamanho malhas para realizar a otimização da malha 3D (Seção 4.4). </li><li> Efectuar controlos de qualidade malha encontradas embaixo dos 2D&gt; Ferramentas&gt; Verificar elementos &quot;painel para verificar se há elementos duplicados, inserções e penetrações na malha. Corrigir ângulos diedros usando a guia utilidade em árvore do modelo. </li><li> Gerar uma malha 3D a partir das malhas de superfície 2D de diferentes tamanho do elemento utilizando o subpainel 3D&gt; Tetramesh. NOTA: Comparar os resultados de diferentes tamanhos de malha e selecione o modelo FE com a malhagem menor que converge após novas simulações e não compromete definição de recurso. O exemplo na Figura 3 contém 1,5 milhões de elementos tetraédricos para as cartilagens de maxilas inferiores e tinha um tamanho de elemento de 2D de 2,0. </li><li> Transformar a malha de modo modelo de mandíbula é escalar como por pilha confocal utilizando a geometria&gt; Distância subpainel. NOTA: Certifique-se a cartilagem e componentes comuns são conectados no modelo através da exportação de um modelo mesclado ou usando laços. </li></ol> 5. Elementos Finitos Model Construção <ol><li> Usando software comercial de elementos finitos (FE), criar um modelo de FE. Usando o músculo e da cartilagem 3D marcado pilhas confocal gerados na secção 1, como um guia, atribuir nós que correspondem aos pontos de fixação do músculo. Criar um vector de entre dois nós que representam a origem e a inserção de cada um dos músculos (Figura 3). </li><li> Criar um coletor de carga do tipo &quot;história&quot; para aplicar um &#39;load C&#39; para cada músculo. Especificar a magnitude em newtons (calculado no passo 3.3) e atribuir o vector associado. A Figura 3 mostra os pontos de fixação para o mandibulae adutor (AM), hyoideus transferidor (PH) e intermandibularis (IM). NOTA: Para estes músculos da mandíbula, força contráctil máxima é distribuído entre a origem e a inserção de modo a que apenas 50% de cada carga é aplicada em cada local. </li><li> Atribuir propriedades do material isotrópico elásticas adequadas conforme determinado pela literatura. Módulo de Young para a cartilagemeo interzona neste modelo foram de 1,1 MPa e 0,25 MPa, respectivamente, e razão de Poisson foi de 0,25 tanto para 18,19. </li><li> Criar um coletor de carga do tipo &#39;limite&#39; para aplicar restrições iniciais do modelo. Vá até a aba Análise&gt; Restrições e no subpainel criar, escolher os nós no modelo que deseja restringir. Selecione os graus de liberdade (DOF) que o movimento limite do modelo para a melhor aproximação da sua área natural de movimento. NOTA: O modelo da Figura 3 foi constrangido em todos os eixos de movimento (DOF: 1, 2, 3 representam X, Y e Z, respectivamente) no ceratohyal para o ancorar no espaço a um ponto médio no modelo e na eixo y e Z no ponto em que o palatoquadrate liga ao resto do crânio peixe-zebra (Figura 3, Tabela 1). O modelo deve ser limitado em todas as três DOF ​​em um nó menos. </li><li> Criar uma &quot;etapa Load &#39;, para cada tipo de movimento que pretende simulcomeu (ou seja, a abertura, fechamento), sob o menu de análise e selecione todas as cargas relevantes (feitas na Seção 5.2) e as restrições (feito na Seção 5.4) para simular o movimento. Selecione &#39;Static&#39; a partir do menu drop-down quando ela aparece. </li><li> modelo de exportação, incluindo os de malha, cargas, restrições e propriedades do material em um formato de arquivo adequado, neste caso formato &quot;.INP&quot;. </li><li> modelo de carga em software de análise de FE. Criar e executar um trabalho para o modelo utilizando o módulo de Job. </li><li> Analisar a saída para o stress, tensão, deslocamento, etc. encontrada na guia resultados e menu de visualização (Figura 4 e 5). </li></ol> 6. Validação de Jaw Deformação / Deslocamento Distâncias <ol><li> Escolha 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mCherry) peixes-zebra transgénicos. </li><li> Levemente anestesiar as larvas com 0,02% MS222 até que eles deixam de responder ao toque, mas seu coração ainda está batendo. </li><li> monteas larvas lateralmente (enquanto anestesiado) em lamelas em tépida agarose LMP 1% (composta em solução de Danieau). </li><li> Remova a agarose em torno da cabeça e mandíbula com fórceps. </li><li> Lave solução fresca de Danieau (sem MS222) sobre a cabeça da larva para remover a anestesia utilizando uma pipeta Pasteur até movimentos normais da boca retomada. </li><li> Use um software de captura de filme para tirar de campo brilhante vídeos em alta velocidade de movimentos da boca. Tome filmes de cerca de um minuto de duração na taxa de quadros mais alta, ou suficiente para gravar vários ciclos de abertura da mandíbula. </li><li> Escolha quadros que mostram a mandíbula aberta para o seu deslocamento máximo. Medir a distância entre a ponta anterior da cartilagem de Meckel e a maxila superior (ponta da placa etmóide) em uM. </li><li> Calcular o deslocamento médio de larvas de peixes múltipla. </li><li> Extrai dados de deslocamento a partir do modelo. Use o deslocamento médio calculado em 6,8 a verificar o comportamento de deslocamento do modelo ( <strong&gt; Figura 4). Se o modelo afasta-se, a análise de sensibilidade esperada executar sequencialmente, alterando as propriedades dos materiais e cargas musculares. </li></ol>

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	<li>Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+Element+Analysis+and+Understanding+the+Biomechanics+and+Evolution+of+Living+and+Fossil+Organisms.">Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms.</a> Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).</li><li>Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition. , (2010).</li><li>Taylor, M., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+decades+of+finite+element+analysis+of+orthopaedic+devices:+Where+are+we+now+and+what+are+the+opportunities.">Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities.</a> J Biomech. 48, 767-778 (2015).</li><li>Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+biomechanics+underpins+high+sauropod+diversity+in+resource-poor+environments.">Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments.</a> Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).</li><li>Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiology+and+developmental+control.">Mechanobiology and developmental control.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).</li><li>Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+contraction+controls+skeletal+morphogenesis+through+regulation+of+chondrocyte+convergent+extension.">Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension.</a> Dev biol. 370, 154-163 (2012).</li><li>Rolfe, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mechanosensitive+genes+during+skeletal+development:+alteration+of+genes+associated+with+cytoskeletal+rearrangement+and+cell+signalling+pathways.">Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways.</a> BMC genomics. 15, 48 (2014).</li><li>Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+patterns+of+mechanical+stimulation+co-localise+with+growth+and+cell+proliferation+during+morphogenesis+in+the+avian+embryonic+knee+joint.">Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint.</a> J Biomech. 44, 143-149 (2011).</li><li>Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+chondrocyte+actin+cytoskeleton+in+living+three-dimensional+culture:+response+to+anabolic+and+catabolic+stimuli.">Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli.</a> Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).</li><li>Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+pattern+of+mechanical+stimulation+promotes+ossification+in+avian+embryonic+long+bones.">A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones.</a> J Biomech. 41, 249-258 (2008).</li><li>Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanobiological+simulations+of+prenatal+joint+morphogenesis.">Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis.</a> J Biomech. 47, 989-995 (2014).</li><li>Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanically+modulated+cartilage+growth+may+regulate+joint+surface+morphogenesis.">Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis.</a> J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).</li><li>Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+populations+of+endochondral+osteoblasts+with+differential+sensitivity+to+Hedgehog+signalling.">Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling.</a> Development. 136, 3991-4000 (2009).</li><li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish.">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).</li><li>Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+slow+myosin+heavy+chain+genes+reveals+a+diversity+of+zebrafish+slow+twitch+muscle+fibres+with+differing+requirements+for+Hedgehog+and+Prdm1+activity.">Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity.</a> Development. 135, 2115-2126 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danieau's+solution+(30&#215;).">Danieau's solution (30&#215;).</a> Cold Spring Harb Prot. , (2011).</li><li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish.">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).</li><li>Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+muscular+activity+on+local+mineralization+patterns+in+metatarsals+of+the+embryonic+mouse.">Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse.</a> J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).</li><li>Tanck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanical+consequences+of+mineralization+in+embryonic+bone.">The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone.</a> Bone. 35, 186-190 (2004).</li><li>Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finite+element+modelling+predicts+changes+in+joint+shape+and+cell+behaviour+due+to+loss+of+muscle+strain+in+jaw+development.">Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development.</a> J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).</li><li>Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+influences+on+morphogenesis+of+the+knee+joint+revealed+through+morphological,+molecular+and+computational+analysis+of+immobilised+embryos.">Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos.</a> PloS one. 6, e17526 (2011).</li><li>Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+experiments+on+finite+element+models+of+an+ostrich+(Struthio+camelus)+cranium.">Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium.</a> Peer J. 3, 1294 (2015).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Musculoskeletal+patterning+in+the+pharyngeal+segments+of+the+zebrafish+embryo.">Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo.</a> Development. 124, 2945-2960 (1997).</li><li>Dowthwaite, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+underlying+the+movement+requirement+for+synovial+joint+cavitation.">A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation.</a> Matrix biol. 22, 311-322 (2003).</li><li>Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poroelasticity+of+cartilage+at+the+nanoscale.">Poroelasticity of cartilage at the nanoscale.</a> Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar. Alguns dados nas Figuras 3-5 foi reproduzido a partir J.Biomech, 48 (12), Brunt et al., Modelagem de elementos finitos prevê mudanças na forma conjunta e comportamento celular devido à perda de tensão muscular no desenvolvimento da mandíbula, 3112-22. de 2015, com a permissão de Elsevier 15.

Modelos de elementos finitos tenha sido utilizado para relacionar as áreas de elementos esqueléticos que estão sob tensão com aqueles submetidos a formação de osso 10, bem como para mapear as áreas sob tensão durante a ossificação endocondral e morfogénese conjunta 8,12,21. Outros estudos também têm sido capazes de aplicar modelos de crescimento teóricas para replicar as alterações durante o desenvolvimento conjunto 11,12. Aqui nós mostramos o protocolo para a construção de modelos FE para um sistema relativamente simples, a mandíbula zebrafish 20. Ao contrário dos métodos alternativos de recolha de imagens RAW para os modelos FE, como a tomografia computadorizada 22, imagem confocal de linhas transgénicas ou peixe-zebra histoquímica permite múltiplos tecidos a serem estudados. Pode, por conseguinte, proporcionará informação directa sobre os pontos de fixação do músculo em relação à cartilagem. Entre os modelos de vertebrados peixe-zebra são particularmente passíveis de manipulação genética e farmacológica. A geração de modelos FE para peixe-zebracartilagem craniofacial agora abre-se a possibilidade de um estudo mais aprofundado da interação entre biomecânica e genética na morfogênese conjunta. Há um número de etapas críticas para o processo de criação de um modelo de FEC; a primeira é a geração de uma representação tridimensional precisa do sistema. Isso exige de imagem com resolução alta o suficiente para definir claramente as fronteiras. Note-se que, mesmo com imagens de alta resolução para fazer uma boa superfície que se pode ter para suavizar algumas regiões. Outro passo fundamental é definir o posicionamento correto da carga e as restrições corretas. Um modelo insuficientemente restrita irá falhar para resolver e colocação incorrecta das cargas irá causar movimento anormal. Alguns processamento dos dados em bruto (Figura 2) é necessária como uma superfície gerada a partir dos dados brutos seria difícil de malha (Figura 2B). Nós filtrada a dados utilizando um filtro gaussiano (Figura 2C </strong&gt;) e realizamos alguns suavização manual das curvas para produzir um conjunto de linhas limpas que podem ser convertidos em uma superfície 3D. Demasiada suavização pode produzir uma superfície &quot;derreteu&quot; que perdeu muitas das suas características. Escolhendo o tamanho do elemento correto é um processo iterativo que escolher muito pequeno um tamanho de elemento cria muito grande de uma malha que é computacionalmente intensiva. No entanto, a escolha de um tamanho muito grande elemento irá produzir uma malha que falha para recapitular a forma correcta da estrutura. A malha correta tinha o tamanho do elemento menor que capturou a forma correta da mandíbula e convergiram para uma solução correta, verificada por meio do deslocamento da mandíbula. Também pode ser necessário modificar as propriedades do material de carga ou de cálculos para melhor imitar o deslocamento correcto como espécies diferentes idades e terá propriedades substancialmente diferentes. É importante lembrar que sempre existem limitações para um modelo hipotético e umssumptions feitas nos modelos FE. Quando apenas modelar um ou um pequeno número de amostras é essencial para garantir que uma amostra representativa é escolhida como não são susceptíveis de ser pequenas variações entre indivíduos. Uma vez que apenas alguns dos elementos da maxila e os músculos foram incluídos, o modelo é uma versão simplificada do sistema músculo-esquelético craniofacial peixe-zebra. Portanto, as restrições tiveram de ser posicionada para explicar onde os elementos da mandíbula modelados iria se conectar com o resto do crânio e o modelo foi artificialmente restrita no centro de corrigi-lo no &quot;espaço&quot;. Esta restrição artificial não teve impacto sobre a interpretação a partir dos modelos como o ceratohyal em si não foi analisada. A inclusão de mais da estrutura craniofacial, especialmente outros músculos abertura da mandíbula, como os sternohyals e sua cartilagem anexo 23, poderia ter acrescentado ao modelo, mas as limitações incluem a capacidade de modelos maiores para ser executado no software Finite Element. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Outra limitação é que não temos modelada inserção do ligamento, embora isto poderia ser alcançado através da inserção de molas 8. Uma outra suposição feita neste caso foi que o modelo iria se comportar de forma linear. As magnitudes das tensões nos modelos eram comparáveis aos dos modelos publicados e aplicado a células in vitro 10,24, estirpes com estando abaixo de 3500 e -5000 μɛ acima para além de pontos de restrição e de ligação do músculo. Portanto, as estirpes com as regiões relevantes do modelo foram consideradas dentro de um intervalo aceitável para um modelo linear. Cartilagem não se comportam como um material inteiramente linear e foi previamente modelado como um material poroelástico, que permitiu a análise do comportamento de fluido no modelo 25. Espalhando os pontos de fixação muscular entre um conjunto de nós locais iria distribuir as forças de pico e representar com mais precisão a inserção do músculo para determinados músculos. ent &quot;&gt; O uso de FE permite uma avaliação das tensões e pressões que actuam sobre uma estrutura. Como uma técnica que é frequentemente usado em muitas disciplinas biociências incluindo ortopedia, paleontologia e, mais recentemente, biologia do desenvolvimento. Aqui nós descrevemos como construir FE para o peixe-zebra mandíbula inferior. no futuro desses modelos poderia ser alargado a olhar para toda a mandíbula, incluindo o paladar. técnicas similares poderiam ser usados ​​para modelar a biomecânica da coluna vertebral em peixes, que até à data têm sido quase sempre estudadas por meio cinemáticas.

Modelagem de elemento finito (FE) é uma técnica de engenharia que podem computacionalmente calcular e mapear a magnitude ea localização das cepas que actuam sobre uma estrutura 1. O modelo consiste na estrutura 3D, representado por uma malha de &quot;elementos finitos&quot;, e o resultado final da análise é governada por uma série de factores, incluindo a estrutura e o número de elementos na malha, a magnitude e a localização da mecânica cargas e as propriedades do material. As propriedades dos materiais descrevem certos aspectos do comportamento de um material em um determinado tipo de carga; O módulo de Young (E) descreve a elasticidade do material, enquanto que o coeficiente de Poisson descreve o decréscimo proporcional na largura de um material para o seu comprimento, quando uma amostra é alongada. modelagem FE pode ser utilizado para calcular uma variedade de variáveis, incluindo o deslocamento, tensão, pressão e agir pressão sobre o modelo, tendo em conta os dados de entrada originais sobre a estrutura &#39;; S forma, localização e magnitude das cargas e as propriedades dos materiais específicos. Modelagem FE é amplamente utilizado em engenharia 2 e cada vez mais para ortopédicos 3 e paleontológicos aplicações 4. No desenvolvimento de forças biomecânicas são conhecidos por actuarem como um estímulo em muitas células para activar respostas celulares 5-8 e é útil para prever a ambas as posições relativas e as magnitudes de estímulos mecânicos no desenvolvimento de sistemas de órgãos, no entanto, actualmente modelagem Fe tem sido pouco usado para o desenvolvimento do peixe-zebra. Tanto a cartilagem e osso foram mostrados para ser materiais mechanosensitive. Por exemplo, a compressão in vitro tem sido encontrado para activar vias condrogénicas, enquanto que a tensão foi demonstrado ser necessário para a formação óssea 9. FE análise (FEA) tem sido explorada para modelar estirpes agindo em amostras biológicas, incluindo aqueles que agem em elementos esqueléticos durante óssea formação 10. Outras aplicações incluem a sua utilização de desenvolvimento para prever a forma de uma junta depois de ter sido exposto a forças biomecânicas teóricos 11,12 e para mostrar o padrão de estirpes presentes durante a morfogénese do joelho pintainho articulação 8. Este protocolo destina-se a compartilhar a experiência de geração de superfícies em 3 dimensões, malhas e modelos de elementos finitos a partir de imagens confocal, com vista a compreender a mecânica de tecidos em desenvolvimento. Nós também mostram formas de validar os modelos FE embora a captura de informações deslocamento da articulação reais in vivo. Enquanto que utilizar a mandíbula peixe-zebra como um exemplar as mesmas técnicas podem ser utilizadas em qualquer pequeno sistema biológico para o qual a informação sobre a estrutura 3D do sistema músculo-esquelético pode ser obtido por imagem confocal ou multifotônica.

<table><tbody><tr><td>Coll2</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>Type II collagen antibody - stains all cartilage</td></tr><tr><td>A4.1025 / MF20</td><td>Developmental studies hybridoma bank</td><td>A4.1025</td><td>Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Low melt agarose</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9414-5G</td><td>For mounting zebrafish</td></tr><tr><td>MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td><td>Sigma</td><td>E10521-10G</td><td>To make anesthetic</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Fisher</td><td>T/3760/48</td><td>sample permeablilisation</td></tr><tr><td>Dylight 488 Mouse IgG</td><td>Thermofisher</td><td>35502</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>Dylight 550 Rabbit IgG</td><td>Thermofisher&amp;nbsp;</td><td>84541</td><td>Secondary antibody</td></tr><tr><td>SP8/SP5 or SPE confocal</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td></td><td>For imaging&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LAS Leica capture software</td><td>Leica</td><td></td><td>Imaging software</td></tr><tr><td>Aviso (version 7.0.0)</td><td>FEI Visualization Science Group</td><td></td><td>3D image analysis software (Section 2)</td></tr><tr><td>Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10)</td><td>Altair Engineering</td><td></td><td>FE model generating software (Section 4-5)</td></tr><tr><td>Abaqus (version 6.14)</td><td>SIMULIA</td><td></td><td>FE analysis software (Section 5.7-5.8)</td></tr></tbody></table>

building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Imunocoloração para o músculo (Figura 1A) e da cartilagem (Figura 1B) ou imagiologia de repórteres transgénicos (Figura 1C) permite que a estrutura 3D da mandíbula para ser visualizado, juntamente com a massa muscular associada. Por imagem com uma resolução elevada, foi possível construir um modelo que capta tanto a forma tridimensional da maxila (Figura 2) e a localização e colocação de cargas (Figura 3). Utilizando em deslocamentos vivo pode ser visto através de captura de vídeo de alta velocidade (Figura 4) verificou-se que a amplitude de movimento no modelo foi dentro de um intervalo realista. Os modelos FE uma vez a corrida pode ser usado para exibir uma variedade de dados, tais como estresse (Figura 5A), mínimo e deformação principal máxima (Figura 5B - K). Estes resultados são três-dim<html> ensional modo que o modelo pode ser ampliado para ver padrões finos de detalhes (Figura 5E, 5I) rodado para obter pontos de vista relevantes (Figura 5F, 5G, 5J 5K) e digitalmente seccionados (Figura 5E &#39;, 5E&#39; &#39;, 5I&#39;, 5I &#39;&#39;) para mostrar como os padrões de tensão, deformação ou alteração da pressão ao longo do modelo. Também é possível extrair dados quantitativos a partir do modelo (não representado). Ao verificar o modelo e utilizando as mais precisas as propriedades do material, cargas e malha forma o modelo FE pode ser usado para explorar a melhor estimativa do ambiente mecânico que está sendo experimentado pelas células durante essa janela de desenvolvimento. Os resultados do modelo pode ser directamente comparada com alterações no comportamento celular e a expressão do gene 20. <html> re 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Imagens representativas dos elementos músculo-esqueléticas da mandíbula peixe-zebra em 5 dpf pilhas confocal representativos da mandíbula inferior de larvas 5dpf tudo mostrado com anterior ao início (A) imunocoloração para A4.1025 que mancha toda a miosina esquelético (B) imunocoloração para colágeno Tipo II que marca toda a cartilagem (C) Stack a partir de uma larva viva expressar os repórteres COL2A1 transgênicos: muscular lenta GFP (verde): mCherry cartilagem (vermelho) e smyhc marcação. IA: intermandibularis anterior, PH: transferidor hyoideus, AM: mandibulae adutor, HI: hyoideus inferior, HI: hyoideus superior, CH: sternohyoideus, MC: cartilagem de Meckel, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> &quot;Fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> Figura 2: Geração de uma superfície 3D a partir de dados confocal Imagens que mostram a transição de dados confocal em uma superfície 3D para o maxilar inferior do peixe-zebra com maior ampliação da região conjunta.. (A) os dados confocal Raw; (B) do conjunto de dados após a aplicação de um filtro de Gauss; (C) esboço filtrada; Superfície (D) 3D. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> Figura 3: malhas representativos mostrando as limitações e vetores de força malhas representativos para uma larva 5 dpf para (A) de fecho e boca.(B) a abertura da boca. Pontos brancos denotar lugares em que o modelo é restritas e em que as dimensões (por exemplo, X e Y ou X, Y e Z). linhas brancas denotam posições musculares, com o vetor de força muscular indicado por setas brancas. Red mostra cartilagem e amarelo da Interzone. Este valor foi modificado a partir do material suplementar publicado anteriormente em Brunt et al. 15. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> Figura 4:. Os testes de sensibilidade FE-modelo simulando o deslocamento da mandíbula no peixe-zebra 5dpf para a cartilagem diferente e Interzone módulos de Young. Mandíbula deslocamento (aberto para fechado em um) está marcado na mandíbula; gravados utilizando a tecla de cor. Cada modelo (A - G) tem uma combinação diferente de cartilagem (C = 1,1, 3,1, ou 6,1 MPa) ou interzona (i = de 0,25, 0,5, 0,75, 1 ou propriedades MPa). Seta preta horizontal destaca o valor do deslocamento da mandíbula na ponta da cartilagem de Meckel (representado pela seta preta vertical). M e N alambiques de vídeos de 5 dpf larvas mostrando mínimos, ou seja, mandíbula fechada (M) e máxima, ou seja, mandíbula totalmente aberta (N) com os dois sobrepostos (o) - linha branca em o representa o deslocamento (de 43 m). Neste caso em relação propriedades de cartilagem de 1,1 com um interzona de 0,25 (A) melhor jogo, os deslocamentos visto em peixes vivos (O). Painéis AL desta figura foram previamente publicados em Brunt et al. 15. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma vers maiores</a>ion desta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> Figura 5: Os dados representativos dos modelos FE simulação FE-modelo de todos os músculos aplicados de 5 dpf larva (A - C).. (A) Von Mises (EMaxmin) (B) tensão mínima Principal (E Min. P, μɛ) (C) deformação principal máxima (E máx. P., μɛ). simulação FE-modelo de cepas máximas e mínimas principais durante a abertura da mandíbula. (D - K): deformação principal máxima (. E Max P., μɛ) em (D) vista mandíbula ventral e (E) visão conjunta ventral (E) mostra a localização das zonas proximal-distal através da cartilagem de Meckel conjunta eo interzona em (e &#39;) e (e&#39; &#39;), respectivamente. (F): de lateralmandíbula vista. (G): Vista lateral da junta. (H - K): tensão mínima Principal (. E Min P, μɛ) em (H) vista mandíbula ventral e (I) ventral visão conjunta. (I) mostra a localização das secções proximal-distal por meio de cartilagem articular de Meckel e INTERZONE em (I &#39;) e (I&#39; &#39;), respectivamente, (J): vista lateral da mandíbula. (K): Vista lateral da junta. Este número foi publicado anteriormente em Brunt et al. 15. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Número de fibras musculares </td><td> Área da fibra muscular (? M 2) </td><td> área grupo muscular (mm2) </td><td> Força (N) </td></tr><tr><td> 5 dpf intermandibularis anterior </td><td> 5 </td><td> 23,8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf transferidor hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23,8 </td><td> 142,8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf adutor mandibulae </td><td> 9 </td><td> 23,8 </td><td> 214,2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Quantificação muscular. Calculado forças muscular médio para o Intermandibularis anterior, Adutor mandibulae e transferidor Hyoideus a 5 dpf usando 40 nN / mm 2 (valor por unidade de área tirado de referência 17). (Lorga et al., 2011) (n = 3).

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Construindo modelos de elementos finitos para investigar a biomecânica da mandíbula do peixe-zebra | Biologia do Desenvolvimento | Vídeo

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

Construindo Modelos de Elementos Finitos para investigar Zebrafish Jaw Biomecânica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

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9.1K visualizações.  University of Bristol. Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw. 

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Biologia do Desenvolvimento

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

Tratamento de drogas e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Osteoblast-osteoclastos Interações em um modelo de Medaka Peixe Osteoporose

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be difficult to study, and can lead to confounding results. The protocol described here is a straightforward breeding paradigm to increase and decrease penetrance in lethal zebrafish skeletal mutants. Because lethal mutants cannot be selectively bred directly, the classic selective breeding strategy of progeny testing is employed. This method also includes protocols for Kompetitive Allele Specific PCR (KASP) genotyping zebrafish and staining larval zebrafish cartilage and bone. Applying the husbandry strategy described here can increase the penetrance of an interesting skeletal phenotype enabling more reproducible results in downstream applications. In addition, decreasing the mutant penetrance through this selective breeding strategy can reveal the developmental processes that most crucially require the function of the mutated gene. While the skeleton is specifically considered here, we propose that this methodology will be useful for all zebrafish mutant lines.

The goal of this protocol is to alter the penetrance of lethal skeletal mutant phenotypes in zebrafish by selective breeding. Lethal mutants cannot be grown to adulthood and bred themselves, therefore this protocol describes a method for tracking and selecting penetrance through multiple generations by progeny testing.

Mudando a Penetrância em Zebrafish com mutações esquléticas letais por testes na progênie

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Métodos para o Estudo do maxilar Zebrafish Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Biologia

Real Time and Repeated Measurement of Skeletal Muscle Growth in Individual Live Zebrafish Subjected to Altered Electrical Activity

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish with fluorescently-marked plasma membranes can be scanned in a confocal laser scanning microscope in order to determine the volume of muscle tissue and the number of muscle fibers present. Efficient approaches for the measurement of cell number and size in live animals over time are described and validated against more arduous segmentation methods. Methods are described that permit the control of muscle electrical, and thus contractile, activity. Loss of skeletal muscle contractile activity greatly reduced muscle growth. In larvae, a protocol is described that allows reintroduction of patterned electrical-evoked contractile activity. The described methods minimize the effect of inter-individual variability and will permit analysis of the effect of electrical, genetic, drug, or environmental stimuli on a variety of cellular and physiological growth parameters in the context of the living organism. Long-term follow-up of the measured effects of a defined early-life intervention on individuals can subsequently be performed.

Optical clarity is a major advantage for cell biological and physiological work in zebrafish. Robust methods for measurement of cell growth in individual animals are described that permit novel insights into how growth of skeletal muscle and neighboring tissues are integrated with whole body growth.

Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

A number of methods can be used to visualize individual cells throughout the body of live embryonic, larval or juvenile zebrafish. We show that live fish ...

<meta charset="utf8"></head><body>Remoção de escamas de peixe-zebra para cultura e estudos de biologia óssea

In Vitro Culturing Technique for Studying Cellular Dynamics in Zebrafish Scales

Zebrafish scales offer a variety of advantages for use in standard laboratories for teaching and research purposes. Scales are easily collected without the need for euthanasia, regenerate within a couple of weeks, and are translucent and small, allowing them to be viewed using a standard microscope. Zebrafish scales are especially useful in educational environments, as they provide a unique opportunity for students to engage in hands-on learning experiences, particularly in understanding cellular dynamics and in vitro culturing methods. The main objective of this protocol is to describe a method for collecting and maintaining zebrafish scales in culture for use in a variety of biological studies using basic laboratory equipment. Additionally, the protocol details their use in understanding bone homeostasis by examining the activity of bone cells involved in bone resorption and deposition. It also includes additional protocols for general techniques, such as the visualization of nuclei and apoptotic cells. The in vitro culturing protocol produces reliable results with minimal reagents and equipment. This article discusses the benefits of using in vitro cultures of zebrafish scales to foster scientific inquiry and outlines the resources needed to support their integration into educational settings.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: Avançando na pesquisa da atividade das células ósseas com escamas de peixe-zebra

This protocol offers a method to study cellular dynamics using a simple in vitro culture technique. It provides an opportunity for zebrafish researchers and educators to study cellular processes, such as those related to bone homeostasis and basic cell biology, by visualizing fluorescent nuclei and apoptotic cells within the scales.

Técnica de cultivo in vitro para estudo da dinâmica celular em escamas de peixe-zebra

Zebrafish scales offer a variety of advantages for use in standard laboratories for teaching and research purposes. Scales are easily collected without ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Construindo Modelos de Elementos Finitos para investigar Zebrafish Jaw Biomecânica

Resumo

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Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

Tratamento de drogas e

Mudando a Penetrância em Zebrafish com mutações esquléticas letais por testes na progênie

Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

Métodos para o Estudo do maxilar Zebrafish Barbel

Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

Técnica de cultivo in vitro para estudo da dinâmica celular em escamas de peixe-zebra

Técnica de cultivo in vitro para estudo da dinâmica celular em escamas de peixe-zebra

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Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal