The authors thank the staff of the Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) at Dartmouth for their expert care of the mice used for these studies. The authors also acknowledge Emily Clough for her excellent administrative support.

Todo o trabalho de animais utiliza protocolos revistos e aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) no Geisel Faculdade de Medicina de Dartmouth. 1. O Modelo rato <ol><li> A indução da doença desmielinizante TMEV Induzida <ol><li> Mover as gaiolas contendo SJL feminina ratos de 4 a 6 semanas de idade / jhan do rack para um espaço de trabalho confortável. Marque a ratos (por exemplo, com uma etiqueta de orelha ou punção da orelha) para permitir a avaliação individual de doença clínica e histológica. </li><li> Desenhar 30 ul de estoque TMEV infectando (unidades formadoras de 2 x 10 6 de placa; UFP) em PBS para uma seringa de insulina 29-gauge e agulha. </li><li> Prepare a máquina de gás de anestesia: verificar o sistema para garantir a presença de quantidades adequadas de oxigênio e isoflurano para a duração do procedimento. </li><li> Ligar o medidor de fluxo de 1 L / min. Colocar o animal na câmara de indução e selar o topo. Ligue o vaporizer para 3,5% e monitorar o animal até reclinada. </li><li> Remover o animal da câmara e testar o mouse por beliscar a pata para assegurar a anestesia adequada. A falta de resposta a um beliscão forte indica anestesia adequada. </li><li> Limpar o local de injecção com álcool isopropílico a 70%. </li><li> Injectar 30 ul de estoque infectar TMEV no hemisfério cerebral direito por injecção à mão livre (Figura 1). O local da injecção é de aproximadamente meio caminho entre a linha do olho e da orelha e apenas fora da linha média. </li><li> Devolver o mouse para sua gaiola de retenção, uma vez totalmente alerta e móveis (geralmente 3-5 min). </li><li> Eutanásia ratinhos por sangria ou perfusão cardíaca 3 a 6 meses após a infecção TMEV, dependendo da rapidez de desenvolvimento da doença. </li></ol></li></ol> 2. Análise Rotarod <ol><li> O Aparelho Rotarod <ol><li> ratinhos de teste antes da infecção TMEV a familiarizarem-se com omáquina e para avaliar o seu comando normal coordenação equilíbrio linha de base e motor. </li><li> Iniciar o protocolo de adaptação nos dias -5 infecção pós (dpi, ou seja, 5 dias antes da infecção TMEV). </li><li> Permitir que os ratinhos se adapte à sala de teste durante pelo menos 30 min antes do teste de rotarod, a fim de lhes permitir adaptar ao ambiente. </li><li> Certifique-se de que tanto a fonte Rotarod eo computador estão ligados e conectados entre si (Figura 2). </li><li> Pré-definir o rotarod com as -5 dpi parâmetros do protocolo de treinamento, conforme descrito na Tabela 1. </li><li> Salve o arquivo de trabalho com as informações de data e identificação. </li><li> Mover a gaiola contendo o time a ser testada a partir do rack para uma mesa ao lado do rotarod. Ratos são geralmente testados em esquadrões de 4. </li><li> Pegar um rato pela cauda e colocá-lo sobre a haste, de costas para o operador. Repita o procedimento para o segundo através da quarta mouse. Se um rato falls ou saltos, colocá-lo de volta em sua pista sobre o rotarod até que todos os ratos estão em posição. Ignorar se quaisquer camundongos virar-se para enfrentar o operador. </li><li> Depois de colocar todos os ratos, pressione o botão &quot;Enter&quot; para iniciar o experimento. Observe os temporizadores são iniciados automaticamente e as rotações por minuto (rpm) em exposição para cada pista. <ol><li> Como cada animal cai da haste, registar a velocidade da haste no momento da queda, bem como a duração do tempo que o animal permaneceu sobre a haste. A haste vai continuar a rodar até que o último animal caiu do conjunto da haste. </li></ol></li><li> Depois de todos os ratinhos tenham caído, usar um lenço de papel para remover qualquer boli fecais e de urina a partir da haste. A presença de urina e material fecal podem afectar a capacidade dos ratinhos para agarrar a haste. <ol><li> Depois de um descanso de 3 min, dar os ratos um segundo e depois um terceiro ensaio. O tempo máximo por único ensaio é de 240 segundos. Administrar um total de 3 ensaios durante cada dia de teste. </li></ol></li><li> Devolver os ratos para sua gaiola e devolvê-los de volta para o rack. No final da sessão experimental, limpar o Rotarod com sabão e água, para remover toda a matéria fecal para fora da máquina. </li><li> Limpe a placa de base com etanol 70%. Spray para baixo toda a máquina com dióxido de cloro para desinfectar. </li><li> No dia - 4, - 3, - 2, e - uma pi, pré-definir o Rotarod com os parâmetros do protocolo de formação adequadas, como descrito na Tabela 1, e repetir os passos 2.1.2 a 2.1.12. </li><li> Após a obtenção das medidas de linha de base, infectar os ratinhos com TMEV. Permitir um período de recuperação pi 6 dias. </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Protocolo </td><td rowspan="2"> Dia Testing </td><td rowspan="2"> Freqüência </td><td rowspan="2"> Velocidade de partida (rpm) </td><td rowspan="2"> MaxSpeed ​​(rpm) </td><td> Aceleração </td><td> Ensaios </td><td> ITI </td></tr><tr><td> (rpm / seg) </td><td> (N x seg) </td><td> (min) </td></tr><tr><td rowspan="4"> Treinamento </td><td> - 5 dpi </td><td> 1 dia </td><td> 1 </td><td> 12 </td><td> 01/03 </td><td> 3x240 sec </td><td> 3 </td></tr><tr><td> - 4 dpi </td><td> 1 dia </td><td> 1 </td><td> 13 </td><td> 01/03 </td><td> 3x240 sec </td><td> 3 </td></tr><tr><td> - 3 dpi </td><td> 1 dia </td><td> 1 </td><td> 14 </td><td> 01/03 </td><td> 3x240 sec </td><td> 3 </td></tr><tr><td> - 2; - 1 dpi </td><td> 1 dia </td><td> 5 </td><td> 40 </td><td> 01/03 </td><td> 3x240 sec </td><td> 3 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Experimental </td><td> De 7-50 dpi </td><td> 2 / semana </td><td>5 </td><td> 40 </td><td> 30/5 </td><td> 3x240 sec </td><td> 3 </td></tr><tr><td> De 51-150 dpi </td><td> 1 / Semana </td><td> 5 </td><td> 40 </td><td> 30/5 </td><td> 3x240 sec </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Parâmetros rotarod em treinamento e protocolos experimentais. <ol start="2"><li> O protocolo experimental Rotarod <ol><li> Em 7 dpi, pré-definir o Rotarod com os parâmetros do protocolo experimentais adequadas, como descrito na Tabela 1. Repita os passos 2.1.2 a 2.1.10. </li><li> No final do julgamento # 3, pesar cada rato e fazer uma nota do peso do corpo na folha de dados. Limpar e desinfectar o rotarod como por etapas 2.1.11 e 2.1.12. </li><li> Testar os ratinhos duas vezes por semana durante as 6 semanas seguintes, como descrito acima. Após 6 semanas (em que os ratos propensos atingiram uma fase de planalto) 8,9, teste a ratos uma vez por semana com o mesmo experimental protocolo. O protocolo de teste real dura uma média de 150 dias, dependendo do curso da doença específica. </li></ol></li><li> Índice Funcional neurológica <ol><li> Exportar os dados brutos em um arquivo de planilha e analisar os resultados. </li><li> Dados expressos como tempo de execução (Figura 3A): este é o tempo de execução normal mais o tempo de rotação passiva menos o tempo de atraso de rotação (Tabela 2) 10. Calcula-se a média de tempo de execução os três ensaios por dia. </li><li> Expressar os dados como um índice funcional neurológica (IFN; Figura 3B). <ol><li> Calcule o limite de desempenho de linha de base de cada rato individual. O limiar de desempenho da linha de base é determinada como a média de todos os tempos de execução de dias + 15 e + 45 pi 6,7. </li><li> Calcula-se a IFN-se a média dos três tempos de execução médios mais recentes dividido pelo limiar de 6,7 de ratinho específico que o desempenho da linha de base &lt;/ Sup&gt;. NOTA: Se a tempos de execução testado para um rato no dia + 72, + 76 e + 79 pi são 55 seg, 45 seg e 50 seg, eo tempo de linha de base para o mesmo rato foi de 135 segundos, o NFI para esse rato no 79 dpi será [(45 + 50 + 55) / 3] / 135 ou 0,37. </li></ol></li><li> Expressar os dados como um NFI ajustado (adjNFI; Figura 3C): ajustar os dados NFI por um valor de população para o único experimento. <ol><li> Calcula-se a adjNFI pela divisão do valor da média IFN por IFN obtidos pelo grupo tratado com sham naquele dia específico. </li></ol></li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Prazo </td><td> Definição </td></tr><tr><td> tempo de funcionamento normal </td><td> O tempo total que o rato gasta funcionando ativamente sobre a haste rotativa, ou seja, a latência a cair. </td></tr><tr><td> tempo de rotação passiva </td><td> a ummontagem de tempo que o rato tem-se mantido na haste no modo de rotação passiva. </td></tr><tr><td> tempo de atraso Rotação </td><td> A quantidade de tempo que o rato permanece na vara durante o modo de rotação passiva </td></tr><tr><td> modo de rotação passiva </td><td> Quando o rato agarra a vara e roda sem ter de deambular. </td></tr><tr><td> O tempo total da sessão </td><td> A quantidade total de tempo que o rato permanece na haste rotativa durante a sessão. </td></tr><tr><td> desempenho da linha de base </td><td> desempenho motor pré-danos avaliados para determinar o limite mínimo de desempenho. </td></tr><tr><td> Índice função neurológica (NFI) </td><td> Índice clínico, o que compara cada desempenho motor do mouse, ou seja, tempo de execução, a qualquer momento para seu desempenho máximo. </td></tr><tr><td> Ajustado Índice de função neurológica (adjNFI) </td><td> Quando um processo de normalização é aplicado para ajustar os dados IFN por um valor da população paraa única experiência. </td></tr><tr><td> valor da população </td><td> valor médio IFN obtidos pelo grupo submetida a tratamento simulado a um dia específico. </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Definições de rotarod parâmetros adotados para quantificar Neurological Impairment.

<ol>
	<li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theiler's+virus+infection+in+mice:+an+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination.">Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li><li>Pachner, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A Primer of Neuroimmunological Disease. , (2012).</li><li>Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+note+on+a+simple+apparatus+for+detecting+neurological+deficit+in+rats+and+mice.">A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice.</a> J Am Pharm Ass. 46, 208-209 (1957).</li><li>Ulrich, R., Kalkuhl, A., Deschl, U., Baumgartner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Machine+learning+approach+identifies+new+pathways+associated+with+demyelination+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis.">Machine learning approach identifies new pathways associated with demyelination in a viral model of multiple sclerosis.</a> J Cell Mol Med. 14, 434-448 (2010).</li><li>Lynch, J. L., Gallus, N. J., Ericson, M. E., Beitz, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpreting+the+effects+of+exercise+on+fear+conditioning:+the+influence+of+time+of+day.">Interpreting the effects of exercise on fear conditioning: the influence of time of day.</a> Behav Neurosci. 124, 868-872 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Despite some limitations, the Rotarod performance test represents an important tool for assessing motor function and dysfunction in TMEV-IDD as well as the effect of pharmacological interventions on disability progression in mice.
The Rotarod test was first described in 1957 as a tool for measuring neurological deficits in rodents11. Rodents have to walk on a rotating rod, with increasing rotating speed, and try to avoid falling to the ground. The latency to fall is recorded and used as a quantitative end point for motor function: the more neurological impairment the animals have, the sooner they fall off the rod. The clear advantage of this test over the traditional visual scoring systems is that it generates an objective variable that can be used for statistical purposes to quantify the effects of therapies and experimental procedures on disability progression3. Visual scoring systems such as the righting reflex test might be preferred as being a simpler and more rapid test to assess locomotor abilities in mice. However, these systems lack the precision of a more quantitative test like the Rotarod performance test, and they should therefore not be used to monitor the natural history or phenotypic changes of mice with mild and progressive neurological impairment. On the other hand, visual tests like the righting reflex test are particularly adapted to mice that are too young or too affected to be tested on the Rotarod.
In order to avoid distorted assessments of the Rotarod test, the testing parameters (i.e., size, speed, and acceleration of the rotating rod; amount of training given to the animal; and final data processing) must be carefully replicated3. Today, the Rotarod performance test is still the most commonly used motor behavioral test, yet there is little consensus on the ideal testing parameters to produce optimal results. We have found studies with TMEV-IDD mice that have used rod diameters from 1.18 to 1.6 in. (3 to 4 cm)12,13, fixed-speed rates of 5 to 10 rpm12,13, and acceleration rates of 5 to 10 rpm/min12-14. However, it is unknown whether the conclusions about neurological differences would generalize to other test conditions. The present protocol offers recommendations of specific testing parameters that were optimized and are thus suitable for studying progressive neurological disability in the TMEV-IDD mouse model of MS using the Rotarod test. Particularly, before embarking on a Rotarod motor function study in mice, it is recommended that a number of potentially important factors-among others, baseline performance and passive rotation-be considered.
First, regarding baseline performance: exercised and uninfected mice improve their motor performance over time, eventually reaching a stable plateau over several days or weeks8,9. This is the result of the normal process of motor learning. However, this improvement is not permanent, and if mice are left untrained for several days, their motor performance on the rotating rod will drop rapidly9. Therefore, a baseline performance determination is crucial to differentiate between motor learning and actual recovery after a therapeutic intervention, as well as between a physiological motor performance drop and worsening due to an experimental procedure.
Our optimized Rotarod protocol expects to train TMEV-IDD mice from + 15 to + 45 dpi (i.e., in between the acute encephalitis, which occurs within + 3 to + 12 dpi, and the late chronic demyelinating disease, which develops from + 30 to + 40 dpi)15. This allows for the evaluation of motor performance as a result of progressive demyelination and thus excludes any contributing deficits due to the early encephalitis. Ideally, the Rotarod training should be performed prior to disease induction. However, in order to develop a chronic infection of the CNS, SJL mice have to be injected with the virus before their 7th week of age16. Since it is generally accepted that the ages of animals that the Rotarod test can be performed on is 8 to 26 weeks17, an effective training session cannot be completed in mice before TMEV infection.
Training and baseline performance evaluation are also important to exclude the effect of low motivation, low basal performance, and low learning skills. Each animal is different, and these differences need to be considered in a motor performance evaluation. This is best remedied by using a baseline performance normalized index, also known as an NFI. This index also accounts for performance fluctuations that might be observed in mice during different testing sessions. Performance variability is a common issue in behavioral testing, mainly due to factors outside the experimental protocol, such as low motivation and past experiences of the animal. The mean running times for the last three time points of each mouse provides an estimate of the central tendency of the distribution that is expected if performance remains stable. This accounts for day-to-day individual performance variability. Severe neurological disability is then defined by NFI values of less than or equal to 0.3, whereas relatively unaffected mice are scored with NFI values greater than or equal to 0.7. Unfortunately, this strategy does not completely remove the problem that motivational changes might affect motor performance. To further address this problem, mice may be trained with the addition of specific motivating features, such as mild food deprivation prior to training or increased fear of falling caused by adjustable falling heights of 17.5 to 23.5 in. (44.5 to 60 cm).
Second, regarding passive rotations or looping: perhaps the most important threat to the validity of Rotarod data is the occurrence of passive rotations that arise when the mouse can cling on and rotate passively as the rod turns18. Although passive rotation is observed on the Rotarod, especially in mice experiencing motor coordination problems, this coping behavior may result in late falling off the rod, which would incorrectly indicate an absence of motor deficits. Therefore, a secondary measure of disturbed motor coordination, which should be considered in the data analysis, is the count of the number of times the mouse turns around the rod without falling off. Also, passive rotation is influenced strongly by task parameters such as the diameter, speed and acceleration degree of the rod18. There are no perfect solutions for reducing the risk of passive rotation, but a possible resolution may be the use of a rod with a larger diameter (i.e., 1.18 to 3.15 in. (3 to 8 cm)) or less pronounced ridges so as to slightly reduce the grip of the mouse.
A limitation of the Rotarod performance test is that the motor assessment is limited to a short observation time. Moreover, testing at different time points in the light-dark cycle may alter the outcome of behavioral testing19. Thus, in order to overcome these issues, several companies are developing innovative home cage analysis systems that provide 24/7 monitoring of rodent behaviors. These monitoring systems surely represent the newest and most exciting technology available in rodent behavioral research, but are still extremely expensive and not always accessible to research laboratories.
In summary, the Rotarod performance test is a relatively simple, inexpensive, and well-characterized test for long-term evaluation of neurological disability in TMEV-IDD, a murine model of progressive MS. The advantage of this test over the traditional clinical symptoms score systems is that it generates an objective variable to quantify the effects of different drugs, conditions, and procedures on motor function. Given the robustness of the Rotarod performance test, by applying a few simple precautions, as described above, this procedure provides a baseline against which to assess (1) the relevance of the TMEV-IDD mouse model to progressive MS and (2) its usefulness for testing therapies aimed at treating progressive neurological conditions such as MS.

de Theiler murinos Vírus da Encefalomielite (TMEV) é um vírus de ARN de cadeia simples que neurotrópico persistentemente infecta o sistema nervoso central de murino (SNC). Em ratinhos susceptíveis, a infecção com TMEV provoca, uma doença desmielinizante imunomediada-progressiva crónica, conhecida como doença desmielinizante induzida por TMEV (TMEV-DDI). A infecção experimental de ratinhos leva um curso da doença que se assemelha observada em formas progressivas de esclerose múltipla (EM). TMEV-DID é caracterizada por duas fases distintas: a fase aguda e a fase crónica. A fase aguda é, normalmente um 1,2 encefalite subclínica leve. A segunda fase, crónica, começando cerca de um mês após a infecção, é composto por uma deficiência lentamente progressiva caracterizada por desmielinização, inflamação e axonal 1,2 danos. A fraqueza observada em ratos está associada a espasticidade e, ocasionalmente, graves espasmos tônico. Porque há atualmente nenhuma medications para melhorar a incapacidade progressiva em pacientes, os investigadores estão particularmente atraídos por TMEV-IDD, o que representa um modelo animal ideal para o acompanhamento do impacto das drogas modificadoras da doença na progressão da doença. No entanto, em ratinhos, bem como em pacientes com esclerose múltipla, a monitorização da progressão da incapacidade requer uma observação clínica contínua ao longo de períodos de tempo prolongados. Em camundongos, monitorização a longo prazo para a progressão de incapacidade pode ser realizado com o teste de desempenho rotarod. O teste de desempenho Rotarod é um teste comportamental padrão que avalia funções associadas ao motor, como coordenação, equilíbrio e fadiga em roedores. Os ratos têm a manter o equilíbrio em uma haste de giro, que é rotativa em aceleração contínua; latência do tempo de queda a partir dessa haste é gravado. Os animais com disfunção neurológica é incapaz de permanecer na haste rotativa desde que controles, e eles normalmente caem quando a velocidade de rotação é superior à suacapacidade motora. O comprometimento mais neurológica os animais têm, quanto mais cedo eles cair a vara, e quanto menor a latência é o tempo. A vantagem do teste de rotarod ao longo dos sistemas de pontuação visuais tradicionais é que ele gera um objetivo, mensurável variável o tempo de latência que pode finalmente ser utilizada para análises estatísticas para quantificar os efeitos das terapias e procedimentos experimentais 3. No Laboratório de Neuroimunologia (LONI) em Dartmouth, os ratos são submetidos a um protocolo de adaptação, onde são testados antes da infecção TMEV, a fim de familiarizá-los com a máquina e para avaliar a sua &quot;base&quot; a coordenação normal de equilíbrio e controle motor 4, 5. Uma vez que a linha de base é estabelecida e os ratinhos são infectados com TMEV, eles são testados uma vez ou duas vezes por semana ao longo de um período de vários meses. O protocolo de teste real dura uma média de 150 dias, permitindo assim uma avaliação dao declínio do equilíbrio, coordenação e controle motor durante todo o curso da doença desmielinizante. Várias centenas de TMEV-DDI e tratados de forma simulada os ratos foram testados até agora para disfunção neurológica em Dartmouth. Estes ratinhos tinham recebido vários imunomoduladores, mas nenhum agente farmacológico foi encontrado para ser eficaz no melhoramento da progressão da incapacidade 6,7. O presente artigo e o protocolo relacionado descrevem como caracterizar o comprometimento neurológico progressivo apresentado por ratos TMEV-DDI. Em particular, o protocolo oferece recomendações de parâmetros de teste específicos acredita-se ser geralmente adequados para estudar incapacidade neurológica em ratinhos TMEV-DID utilizando o teste de rotarod. Este procedimento fornece uma linha de base para avaliar (1) a relevância deste modelo de rato para progressiva MS e (2) a sua utilidade para testar terapias destinadas a tratar condições neurológicas progressivas, tais como MS. Claramente, oteste de desempenho Rotarod e a corrente de protocolo de parâmetros e de teste optimizados não só são úteis na detecção de incapacidade neurológica progressiva no modelo de ratinho TMEV-DID, mas são também úteis na detecção de deficiências em outros modelos de ratinho genética induzida por vírus e / ou de doenças neurodegenerativas.

<table><tbody><tr><td>Mice SJL/JCrHsd 4 to 6 weeks old</td><td>Envigo</td><td>#052</td><td></td></tr><tr><td>TMEV virus stock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane vaporizer</td><td>Harvard Apparatus</td><td>#340471</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringes U- 100 29 g x 0.5 cc</td><td>BD</td><td>#328203</td><td></td></tr><tr><td>Rotamex-5 4 Lane Rota-Rod for Mice with RS-232 and Software</td><td>Columbus Instruments</td><td>#0890M</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring progressive neurological disability in a mouse model of multiple sclerosis

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

O objectivo desta experiência representativa foi comparar a incapacidade neurológica induzida pela estirpe Daniels (DA) e tensão de feijão de TMEV. Para efeitos do presente estudo, um grupo de 32 ratinhos fêmea SJL foram infectados por via intracraniana com TMEV, quer da estirpe DA (n = 16) ou a estirpe de feijão (n = 16), e os seus sinais clínicos foram monitorizados ao longo do tempo. Um grupo adicional de 20 ratos foi tratado simulada (ou seja, solução salina foi injectado por via intracraniana) e serviu como grupo de controlo saudável. O teste de desempenho Rotarod foi usada para avaliar a progressão da doença crónica em ratinhos TMEV-infectadas e controlos simulados. Os ratos foram individualmente marcados orelha e submetidos ao protocolo de adaptação ao dia na semana antes da injecção de TMEV e, em seguida, para o protocolo de teste real que durou 125 dias. Para cada dia de teste, o tempo de funcionamento, definida como o comprimento de TIme o rato ficou sobre a haste, foi armazenada individualmente para cada rato como a média dos 3 ensaios para esse dia. rotarod dados também é expressa como IFN e como adjNFI sham-normalizada. Como mostrado na Figura 3A, a infecção com TMEV afectados negativamente os tempos de execução dos ratinhos. A medidas repetidas ANOVA de duas vias revelou um efeito significativo de infecção TMEV (F = 56,76, p &lt;0,0001), bem como um efeito significativo de tempo (F = 3,26, p &lt;0,0001) e uma interacção tratamento tempo (F = 8,065, p &lt;0,0001). Teste de comparações múltiplas de Dunnett a seguir revelou que ambos os grupos de ratinhos infectados TMEV-NFI tinham valores significativamente mais baixos do que os dos ratos sham (p ≤ 0,01; Figura 3B). A diferença foi estatisticamente significativa a partir de dia + 61 pi até o final do follow-up (Figura 3B). Não houve diferença comparing progressão de incapacidade em camundongos infectados com a estirpe de feijão e os infectados com a estirpe DA em todos os momentos (p&gt; 0,5; Figura 3C). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54616/54616fig1.jpg" /> Figura 1:. Injeção intracraniana Para executar injeções intracranianos, o rato é e contido em uma superfície sólida anestesiados com gás. Até 30 ul são injectados com segurança no cérebro do rato. O local da injeção é aproximadamente a meio caminho entre a linha do olho e da orelha e apenas fora da linha média. Uma agulha 30 G penetra diretamente no crânio e uma seringa de insulina é convenientemente usado para evitar que a agulha se estende muito profundamente no cérebro. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54616/54616fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2:. O aparelho rotarod O teste rotarod é um ensaio neurocomportamental padrão em que os ratos são treinados para executar em uma haste rotativa e são cronometrados por quanto tempo eles podem ficar na haste, uma vez que lentamente se acelera. A haste é suspensa acima de um chão da gaiola, e os ratos naturalmente tentar permanecer na haste para evitar cair no chão. A queda a partir da haste para a base do instrumento não causa danos aos ratos. A) Um aparelho rotarod padrão consiste de uma haste accionada por um motor com velocidades constantes ou acelerando. B) Os painéis dividir a haste em pistas separadas, cada uma adequada para um animal individual. Um total de 4 ratinhos podem ser testados em cada ensaio. C) A haste é em 1,18. (Cerca de 3 cm) de diâmetro, e a sua superfície é serrilhada, permitindo que os ratinhos para obter uma melhor aderência. A queda do mouse é precisamente rastreados por um feixe de fotos quegrava automaticamente a quantidade de tempo gasto na haste. Os dados experimentais é registrado em um computador depois que os ratos têm todos caído da haste. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54616/54616fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54616/54616fig3.jpg" /> Figura 3:. Rotarod Teste de Desempenho em Ratos TMEV infectados e sham-controls O teste rotarod foi realizada para medir a função motora da farsa, DA-infectados, e os ratos de feijão-infectados. Além do tempo (seg) (A) em execução, os dados rotarod foram também expressas como um índice da função neurológica (IFN) (B), e um simulado normalizada ajustado IFN (adjNFI) (C). A latência a cair a partir de um rotarod a acelerar foi medida em três ensaios por dia. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (SEM). Blue círculo, n = 16 ratos feijão-infectados; quadrados vermelhos, n = 16 ratos DA-infectados; triângulos negros, n = 20 controles tratados com placebo. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54616/54616fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Medindo Progressive Neurological Disability em um modelo de rato com esclerose múltipla

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

measuring-progressive-neurological-disability-mouse-model-multiple

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.9K visualizações.  Geisel School of Medicine at Dartmouth. An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice. 

Vídeo: Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

Measuring Motor Coordination in Mice

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such as emotionality or cognition can be assessed, however, it is vital to determine whether the motor capabilities of e.g. a mutant or lesioned mouse allow such an assessment. Performance on a maze task requiring strength and coordination, such as the Morris water maze, might well be impaired in a mouse by motor, rather than cognitive, impairments, so it is essential to selectively dissect the latter from the former. For example, sensorimotor impairments caused by NMDA antagonists have been shown to impair water maze performance2. 
Motor coordination has traditionally been assessed in mice and rats by the rotarod test, in which the animal is placed on a horizontal rod that rotates about its long axis; the animal must walk forwards to remain upright and not fall off. Both set speed and accelerating versions of the rotarod are available.
The other three tests described in this article (horizontal bar, static rods and parallel bars) all measure coordination on static apparatus. The horizontal bar also requires strength for adequate performance, particularly of the forelimbs as the mouse initially grips the bar just with the front paws. 
Adult rats do not perform well on tests such as the static rods and parallel bars (personal observations); they appear less well coordinated than mice. I have only tested male rats, however, and male mice seem generally less well coordinated than females. Mice appear to have a higher strength:weight ratio than rats; the Latin name, Mus musculus, seems entirely appropriate. The rotarod, the variations of the foot fault test12 or the Catwalk (Noldus)15 apparatus are generally used to assess motor coordination in rats.

Protocols are presented for two established motor coordination tasks, the accelerating rotarod and horizontal bar, also two tests developed in Oxford recently, the static rods and parallel bars. These tests can detect motor impairments potentially of interest in their own right, as well as being possible variables in tests of other areas of behavior.

Medindo Coordenação Motora em Ratos

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

Neurociência

Clinical Testing and Spinal Cord Removal in a Mouse Model for Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disorder resulting in progressive degeneration of motoneurons. Peak of onset is around 60 years for the sporadic disease and around 50 years for the familial disease. Due to its progressive course, 50% of the patients die within 30 months of symptom onset. In order to evaluate novel treatment options for this disease, genetic mouse models of ALS have been generated based on human familial mutations in the SOD gene, such as the SOD1 (G93A) mutation. Most important aspects that have to be evaluated in the model are overall survival, clinical course and motor function. Here, we demonstrate the clinical evaluation, show the conduction of two behavioural motor tests and provide quantitative scoring systems for all parameters. Because an in depth analysis of the ALS mouse model usually requires an immunohistochemical examination of the spinal cord, we demonstrate its preparation in detail applying the dorsal laminectomy method. Exemplary histological findings are demonstrated. The comprehensive application of the depicted examination methods in studies on the mouse model of ALS will enable the researcher to reliably test future therapeutic options which can provide a basis for later human clinical trials.

Clinical Testing and Spinal Cord Removal in a Mouse Model for Amyotrophic Lateral Sclerosis ALS

A mouse model for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is examined clinically and behaviorally. As a prerequisite for an accompanying immunohistological analysis the preparation of the spinal cord is depicted in detail.

Testes clínicos e Remoção da Medula Espinhal em um modelo do rato para a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA)

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disorder resulting in progressive degeneration of motoneurons. Peak of onset is around 60 ...

Medicina

A Quick Phenotypic Neurological Scoring System for Evaluating Disease Progression in the SOD1-G93A Mouse Model of ALS

The SOD1-G93A transgenic mouse is the most widely used animal model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). At ALS TDI we developed a phenotypic screening protocol, demonstrated in video herein, which reliably assesses the neuromuscular function of SOD1-G93A mice in a quick manner. This protocol encompasses a simple neurological scoring system (NeuroScore) designed to assess hindlimb function. NeuroScore is focused on hindlimb function because hindlimb deficits are the earliest reported neurological sign of disease in SOD1-G93A mice. The protocol developed by ALS TDI provides an unbiased assessment of onset of paresis (slight or partial paralysis), progression and severity of paralysis and it is sensitive enough to identify drug-induced changes in disease progression. In this report, the combination of a detailed manuscript with video minimizes scoring ambiguities and inter-experimenter variability thus allowing for the protocol to be adopted by other laboratories and enabling comparisons between studies taking place at different settings. We believe that this video protocol can serve as an excellent training tool for present and future ALS researchers.

This video protocol describes a sensitive, reliable, and quick method for evaluating the neuromuscular deficits in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.

Um sistema de pontuação neurológica rápida fenotípica para a Avaliação de progressão da doença na SOD1 G93A-Rato modelo de ALS

The SOD1-G93A transgenic mouse is the most widely used animal model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). At ALS TDI we developed a phenotypic screening ...

Sagittal Plane Kinematic Gait Analysis in C57BL/6 Mice Subjected to MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the application of these techniques to identify gait deficits in a mouse model of MS, known as experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Paralysis and motor deficits in mice subjected to EAE are typically assessed using a clinical scoring scale. However, this scale yields only ordinal data that provides little information about the precise nature of the motor deficits. EAE disease severity has also been assessed by rotarod performance, which provides a measure of general motor coordination. By contrast, kinematic gait analysis of the hind limb in the sagittal plane generates highly precise information about how movement is impaired. To perform this procedure, reflective markers are placed on a hind limb to detect joint movement while a mouse is walking on a treadmill. Motion analysis software is used to measure movement of the markers during walking. Kinematic gait parameters are then derived from the resultant data. We show how these gait parameters can be used to quantify impaired movements of the hip, knee, and ankle joints in EAE. These techniques may be used to better understand disease mechanisms and identify potential treatments for MS and other neurodegenerative disorders that impair mobility.

Kinematic gait analysis in the sagittal plane yields highly precise information about how movement is executed. We describe the application of these techniques to identify gait deficits for mice subjected to autoimmune-mediated demyelination. These methods may also be used to characterize gait deficits for other mouse models featuring impaired locomotion.

Análise cinemática da marcha de sagital em camundongos C57BL/6 sujeitado a MOG35-55 induzido encefalomielite auto-imune Experimental

Kinematic gait analysis in the sagittal plane has frequently been used to characterize motor deficits in multiple sclerosis (MS). We describe the ...

Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing motor function deficits are basic readouts of the immune-mediated inflammation of the spinal cord. However, scores and body weight do not allow for an in vivo assessment of brain inflammation and optic neuritis. The latter is an early and frequent manifestation in about 2/3 of MS patients. Here, we show methods for bioluminescence and near-infrared live imaging to assess EAE evoked optic neuritis, brain inflammation, and blood-brain barrier (BBB) disruption in living mice using an in vivo imaging system. A bioluminescent substrate activated by oxidases primarily showed optic neuritis. The signal was specific and allowed the visualization of medication effects and disease time courses, which paralleled the clinical scores. Pegylated fluorescent nanoparticles that remained within the vasculature for extended periods of time were used to assess the BBB integrity. Near-infrared imaging revealed a BBB leak at the peak of the disease. The signal was the strongest around the eyes. A near-infrared substrate for matrix metalloproteinases was used to assess EAE-evoked inflammation. Auto-fluorescence interfered with the signal, requiring spectral unmixing for quantification. Overall, bioluminescence imaging was a reliable method to assess EAE-associated optic neuritis and medication effects and was superior to the near-infrared techniques in terms of signal specificity, robustness, ease of quantification, and cost.

We show a technique for in vivo live bioluminescence and near-infrared imaging of optic neuritis and encephalitis in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model for multiple sclerosis in SJL/J mice.

Bioluminescência e Near-infrared imagem de neurite óptica e Cérebro Inflamação no modelo de EAE de esclerose múltipla em ratinhos

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings provide a sensitive approach to measure nerve conduction in humans and rodent models. To broaden the technical possibilities for electromyography in mice, the measurement of compound muscle action potentials (CMAPs) from the brachial plexus nerve in the forelimb using needle electrodes is described here. CMAP recordings after stimulating the sciatic nerve in hindlimbs have been previously described. The newly introduced method here allows for the evaluation of the nerve conductivity at an additional site, and thus provides a more profound overview of the neuromuscular functionality. The technique provides information on both the relative number of functional axons and the myelination level. Thereby, this method can be applied to assess both axonal diseases as well as demyelinating conditions. This minimally invasive method does not require extraction of the nerve and therefore it is suitable for repeated measurements for longitudinal follow-up in the same animal. Similar recordings are performed in clinical setups to emphasize the translational relevance of the method.

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

The measurement of nerve conduction is a useful tool to assess mouse models of neurodegeneration but it is frequently only applied to stimulate the sciatic nerve in hindlimbs. Here, we describe a technique to measure compound muscle action potential (CMAP) in vivo in the mouse forelimb muscles innervated by the brachial plexus.

Na Vivo Eletrofisiológica medição do potencial de ação muscular composto de membros dianteiros em modelos de Mouse de degeneração do neurônio Motor

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Coloração histológica da medula espinhal para avaliação da gravidade da doença EAE

Scoring Central Nervous System Inflammation, Demyelination, and Axon Injury in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a common immune-based model of multiple sclerosis (MS). This disease can be induced in rodents by active immunization with protein components of the myelin sheath and Complete Freund&#39;s adjuvant (CFA) or by the transfer of myelin-specific T effector cells from rodents primed with myelin protein/CFA into na&#239;ve rodents. The severity of EAE is typically scored on a 5-point clinical scale that measures the degree of ascending paralysis, but this scale is not optimal for assessing the extent of recovery from EAE. For example, clinical scores remain high in some EAE models (e.g., myelin oligodendrocyte glycoprotein [MOG] peptide-induced model of EAE) despite the resolution of inflammation. Thus, it is important to complement clinical scoring with histological scoring of EAE, which also provides a means to study the underlying mechanisms of cellular injury in the central nervous system (CNS).
Here, a simple protocol is presented to prepare and stain spinal cord and brain sections from mice and to score inflammation, demyelination, and axonal injury in the spinal cord. The method for scoring leukocyte infiltration in the spinal cord can also be applied to score brain inflammation in EAE. A protocol for measuring soluble neurofilament light (sNF-L) in the serum of mice using a Small Molecule Assay (SIMOA) assay is also described, which provides&#160;feedback on the extent of overall CNS injury in live mice.

Autor em destaque: Revelando o caminho que liga a obesidade à inflamação autoimune na esclerose múltipla 

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) serves as an animal model of multiple sclerosis. This article describes an approach for scoring spinal cord inflammation, demyelination, and axonal injury in EAE. Additionally, a method to quantify soluble neurofilament light levels in the mice serum is presented, facilitating the assessment of axonal injury in live mice.

Pontuação de Inflamação, Desmielinização e Lesão do Axônio do Sistema Nervoso Central na Encefalomielite Autoimune Experimental

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a common immune-based model of multiple sclerosis (MS). This disease can be induced in rodents by ...

Imunologia e Infecção

Quantificando a disfunção locomotora em camundongos com lesão medular usando o MouseWalker

Using the MouseWalker to Quantify Locomotor Dysfunction in a Mouse Model of Spinal Cord Injury

The execution of complex and highly coordinated motor programs, such as walking and running, is dependent on the rhythmic activation of spinal and supra-spinal circuits. After a thoracic spinal cord injury, communication with upstream circuits is impaired. This, in turn, leads to a loss of coordination, with limited recovery potential. Hence, to better evaluate the degree of recovery after the administration of drugs or therapies, there is a necessity for new, more detailed, and accurate tools to quantify gait, limb coordination, and other fine aspects of locomotor behavior in animal models of spinal cord injury. Several assays have been developed over the years to quantitatively assess free-walking behavior in rodents; however, they usually lack direct measurements related to stepping gait strategies, footprint patterns, and coordination. To address these shortcomings, an updated version of the MouseWalker, which combines a frustrated total internal reflection (fTIR) walkway with tracking and quantification software, is provided. This open-source system has been adapted to extract several graphical outputs and kinematic parameters, and a set of post-quantification tools can be to analyze the output data provided. This manuscript also demonstrates how this method, allied with already established behavioral tests, quantitatively describes locomotor deficits following spinal cord injury.

Autor em destaque: Usando o MouseWalker para quantificar a disfunção locomotora em um modelo de camundongo com lesão medular  

An experimental pipeline to quantitatively describe the locomotor pattern of freely walking mice using the MouseWalker (MW) toolbox is provided, ranging from initial video recordings and tracking to post-quantification analysis. A spinal cord contusion injury model in mice is employed to demonstrate the usefulness of the MW system.

Medindo Progressive Neurological Disability em um modelo de rato com esclerose múltipla

Resumo

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Medindo Coordenação Motora em Ratos

Testes clínicos e Remoção da Medula Espinhal em um modelo do rato para a Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA)

Um sistema de pontuação neurológica rápida fenotípica para a Avaliação de progressão da doença na SOD1 G93A-Rato modelo de ALS

Análise cinemática da marcha de sagital em camundongos C57BL/6 sujeitado a MOG35-55 induzido encefalomielite auto-imune Experimental

Bioluminescência e Near-infrared imagem de neurite óptica e Cérebro Inflamação no modelo de EAE de esclerose múltipla em ratinhos

Na Vivo Eletrofisiológica medição do potencial de ação muscular composto de membros dianteiros em modelos de Mouse de degeneração do neurônio Motor

Pontuação de Inflamação, Desmielinização e Lesão do Axônio do Sistema Nervoso Central na Encefalomielite Autoimune Experimental

Pontuação de Inflamação, Desmielinização e Lesão do Axônio do Sistema Nervoso Central na Encefalomielite Autoimune Experimental

Pontuação de Inflamação, Desmielinização e Lesão do Axônio do Sistema Nervoso Central na Encefalomielite Autoimune Experimental

Uso do MouseWalker para Quantificar a Disfunção Locomotora em um Modelo de Lesão Medular em Camundongos