Name: extraction of structural extracellular polymeric substances from aerobic granular sludge
Uploaded: 2016-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge at JoVE.com

This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW - Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.

NOTA: AGS foi recolhida a partir do reator piloto Nereda na estação de tratamento de águas residuais Utrecht, na Holanda. O reactor foi alimentado com esgoto municipal. O lodo granular tinha um índice de volume de lodo (SVI 5min) de 59,5 ml / g VSS. A lama foi amostrado em abril, no final de um ciclo aeróbio. Depois da amostragem, a lama foi imediatamente transportada para o laboratório, peneirado e armazenado a -20 ° C até à sua utilização. 1. EPS Extração NOTA: Centrífuga lamas granulares a 4.000 x g e 4 ° C durante 20 minutos, e decanta-se o sobrenadante. Recolher o sedimento em grânulos para as extracções. Os sólidos totais (TS) e sólidos voláteis (VS) dos grânulos foram determinados pelos métodos padrão 23. O factor de conversão entre grânulo peso húmido - peso dos grânulos obtidos directamente a partir do sedimento - e TS foi determinada antes da extracção. Todas as extracções foram realizadas em triplicado. NOTA: 3 g g molhadaranules foram usadas para cada método de extracção. Os valores de TS e VS (0,39 g TS e 0,34 g VS), medido em triplicado, foram utilizados para calcular o rendimento de extracção. <ol><li> Extração de centrifugação 11 <ol><li> Transferência de 3 g (peso húmido) de grânulos para um tubo de centrifugação e encher-se o tubo de centrifugação de 50 ml com água desmineralizada. </li><li> Ligeiramente agitar o tubo de centrifugação com a mão. </li><li> Centrifugar o tubo de centrifugação contendo a mistura a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante numa proveta de vidro, descartar o sedimento e continuar com o sobrenadante tal como descrito na secção 1.7. </li></ol></li><li> Extração de sonicação 10 <ol><li> Transferência de 3 g (peso húmido) de grânulos para um tubo de centrifugação e encher-se o tubo de centrifugação de 50 ml com água desmineralizada. </li><li> Aplicar ultra-sons pulsada no gelo durante 2,5 minutos a 40 W para a mistura. </li><li> Centrifugar a centrifugaçãotubo contendo a mistura a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante numa proveta de vidro, descartar o sedimento e continuar com o sobrenadante tal como descrito na secção 1.7. </li></ol></li><li> Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) extracção 11 <ol><li> Transferência de 3 g (peso húmido) de grânulos dentro de uma garrafa de vidro de 100 ml e encher-se o frasco a 50 ml com 2% (w / v) de solução de EDTA. </li><li> Ligeiramente agitar o frasco com a mão e armazená-lo na geladeira a 4 ° C durante 3 horas. </li><li> Transferir a mistura para um tubo de centrifugação de 50 ml. </li><li> Centrifugar o tubo de centrifugação contendo a mistura a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante numa proveta de vidro, descartar o sedimento e continuar com o sobrenadante tal como descrito na secção 1.7. </li></ol></li><li> Formamida - extracção de hidróxido de sódio (NaOH) 13 <ol><li> Transferência de 3 g (peso húmido) de grânulos em um 100garrafa de vidro ml e encher a garrafa para 50 ml com água desmineralizada. </li><li> Adicionar 0,3 ml de 99% de formamida. </li><li> Ligeiramente agitar o frasco com a mão e armazená-lo na geladeira a 4 ° C durante 1 h. </li><li> Adiciona-se 20 mL de NaOH 1 M até a suspensão do grânulo. </li><li> Ligeiramente agitar o frasco com a mão e armazená-lo na geladeira a 4 ° C durante 3 horas. </li><li> Transferir a mistura uniformemente em dois 50 ml tubo de centrifugação. </li><li> Centrifugar os tubos de centrifugação contendo a mistura a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante numa proveta de vidro, descartar o sedimento e continuar com o sobrenadante tal como descrito na secção 1.7. </li></ol></li><li> Extracção de NaOH a 11 - formaldeído <ol><li> Transferência de 3 g (peso húmido) de grânulos dentro de uma garrafa de vidro de 100 ml e encher-se o frasco a 50 ml com água desmineralizada. </li><li> Adicionar 0,3 ml de formaldeído a 37%. </li><li> Ligeiramente agitar o frasco com a mão e loja-la no frigorífico a 4 ° C durante 1 h. </li><li> Adiciona-se 20 mL de NaOH 1 M até a suspensão do grânulo. </li><li> Ligeiramente agitar o frasco com a mão e armazená-lo na geladeira a 4 ° C durante 3 horas. </li><li> Transferir a mistura uniformemente em dois 50 ml tubo de centrifugação. </li><li> Centrifugar os tubos de centrifugação contendo a mistura a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante numa proveta de vidro, descartar o sedimento e continuar com o sobrenadante tal como descrito na secção 1.7. </li></ol></li><li> Alta temperatura - extracção de carbonato de sódio (Na 2 CO 3) 9,22,24 <ol><li> Pré-aquecimento de 150 ml de água da torneira numa proveta de vidro de 1000 ml com um agitador magnético a 80 ° C. </li><li> Transferência de 3 g (peso húmido) de grânulos de 250 ml com deflectores balão e encher-se o balão para 50 ml com água desmineralizada. </li><li> Adicionar 0,25 g de Na 2 CO 3 anidro ou 0,67 g de Na 2 CO 3 • 10H <sUB&gt; 2 O para dentro do frasco para obter uma solução a 0,5% (w / v) de Na 2 CO 3 a concentração. </li><li> Colocar o frasco contendo a mistura no banho de água. Cobrir o frasco e a proveta de vidro separadamente com folha de alumínio para evitar a evaporação. </li><li> Agita-se a mistura durante 35 min a 400 rpm e 80 ° C. </li><li> Transferir a mistura para um tubo de centrifugação de 50 ml. </li><li> Centrifugar o tubo de centrifugação contendo a mistura a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. </li><li> Recolher o sobrenadante e descartar o pellet. </li></ol></li><li> TS e VS medição de todos os extractos de acordo com os métodos padrão 23. <ol><li> Leve o sobrenadante e diálise-lo por 24 horas contra 1,000 ml água ultrapura (saco de diálise com 3500 Da de peso molecular de corte (MWCO)) 11,12. Mudar a água de diálise após 12 h para aumentar o efeito da diálise. </li><li> Transferir uma fracção razoável (cerca de 1/3) do sobrenadante dialisado paraum prato de alumínio para TS e VS medição 23. NOTA: Secar a amostra durante a noite a 105 ° C. A diferença de peso do prato de alumínio vazia eo prato de alumínio que contém a amostra seca é o conteúdo TS. Em seguida, gravar o mesmo prato de alumínio que contém a amostra a 550 ° C durante 2 h. A diferença de peso entre o prato de alumínio vazia e o prato de alumínio que contém a amostra é queimado o teor de cinzas. A diferença entre o teor de TS e cinzas é o conteúdo VS. </li><li> Para cada extracto, transferir a fracção residual do sobrenadante dialisado a 10 ml provetas de vidro. Engrossar o sobrenadante durante 2 dias a 60 ° C até um volume final de 1-2 ml a aumentar a concentração do polímero no sobrenadante. </li></ol></li></ol> 2. O alginato-like Extracelular Polymer (ALE) Extração <ol><li> Diálise do extracto obtido no passo 1.6.8 acordo com o passo 1.7.1. </li><li> Transferir o extracto dialisado contra 250 ml de uma proveta de vidro. LentoLY agita-se a extracção, a 100 rpm e temperatura ambiente. Constantemente monitorizar as alterações de pH com um eléctrodo de pH, enquanto que a adição de ácido clorídrico 1 M (HCl) a um pH final de 2,2 ± 0,05 para obter ALE sob a forma ácida. </li><li> Depois de ajustar o pH para 2,2, o extracto transferir para um tubo de centrifugação de 50 ml e centrifugar a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. </li><li> Descartar o sobrenadante e recolher o sedimento tipo gel. O sedimento tipo gel é ALE sob a forma ácida. </li><li> Para obter a forma de ALE de sódio (ou potássio), adiciona-se lentamente NaOH a 0,5 M (ou hidróxido de potássio 0,5 M) para o gel obtido no passo 2.4, enquanto se mistura lentamente o gel com uma vara de vidro com as mãos até pH 8,5 é atingida. </li></ol> Teste de Formação 3. Ionic Hidrogel NOTA: A fim de verificar se os EPS extraídos tinha propriedades de formação de hidrogel iônicos, um teste de formação do grânulo com Ca 2+ foi utilizado 25. <ol><li> Depois de espessamento do extracto no passo 1.7.3 paraum volume de 1-2 ml, agita-se a mistura lentamente com uma vara de vidro e ajustar o seu pH para 8,5 com NaOH 0,5 M. </li><li> Aqui o extracto do passo 3.1 ou o ALE de sódio do passo 2.5 e escorrer lentamente o extracto com uma pipeta de Pasteur, para um 2.5% (w / v) de cloreto de cálcio a solução (CaCl 2). NOTA: Se o EPS extraído tem gel de hidrogel iônica propriedades de formação, em forma de gota (esféricas) grânulos será formada. Se o EPS extraída tem nenhum gel hidrogel iónico propriedades de formação, o extracto se dispersa na solução de CaCl2. </li></ol> 4. Teste de Estabilidade da iónico Hidrogel NOTA: Para compreender melhor o papel do hidrogel EPS iónicos na estrutura de formação AGS, testes de estabilidade foram realizados sobre as pérolas de hidrogel iónicos do Na 2 CO 3, extracção recolhidas no passo 3.2. <ol><li> Manter as pérolas de hidrogel durante 30 minutos na solução de CaCl2. </li><li> Use uma colher para retirar as pérolas de hidrogel do CaCl2 </sub&gt; solução e dividir as contas em quatro fracções iguais. </li><li> fracção da loja 1 em 10 ml de água desmineralizada, durante 4 h a 4 ° C. Os seguintes testes de estabilidade foram realizados da mesma maneira como descrito nos métodos de extracção de 1,3 - 1,5. </li><li> fracção da loja 2 em 10 ml de 2% (w / v) de solução de EDTA durante 3 horas a 4 ° C. </li><li> fracção 3 da loja em 7,15 ml de água desmineralizada com 60 ul de formamida a 99% durante 1 hora a 4 ° C. Em seguida, adicionar 2,85 ml de NaOH 1 M e armazenar fracção 3 durante 3 h a 4 ° C. </li><li> fracção de loja 4, em 7,15 ml de água desmineralizada com 60 ul de 37% de formaldeído, durante 1 hora a 4 ° C. Em seguida, adicionar 2,85 ml de NaOH 1 M e armazenamento correspondente a 4 durante 3 horas a 4 ° C. </li><li> Monitor, se há desintegração visível dos grânulos durante o armazenamento sob as condições descritas no 4,3-4,6 para avaliar se os grânulos de suportar as condições de extracção. </li></ol>

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	<li>Pronk, M., de Kreuk, M. K., de Bruin, B., Kamminga, P., Kleerebezem, R., van Loosdrecht, M. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+scale+performance+of+the+aerobic+granular+sludge+process+for+sewage+treatment.">Full scale performance of the aerobic granular sludge process for sewage treatment.</a> Water Res. 84, 207-217 (2015).</li><li>Kreuk, M. K., Kishida, N., van Loosdrecht, M. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerobic+granular+sludge+-+state+of+the+art.">Aerobic granular sludge - state of the art.</a> Water Sci. Technol. 55 (8-9), 75 (2007).</li><li>Adav, S. S., Lee, D. J., Show, K. Y., Tay, J. 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Biotechnol. 188, 130-135 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Observações para a seção de protocolo A extracção de EPS / ALE é descrito para um volume de 50 ml e 3 g de grânulos. Estes valores são apenas orientações. Extrações com concentrações mais elevadas do grânulo pode diminuir o rendimento dos EPS extraídos. Durante a extracção de ALE a temperatura deve ser mantida constante a 80 ° C durante 30 min. O tempo necessário para a mistura a aquecer-se (cerca de 5 min) está incluído no protocolo. Além disso, a eficácia de extracção é melhorada usando uma barra de agitação magnética com o mesmo tamanho que o diâmetro do fundo do frasco. Isto irá resultar em boas propriedades de mistura e efeitos de fresagem, promovendo a extracção de EPS. Mais tarde, na seção de protocolo, são determinados TS e VS rendimentos de todas as extrações (sobrenadante recolhidos em passos 1.1-1.6). A diálise deve ser realizada antes da TS e VS medição para diminuir possíveis erros, devido à presença de produtos químicos utilizados para a extracção. UMAMWCO de 3500 Da é recomendado para remover estes produtos químicos, mantendo as macromoléculas EPS dentro do saco de diálise. O saco de diálise deve ter um volume maior do que o volume do extracto. Isto é necessário, porque o volume do extracto irá aumentar durante a diálise (por exemplo, para extracção de EDTA até aumento de volume de 40%). A extensão da remoção química por diálise pode ser determinada medindo o pH na amostra antes e após a diálise. Alternativamente, as medições de condutividade da água de diálise mostrar a extensão da remoção de iões. Para obter ALE total extraído a partir dos EPS (passos 1.6 e 2) o passo de diálise é opcional. No entanto, a diálise tem três vantagens: reduz a quantidade de HCl necessário para a precipitação, que melhora a transferência de massa de ácido no extracto e diminui o teor de cinzas do ALE obtido. Para a precipitação do ALE é recomendado o uso de um copo de vidro com um volume muito maior do que a extract. Na 2 CO 3 é normalmente administrado em doses a extracção. O HCl adicionado vai reagir primeiro com o Na 2 CO 3 a esquerda no extracto, resultando na formação de dióxido de carbono e, se a amostra não foi dializada antes, na formação de espuma. Durante a adição de HCl, o extracto deve ser agitada lentamente com uma barra de agitação magnética com o mesmo tamanho que o fundo do copo. Uma barra de agitação deste tamanho e a agitação lenta irá resultar em uma mistura uniforme sem quebrar a estrutura do precipitado. Se grumos de gel de ácidos são formados no extracto, a taça deve ser rodado ligeiramente à mão. A precipitação é realizada com uma concentração de ácido de 1 M para evitar um grande aumento de volume do extracto, enquanto ainda se obtém uma distribuição homogénea do ácido na amostra. Maiores concentrações de ácido pode resultar numa formação de diminuição do pH regional e grumos de gel ácidas. Um pH inferior a 2,0 diminui a quantidade de ALE que pode ser recuperada, provavelmente devido a alterações estruturaisdos polímeros a um pH mais baixo. Por conseguinte, é importante manter o pH final de 2,20 ± 0,05. limitações O método de extracção ALE pretende extrair polímeros extracelulares estruturais do RPE de AGS ou biofilmes em geral e não se destina a extrair todas EPS presentes. Para extrair todos os EPS, uma combinação de mais de um método de extracção é necessária. Além disso, como mostrado com o aumento do rendimento VS EPS por aplicação de uma extracção dupla e quádrupla, uma única extracção não irá extrair todos os EPS estruturais. extracção ALE é um método de extracção de EPS dura, combinando mistura constante com as condições de calor e alcalino-terrosos. Por este motivo, é possível que algum material intracelular é extraído juntamente com o EPS. Embora a lise das células pode ser causado por técnicas de extracção química e física (sonicação 31,32, 31,32 NaOH, EDTA 11,32, CER 32, 32 de calor e elevada tensão de corte por taxas mixing 19), a presença de material intracelular em EPS recuperados ainda precisa de ser verificada. A propriedade iônica de formação de gel das EPS extraídos é o foco principal desta pesquisa, se o EPS recuperado contém material intracelular não foi analisada. A pesquisa futura incidirá sobre a identificação de material intracelular nas EPS extraídos. De solubilização da matriz de hidrogel de AGS é crucial para extrair EPS estruturais EPS forma uma matriz de hidrogel denso e compacto em AGS. Embora EPS contém diversas classes de macromoléculas orgânicas, tais como polissacáridos, não proteínas, ácidos nucleicos, (fosfo) lípidos, substâncias húmicas e alguns polímeros intercelulares 7,5,8, todos eles formam um gel. Apenas esses polímeros formadores de gel são aqui considerados como polímeros estruturais em EPS. O objetivo do EPS extrações é a primeira a solubilizar EPS e, em seguida, para recolher os EPS solubilizados. Se os EPS estruturais (ou seja, tele EPS formando um hidrogel) é o alvo de extracção, a matriz de gel de AGS tem de ser solubilizada em primeiro lugar. Apenas os métodos que podem solubilizar a matriz de gel são capazes de extrair EPS estruturais. Nesta pesquisa, alguns usados frequentemente EPS métodos de extração, como a centrifugação de 10 - 15, ultra-sons 10,14,15, EDTA 10 - 12,14,15, formaldeído + NaOH 10 - 15 e formamida + NaOH 13 não poderia de forma eficiente isolar o estrutural EPS. Isto é devido ao facto de a matriz de hidrogel dos grânulos aeróbicas não foi solubilizado por estes métodos. Por esta razão, os testes de estabilidade na secção 4 só foram realizadas com as condições presentes em EDTA, formamida + NaOH e formaldeído + extração de NaOH. Estes três extracções não foram capazes de isolar EPS estruturais, mas ainda obtido o maior rendimento VS EPS além de Na 2 CO 3 a extracção. condições Sf o Na 2 CO 3 a extracção não foram aplicadas como este método de extracção claramente solubilizado a matriz AGS. Daí as condições aplicadas durante o teste de estabilidade foram consideradas representativas. Extração com resina de troca catiônica (CER), um outro método de extração EPS usado com freqüência, não foi considerado para esta comparação, como os estudos anteriores sobre EPS extracção com CER não deu melhores resultados do que as extrações químicas utilizadas aqui. Gel de formação de EPS em AGS EPS formador de gel são considerados como os EPS estruturais na matriz de hidrogel de AGS. É importante ressaltar que existem vários tipos de hidrogéis tais como géis iônicos, géis induzidas pela temperatura e géis induzidas pH. Este estudo incide apenas sobre EPS que formam géis iônicos. No que diz respeito à grande fracção de material de gel estrutural extraída, isto é provável que seja o EPS estruturais dominantes. Existem, certamente, possibilidades que outros tipos de EPSque forma diferentes tipos de hidrogéis (por exemplo, o pH do gel induzida 28) existem no mesmo ou em outro tipo de grânulos aeróbias. No entanto, não importa que tipo de hidrogel é alvo, solubilização da matriz de gel EPS é o passo mais importante para extrair EPS de formação de gel. Atualmente, pouca pesquisa foi feita em EPS estruturais de lodo granular. A extracção ALE descrito neste protocolo é capaz de extrair EPS formadores de gel de AGS e será utilizado em estudos futuros para caracterizar EPS estruturais. Mais pesquisa precisa ser feito na AGS, EPS estruturais e EPS não-estruturais para compreender melhor o processo e função de granulação e EPS. Especialmente os seguintes três pontos precisam ser investigados: por microorganismos produzem uma quantidade tão grande de EPS, qual é a composição exata do EPS e como é a composição do EPS modificada dependendo das mudanças ambientais. Detecção e análise de todos os compostos envolvidos e suas interactions irá ajudar a compreender biofilmes e como usá-los a nosso favor.

Nos últimos anos o processo aeróbio lodo granular (AGS) tornou-se um processo de tratamento biológico de águas residuais popular, aplicado com sucesso em vários de grande escala estações de tratamento de águas residuais 1. Em contraste com o processo convencional de lamas activadas, nas AGS processar os microrganismos formar grânulos, em vez de flocos 2. Estes grânulos têm melhor sedimentabilidade, são capazes de suportar cargas orgânicas mais elevadas e têm maior tolerância à toxicidade de flocos de lamas activadas 3. Ao contrário de biofilmes, AGS é formada espontaneamente, sem o envolvimento de qualquer material de suporte 4. Em AGS, como em biofilmes, microorganismos produzem uma quantidade significativa de substâncias poliméricas extracelulares altamente hidratados (EPS) 5 para formar uma matriz de hidrogel no qual eles são auto-imobilizada 4-6. EPS são uma mistura complexa, que consiste em polissacarídeos, proteínas, ácidos nucleicos, (phospho) lipídios, substâncias húmicas e alguns polímeros intercelulares 5,7,8. Estas substâncias poliméricas interagir um com o outro por meio de forças electrostáticas, ligações de hidrogénio, forças iónicas atractivas e / ou as reacções bioquímicas, etc. 5, formando uma estrutura terciária rede densa e compacta. Os polímeros em EPS, que são capazes de formar hidrogéis 4,9 e contribuem para a formação da estrutura da rede terciária são a este respeito considerado como EPS estruturais, um subconjunto do total de EPS. EPS são responsáveis pela estrutura química e propriedades físicas de grânulos 5. Portanto, é crucial para entender a função de cada composto EPS. Várias abordagens são aplicados para extrair EPS 10-15. No entanto, devido à sua extrema complexidade, que é quase impossível para extrair todos os componentes EPS por um método único. Até à data, não existe um &quot;one size fits all&quot; método de extracção EPS. A escolha do método de extracção influencia não só a quantidade total, mas também a composição dos polímeros recuperados 13,16 - 20. Dependendo do tipo de lamas e o RPE de interesse métodos diferentes são necessários. Extraindo polímeros formadores de gel, caracterizar as suas propriedades e investigar as suas interacções com o outro e com EPS não-formadores de gel vai ajudar a revelar o papel de EPS na formação de lodo aeróbico granular. Além disso, os polímeros formadores de gel também são biopolímeros útil em aplicações industriais. Uma aplicação possível já foi demonstrada por utilização de polímeros formadores de gel de AGS como um material de revestimento para aumentar a resistência à água do papel 21. Portanto, são necessários métodos de extracção, específicos para EPS de formação de gel. O objetivo deste estudo é desenvolver uma metodologia para extrair EPS de formação de gel da AGS. Seis métodos de extração 10-15,22, que são frequentemente utilizados na literatura, foram selecionados para extrair EPS da AGS. O montante total e da propriedade de formação de gel das EPS extraídos foram comparados para cada metodologia.

<table><tbody><tr><td>250 ml baffled flask</td><td>Kimble</td><td>25630-250</td><td></td></tr><tr><td>1,000 ml glass beaker</td><td>VWR</td><td>213-1128</td><td></td></tr><tr><td>RCT basic, magnetic stirrer with thermometer</td><td>IKA</td><td>3810000</td><td></td></tr><tr><td>sodium carbonate decahydrate</td><td>Merck KGaA</td><td>1063911000</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifugation tubes</td><td>greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1 S-R, centrifuge</td><td>Heraeus/Thermo Scientific</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>hydrochloric acid, 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1L-GL-D</td><td></td></tr><tr><td>250 ml glass beaker</td><td>VWR</td><td>213-1124</td><td></td></tr><tr><td>calcium chloride dihydrate</td><td>Merck KGaA</td><td>1023821000</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Pasteur Pipette</td><td>Copan</td><td>201C</td><td></td></tr></tbody></table>

extraction of structural extracellular polymeric substances from aerobic granular sludge

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.

extração de EPS A aparência dos grânulos após a aplicação de processos de extracção diferentes EPS é mostrado na Figura 1. A forma e estrutura de gel de grânulos estavam intactos após a centrifugação (Figura 1a) e de extracção de EDTA (Figura 1C). Os grânulos foram divididos em fragmentos de diferentes tamanhos por sonicação. A turbidez na fase líquida pode ser devido a suspensão de fragmentos pequenos (Figura 1B) como a turbidez altamente diminuída após a centrifugação. Formamida e formaldeído por si só não teve nenhum impacto sobre como alterar a forma do grânulo e a sua estrutura de gel (dados não mostrados). Após a adição de NaOH, a fase líquida virou amarelado. Algum material macio foi isolada a partir da superfície dos grânulos e formou uma camada na parte superior dos grânulos constante (Figura 1d e 1e). Ainda, a forma dogrânulos não foi alterada. A adição de NaOH aparentemente melhorada EPS solubilização, mas não pode danificar a estrutura de matriz de gel. Em comparação, grânulos desapareceu completamente após Na 2 CO 3 de extracção (Figura 1F). Em vez de uma mistura de partículas gelatinoso líquidos e pequenas como SOL-se formaram, mostrando a matriz de gel de grânulos foi efectivamente solubilizados. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig1.jpg" /> Figura 1. aeróbicas lamas granulares EPS extracções. Para uma melhor visualização do impacto de cada método de extracção sobre os grânulos, os experimentos foram realizados em 25 ml de frascos de vidro. Após o procedimento de extracção, os extractos foram mantidas durante 1 hora à temperatura ambiente para permitir que a matéria suspensa para resolver. (A) extracção de centrifugação, (b) extracção de ultra-sons, (c) extracção de EDTA, (d) formamida - NaOH adicionalction, (e) Formaldeído - Extração de NaOH, (f) Alta temperatura -. Na 2 CO 3 a extração <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54534/54534fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Rendimento de EPS com respeito à fracção VS para cada método é ilustrado na Figura 2. O rendimento é apresentado em mg por g de EPS VS VS inicial do grânulo. A quantidade de formaldeído por EPS obtidos + NaOH, formamida + NaOH e Na 2 CO 3 + calor + mistura foi maior do que a de centrifugação, sonicação e extracção de EDTA. Resultados semelhantes para estas técnicas de extração também foram mostrados em estudos anteriores 11 - 13,15, indicando que as condições alcalinas melhorar EPS solubilidade 26,27. A quantidade de EPS recuperado por Na 2 CO 3<html> era a mais elevada, mais do que 20 vezes da obtida apenas por centrifugação. Além disso, o rendimento total do EPS Na 2 CO 3 a extracção pode ser melhorada por múltiplas extracções. Uma segunda extracção usando o sedimento descartado no passo 1.6.8 (secção protocolo) da primeira extracção aumentou o rendimento total de 28%, a extracção de um quádruplo mesmo aumentado o rendimento total de 46%. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig2.jpg" /> Figura 2. Os resultados de todos os métodos de extração com relação ao rendimento VS e teor de cinzas. Para cada extracção, a primeira barra representa o rendimento VS em mg VS EPS por g inicial VS grânulo. A segunda barra representa o percentual de peso de cinzas nas TS extraídos. As barras de erro mostram o desvio padrão de três extracções realizadas para cada técnica de extracção.&quot;_blank&quot;&gt; Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Alginato-como polímero extracelular (ALE) extracção Depois de o pH do EPS extraídos pela extracção de Na 2 CO 3 foi ajustado para 2,2, 63% do VS total foi precipitado. O precipitado é ALE 25 ácida. A fracção residual foi provavelmente EPS que pode ser solubilizado sob condições de extracção, mas não pode formar-se um precipitado a um pH de 2,2. Teste de formação hidrogel Ionic grânulos aeróbicas têm sido descritos como sendo semelhante a um hidrogel. O processo de granulação foi considerada como um fenómeno de formação de gel com glicósidos como o agente de gelificação 4,9,25,28. Normalmente, Ca2 + é um dos catiões mais comuns nas águas residuais. Além disso, ela facilmente se liga com polissacáridos acídicos (por exemplo,alginatos e ácido poli-galacturónico), presumivelmente como um contra-ião para mediar a gelificação 29. Assim, resultando em um hidrogel ionicamente reticulado. Observou-se que a adição de iões de Ca2 + pode acelerar lodo aeróbico granulação 30. Portanto, Ca2 + do EPS (hidrogel iônica) poderia desempenhar um papel importante na construção da estrutura de matriz de gel no lodo granular aeróbico. A este respeito, se os EPS extraídos forma um hidrogel iónica com iões Ca2 + poderia ser utilizada como um teste para verificar se o EPS extraída é um polímero estrutural contribuindo para a formação da matriz de gel em forma granular lamas 9 aeróbia. Nesta pesquisa, para os EPS extraídos de AGS (Figura 3a) por vários métodos, apenas os EPS extraídos por Na 2 CO 3 realizada a forma de uma gotícula em 2,5% (w / v) de solução de CaCl 2 e formada pérolas de hidrogel iónicos estáveis .Além disso, a ALE de sódio obtido a partir deste EPS por etapas adicionais (extração de polímero ALE, Figura 3B) exibiu a mesma propriedade também. A cor e a morfologia das contas de gel de Ca 2+ -ALE (Figura 3C) são semelhantes aos das lamas granulares aeróbia (Figura 3a). Aparentemente, o EPS extraídos pelo método de Na 2 CO 3 contribui para a formação da matriz de gel em lamas granulares aeróbia. ALE, que é um componente principal do presente EPS são polímeros estruturais, capazes de formar um hidrogel iónico. Teste de estabilidade do hidrogel iónico Foi observado que durante a extracção EPS, grânulos aeróbias mantido a sua forma esférica em EDTA, formaldeído + NaOH e formamida + NaOH (Figura 1). A fim de entender se os polímeros extraídos estruturais desempenham um papel na estabilidade dos grânulos, os grânulos de Ca 2+ foram -ALEtratada exactamente da mesma maneira como grânulos aeróbias durante a extracção. Curiosamente, Ca2 + apresentada grânulos -ALE as estabilidades semelhantes como a de AGS (Figura 3D - 3-F), isto é, Ca 2+ -ALE esferas foram extremamente estáveis em EDTA. Havia pouca quantidade de ALE isolada a partir da superfície de grânulos de Ca 2+ (-ALE pequena flocos acastanhados na Figura 3e e 3f), quando os grânulos de Ca 2+ -ALE tinha sido embebido em formaldeído + NaOH e formamida + NaOH durante três horas , respectivamente. Esta semelhança em termos de estabilidade entre o Ca 2+ -ALE grânulos e grânulos aeróbicas indica que uma ALE são parte dos polímeros estruturais importantes que formam a matriz de gel de AGS. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54534/54534fig3.jpg" /> Figura 3. grânulos aeróbicos e ALE extraído. (A) grânulos no pr água desmineralizadaextração ior. (B) Ácido ALE (extraída de acordo com os parágrafos 1.6 e 2) após centrifugação a 4000 x g e 4 ° C durante 20 min. Os resultados do teste de estabilidade do hidrogel iónico. (C) de Ca 2+ -ALE-grânulos armazenadas em água desmineralizada durante 4 horas a 4 ° C. (D) de Ca2 + -ALE-grânulos armazenados em 2% de EDTA, durante 3 horas a 4 ° C. (E) de Ca 2+ -ALE-grânulos armazenados em formamida + NaOH durante 4 horas a 4 ° C. (F) Ca 2+ -ALE-grânulos armazenados em formol + NaOH durante 4 horas a 4 ° C. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54534/54534fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Extraction of Structural Extracellular Polymeric Substances from Aerobic Granular Sludge

O protocolo prevê uma metodologia para solubilizar lodo granular aeróbica, a fim de extrair polímeros extracelulares de alginato-like (ALE).

Extracção de substâncias estrutural extracelular poliméricos de Aerobic Granular Sludge

To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Environment

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Methods for Facilitating Microbial Growth on Pulp Mill Waste Streams and Characterization of the Biodegradation Potential of Cultured Microbes

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high quality paper. Black liquor is a pulping waste generated by the kraft process that has potential for downstream bioconversion. However, the recalcitrant nature of the lignocellulose resources, its chemical derivatives that constitute the majority of available organic carbon within black liquor, and its basic pH present challenges to microbial biodegradation of this waste material. Methods for the collection and modification of black liquor for microbial growth are aimed at utilization of this pulp waste to convert the lignin, organic acids, and polysaccharide degradation byproducts into valuable chemicals. The lignocellulose extraction techniques presented provide a reproducible method for preparation of lignocellulose growth substrates for understanding metabolic capacities of cultured microorganisms. Use of gas chromatography-mass spectrometry enables the identification and quantification of the fermentation products resulting from the growth of microorganisms on pulping waste. These methods when used together can facilitate the determination of the metabolic activity of microorganisms with potential to produce fermentation products that would provide greater value to the pulping system and reduce effluent waste, thereby increasing potential paper milling profits and offering additional uses for black liquor.

Industrial wastes can be collected and modified to analyze microbial growth. Lignocellulose extraction techniques provide components to analyze specific biodegradation ability. Gas chromatography-mass spectrometry identifies fermentation products of microorganisms grown on pulping waste. These methods determine the metabolic capacity of microorganisms to degrade pulping waste.

The kraft process is applied to wood chips for separation of lignin from the polysaccharides within lignocellulose for pulp that will produce a high ...

Ambiente

Development of Sulfidogenic Sludge from Marine Sediments and Trichloroethylene Reduction in an Upflow Anaerobic Sludge Blanket Reactor

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate reduction is used in industrial wastewater treatment to remove large concentrations of sulfate along with the chemical oxygen demand (COD) and heavy metals. The most common approach to the process is with anaerobic bioreactors in which sulfidogenic sludge is obtained through adaptation of predominantly methanogenic granular sludge to sulfidogenesis. This process may take a long time and does not always eliminate the competition for substrate due to the presence of methanogens in the sludge. In this work, we propose a novel approach to obtain sulfidogenic sludge in which hydrothermal vents sediments are the original source of microorganisms. The microbial community developed in the presence of sulfate and volatile fatty acids is wide enough to sustain sulfate reduction over a long period of time without exhibiting inhibition due to sulfide. 
This protocol describes the procedure to generate the sludge from the sediments in an upflow anaerobic sludge blanket (UASB) type of reactor. Furthermore, the protocol presents the procedure to demonstrate the capability of the sludge to remove by reductive dechlorination a model of a highly toxic organic pollutant such as trichloroethylene (TCE). The protocol is divided in three stages: (1) the formation of the sludge and the determination of its sulfate reducing activity in the UASB, (2) the experiment to remove the TCE by the sludge, and (3) the identification of microorganisms in the sludge after the TCE reduction. Although in this case the sediments were taken from a site located in Mexico, the generation of a sulfidogenic sludge by using this procedure may work if a different source of sediments is taken since marine sediments are a natural pool of microorganisms that may be enriched in sulfate reducing bacteria.

Microbial sulfate reduction is a process of great importance in environmental biotechnology. The success of the sulfidogenic reactors depends among other factors on the microbial composition of the sludge. Here, we present a protocol to develop sulfidogenic sludge from hydrothermal vents sediments in a UASB reactor for reductive dechlorination purposes.

Desenvolvimento de sulfidogenico Sludge de sedimentos marinhos e Redução Trichloroethylene em um Reator Anaeróbio de Manta de Lodo

The importance of microbial sulfate reduction relies on the various applications that it offers in environmental biotechnology. Engineered sulfate ...

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These biomolecules arrange in paracrystalline two-dimensional arrays on surfaces, bind metals, and are thus interesting for several biotechnical applications, such as biosorptive materials for the removal or recovery of different elements from the environment and industrial processes. The deposition of Au(0) nanoparticles on S-layers, either by S-layer directed synthesis 1 or adsorption of nanoparticles, opens new possibilities for diverse sensory applications. Although numerous studies have described the biosorptive properties of S-layers 2-5, a deeper understanding of protein-protein and protein-metal interaction still remains challenging. In the following study, inductively coupled mass spectrometry (ICP-MS) was used for the detection of metal sorption by suspended S-layers. This was correlated to measurements of quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D), which allows the online detection of proteinaceous monolayer formation and metal deposition, and thus, a more detailed understanding on metal binding.
The ICP-MS results indicated that the binding of Au(III) to the suspended S-layer polymers is pH dependent. The maximum binding of Au(III) was obtained at pH 4.0. The QCM-D investigations enabled the detection of Au(III) sorption as well as the deposition of Au(0)-NPs in real-time during the in situ experiments. Further, this method allowed studying the influence of metal binding on the protein lattice stability of Slp1. Structural properties and protein layer stability could be visualized directly after QCM-D experiment using atomic force microscopy (AFM). In conclusion, the combination of these different methods provides a deeper understanding of metal binding by bacterial S-layer proteins in suspension or as monolayers on either bacterial cells or recrystallized surfaces.

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

To obtain basic information on the sorption and recycling of gold from aqueous systems the interaction of Au(III) and Au(0) nanoparticles on S-layer proteins were investigated. The sorption of protein polymers was investigated by ICP-MS and that of proteinaceous monolayers by QCM-D. Subsequent AFM enables the imaging of the nanostructures.

Au-Interação de Slp1 Polímeros e monocamada de<em&gt; Lysinibacillus sphaericus</em&gt; JG-B53 - QCM-D, o ICP-MS e AFM como Ferramentas para Estudos biomolécula metal-

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

Química

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The identification and characterization of these biomolecules can improve knowledge about their secretion pathways and help to manipulate them. Furthermore, some of these biomolecules are also interesting in terms of biotechnological applications. Described here are two protocols for easy and rapid isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins. The method for isolation of released carbohydrate polymers is based on conventional precipitation techniques of polysaccharides in aqueous solutions using organic solvents. This method preserves the characteristics of the polymer and simultaneously avoids the presence of contaminants from cell debris and culture medium. At the end of the process, the lyophilized polymer is ready to be used or characterized or can be subjected to further rounds of purification, depending on the final intended use. Regarding the isolation of the cyanobacterial exoproteome, the technique is based on the concentration of the cell-free medium after removal of the major contaminants by centrifugation and filtration. This strategy allows for reliable isolation of proteins that reach the extracellular milieu via membrane transporters or outer membrane vesicles. These proteins can be subsequently identified using standard mass spectrometry techniques. The protocols presented here can be applied not only to a wide range of cyanobacteria, but also to other bacterial strains. Furthermore, these procedures can be easily tailored according to the final use of the products, purity degree required, and bacterial strain.

Here, protocols for the isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and isolation of their exoproteomes are described. Both procedures embody key steps to obtain polymers or proteins with high purity degrees that can be used for further analysis or applications. They can also be easily adapted according to specific user needs.

Olhando para fora: isolamento de cianobactérias liberado polímeros de carboidratos e proteínas

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Bioquímica

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Otimizando Penhora de mesenquimais humanas Células-Tronco em Poly (ε-caprolactona) electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Bioengenharia

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

Um biorreator Novel de Cultivo de Alta Densidade de diversas comunidades microbianas

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

<meta charset="utf8"></head><body>Modelagem de nichos metanotróficos - o ecossistema de modelos de seringas gradientes

Agarose-Based Model Ecosystem for Cultivating Methanotrophs in a Methane-Oxygen Counter Gradient

Aerobic methane-oxidizing bacteria, known as methanotrophs, serve important roles in biogeochemical cycling. Methanotrophs occupy a specific environmental niche within methane-oxygen counter gradients found in soils and sediments, which influences their behavior on an individual and community level. However, conventional methods to study the physiology of these greenhouse gas-mitigating microorganisms often use homogeneous planktonic cultures, which do not accurately represent the spatial and chemical gradients found in the environment. This hinders scientists' understanding of how these bacteria behave in situ. Here, a simple, inexpensive model ecosystem called the gradient syringe is described, which uses semi-solid agarose to recreate the steep methane-oxygen counter gradients characteristic of methanotrophs' natural habitats. The gradient syringe allows for the cultivation of methanotrophic strains and the enrichment of mixed methane-oxidizing consortia from environmental samples, revealing phenotypes only visible in this spatially resolved context. This protocol also reports various biochemical assays that have been modified to be compatible with the semi-solid agarose matrix, which may be valuable to researchers culturing microorganisms within other agarose-based systems.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor em destaque: projetando técnicas simples e baratas para cultivar bactérias oxidantes de metano em laboratório

A protocol is described for preparing a simple model ecosystem that recreates the methane-oxygen counter gradient found in the natural habitat of aerobic methane-oxidizing bacteria, enabling the study of their physiology in a spatially resolved context. Modifications to common biochemical assays for use with the agarose-based model ecosystem are also described.

Ecossistema modelo baseado em agarose para cultivo de metanotróficos em um gradiente de contador de metano-oxigênio

Aerobic methane-oxidizing bacteria, known as methanotrophs, serve important roles in biogeochemical cycling. Methanotrophs occupy a specific environmental ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Extracção de substâncias estrutural extracelular poliméricos de Aerobic Granular Sludge

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Otimizando Penhora de mesenquimais humanas Células-Tronco em Poly (ε-caprolactona) electrospun Yarns

Um biorreator Novel de Cultivo de Alta Densidade de diversas comunidades microbianas

Ecossistema modelo baseado em agarose para cultivo de metanotróficos em um gradiente de contador de metano-oxigênio

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Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares