The authors would like to thank all the members of the "Insect Genetics and Genomics" Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1. Experimental Set-up <ol><li> requisitos insetário <ol><li> Manter todos C. vida capitata encena a 25 ° C, 65% de humidade e 12/12 horas de luz / fotoperíodo escuro. </li><li> Coloque cerca de 1.500-2.000 pupas de mosca do mediterrâneo em um 6 L gaiola. Use uma gaiola com um latão malha em um lado com furos pequenos o suficiente para estimular a oviposição 42. Insira uma tira de esponja através de uma pequena abertura na base da gaiola para fornecer moscas com água por meio de ação capilar. Usar uma mistura de açúcar de levedura e (1:10) como fonte de alimento para os adultos (Figura 1A). Aumentar a quantidade de levedura (até 1: 3, fermento: açúcar) devem as fêmeas não conseguem pôr ovos. </li><li> Colocar uma placa cheia de água abaixo da gaiola para recolher os ovos depositados através da malha. Como as fêmeas virgens podem ovipositam, aguarde até que as moscas são pelo menos 6-7 dias antes de coletar os ovos para os experimentos de microinjeção. Isto irá garantir que as fêmeas foram acasaladose que os ovos foram fertilizados. </li><li> Recolher os ovos filtrando a água com um filtro net bem. Transferir os ovos a partir do filtro de uma caixa de plástico contendo alimento larval padrão (1,5 LH 2 O, 100 mL de HCl a 1%, 5 g de largo espectro antimicrobiano dissolvido em 50 ml de etanol, 400 g de açúcar, 175 g de levedura de cerveja desmineralizada, 1 kg de farelo de trigo mole) usando uma pipeta de Pasteur. </li><li> Colocar cada caixa num contentor transparente, fechado com uma tampa de líquido para permitir a circulação do ar e contendo uma camada de farelo de favorecer a formação da pupa (Figura 1B). </li><li> Após cerca de 10 dias, para verificar 3º instar larvas que emergem do alimento larval e saltar para dentro da camada de farelo de pupation. </li><li> 24 horas depois, recolher as pupas em um pequeno copo usando uma escova macia e transferi-los para uma nova gaiola adulto. Adultos normalmente emergem 10 dias após pupation. A mosca emergente utiliza o ptilinum, uma bolsa inflável localizado em sua cabeça acima the base das antenas, para forçar para fora da extremidade do pupário. Após a emergência, o ptilinum cai permanentemente para dentro da cabeça. </li></ol></li><li> Preparação de 1 L alimento para larvas microinjectados <ol><li> Dissolve-se 2,5 g de ágar em 300 ml de H 2 O. </li><li> Aquecer 500 ml de H 2 O em uma placa de agitação quente e dissolvem-se 4 g de benzoato de sódio, 4,5 ml de HCl a 37%, 42 g de extracto de levedura e 115 g de cenoura desidratada em pó. </li><li> Adicionar à mistura uma solução de 2,86 g de agente antimicrobiano de largo espectro dissolvido em 10 ml de etanol absoluto. </li><li> Distribuir o meio em 15 cm rodada placas de Petri e deixe esfriar. Se necessário, armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> preparação da lâmina <ol><li> Coloque um 2 centímetros tira de fita dupla face em uma lâmina de microscópio (75 x 26 mm2) e marcar as bordas com um marcador de porcelana, para impedir a propagação do petróleo e consequente desidratação dos embriões injetados. </li></ol></li><li><stRong&gt; Preparação de Ácido Nucleico <ol><li> Isolamento de DNA usando kits disponíveis comercialmente 34. Precipitar o plasmídeo usando etanol e re-suspensão em tampão de injecção (0,1 mM de tampão fosfato de pH 7,4, 5 mM de KCl) na concentração desejada. </li><li> Purificar in vitro sintetizado longo dsRNA utilizando fenol-clorofórmio, precipitar utilizando isopropanol e re-suspensão em tampão de injecção 43. </li></ol></li></ol> 2. Embrião Preparação <ol><li> Coloque uma bandeja cheia de água sob uma gaiola contendo 6-7 dia adultos de idade. </li><li> Permitir que as fêmeas para oviposição por 30 min e depois recolher os embriões filtrando a água através de um filtro fino. Sempre mantenha o filtro em água para evitar a dessecação dos embriões. </li><li> Dechorionate os embriões por imergindo o filtro durante 5 segundos numa solução de lixívia comercial a 50%. </li><li> Lavar os embriões cuidadosamente por imergindo repetidamente o filtro em água ultrapura limpa (pelo menos4-5 vezes). Por último, coloque o filtro em água ultrapura limpo. Use os embriões dentro de no máximo 2 horas. NOTA: O tempo de microinjeção está relacionada com a necessidade de injetar embriões pré-blastoderme, durante uma fase de divisões nucleares antes celularização. Isto permite que o ADN injectado a tomar-se nos núcleos, especificamente para os núcleos de células germinativas primordiais que originaram os gâmetas. Em Drosophila, as células celularização no pólo começa a cerca de 90 minutos após a fertilização (a 25 ° C), com a formação de blastoderme ocorrendo cerca de 30 minutos mais tarde, 44, ao passo que no celularização medfly ocorre entre 9 e 12 horas 45,46. </li><li> Orientação embrião em linhas <ol><li> Usando um pincel fino, recolher cerca de 50 embriões e colocá-los em um disco de papel de filtro preto encharcado com água. </li><li> Sob um microscópio estereoscópico de dissecação, organizar os embriões em uma fileira na superfície superior da fita dupla face ema lâmina de microscópio utilizando um pincel fino (000) (Figura 1C). NOTA: Alinhar os embriões todos com a mesma orientação, como a injecção é executada no polo posterior, onde de linha germinal originam; pólo posterior é oposta à região da micrópila. </li><li> Cobrir os embriões com uma camada de óleo clorotrifluoroetileno certificando-se de que o óleo não se derrame sobre a China fronteiras marcador (ver 1.3). NOTA: Antes de cobrir os embriões com óleo, um passo adicional pode ser realizada: os embriões podem ser dessecada durante alguns minutos para reduzir o seu teor de líquido e, assim, facilitar a entrada da solução de ADN injectado. Isto pode ajudar a evitar a rotura do embrião durante a injecção ou vazamento excessivo da solução injetadas, como uma consequência da pressão líquida de alta resolução. </li></ol></li></ol> Microinjeção 3. Embryo <ol><li> Encha uma agulha (1-2 ul) com ADN de plasmídeo ou solução ARNcd (1-2 mg / mL) utilizando uma micropipeta. </li><li&gt; conectar a agulha ao aparato de microinjecção, que controla o tempo de injecção (0,5 seg), a pressão (800 hPa) e a contrapressão (150 hPa). </li><li> Realizar microinjecção sob um microscópio estereoscópico, utilizando um micromanipulador para controlar os movimentos da agulha (Figura 1D). Utilizar a platina do microscópio para mover a corrediça. <ol><li> Coloque o slide no palco do escopo. </li><li> Inserir a ponta da agulha no pólo posterior do embrião (Figura 1E). </li><li> Injectar a solução ativando o sistema de microinjeção com o pedal. O líquido injectado induz um aumento da pressão interna, resultando em um ligeiro movimento do embrião. </li><li> Solte o pedal e imediatamente, mas com cuidado, retire a agulha do embrião. </li><li> Observar um pouco de fuga citoplasmática no local da injecção. NOTA: Para discriminar entre potenciais efeitos letais de DNA / dsRNA / siRNA e mortalidade devido à pro microinjeçãoprocedimento em si, experiências de controlo devem ser executadas. Estes compreendem a injecção de apenas tampão, ou, no caso das experiências de genética inversa, de uma proteína fluorescente verde (GFP) -derived ARN de cadeia dupla (ARNcd-GFP), ou ARNsi. </li></ol></li><li> Após a injecção incubar os embriões a 25 ° C. </li></ol> 4. Procedimentos de Pós-injeção <ol><li> Dois dias após a injecção, verifique as lâminas para larvas eclodidas (Figura 1F) sob um microscópio estereoscópico. As larvas podem mover-se no óleo, mas precisa de ser transferido para alimentar larvas o mais rapidamente possível. Por esta razão, verifique as lâminas várias vezes ao dia. </li><li> Usando um pincel fino (000), gentilmente transferir as larvas eclodiram ao alimento larval à base de cenoura. Transfira até um máximo de 200 larvas por cada placa de Petri. </li><li> Incubar as larvas a 65% de humidade (25 ° C). Certifique-se de que a tampa não se ater ao prato, prejudicando a troca de ar. </li><li> Mantenha as placas de Petri com a tampaprincipalmente fechado de modo que ainda existe fluxo de ar para as larvas. Para evitar a secagem excessiva, verifique os pratos diariamente e, se necessário, adicione água para compensar a evaporação. </li><li> Coloque as placas de Petri em um recipiente clara fechada por uma tampa-net e contendo uma camada de farelo de favorecer pupation. Quanto à criação insetário rotina, 3º instar larvas salto para fora do alimento larval e pupate no farelo. </li><li> Recolher o pupas e colocá-los em uma gaiola pequena para a criação de adultos e triagem (isto é Geração 0, G0). Traseira da progênie em alimento larval padrão. </li><li> No caso de experimentos de transformação em células germinais, verificar possíveis indivíduos transformados na próxima geração (G1), como indivíduos injetados geralmente são quimeras. eventos de transposição, de facto, pode ter ocorrido em qualquer um dos núcleos do sincício embrionário, os quais irão formar, quer a da linha germinal ou a soma. <ol><li> Logo após a emergência, anestesiar indivíduos G1 usando CO 2 e verifique se transfeventos ormação sob um microscópio estereoscópico epifluorescência. Para rastrear a presença de fluorescência vermelha, use um filtro DsRedwide (Ext 546/12;.. Emm 605/75), enquanto para a tela de fluorescência verde usar o filtro EYFP (Ext 500/20;.. Emm 535/30) . </li><li> Coloque indivíduos transformadas em uma pequena gaiola com adultos de tipo selvagem do sexo oposto e originam uma nova, inicialmente heterozigotos, tensão. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Microinjecção de ácidos nucleicos em embriões de insetos é uma técnica universal que facilita tanto a análise da função dos genes e das aplicações biotecnológicas. A publicação recente de sequências do genoma de um número crescente de espécies de insectos leva a uma necessidade urgente de ferramentas para a caracterização funcional de genes de função ainda desconhecida. ARN de interferência tem provado ser um dos métodos mais valiosos para inferir funções moleculares...

A mosca da fruta Mediterrânea (medfly) Ceratitis capitata é uma espécie cosmopolita que extensivamente danos frutas e culturas cultivadas. Pertence à família Tephritidae, que inclui várias espécies de pragas, tais como aqueles que pertencem aos géneros Bactrocera e Anastrepha. A mosca do mediterrâneo é a espécie mais estudados desta família, e tornou-se um modelo não só para o estudo das invasões de insetos 1, mas também para otimizar as estratégias de gestão de pragas 2. A mosca do mediterrâneo é uma espécie multivoltina que podem atacar mais de 300 espécies de plantas selvagens e cultivadas 3,4. O dano é causado por ambos os adultos e as fases larvares: fêmeas acasaladas perfurar a superfície do fruto para oviposição, permitindo que microorganismos de afectar a sua qualidade comercial, enquanto que as larvas se alimentam sobre a polpa de fruta. Depois de três estádios larvares, larvas emergem a partir do hospedeiro e pupate no solo. Ceratitiscapitata exibe uma distribuição quase todo o mundo, incluindo a África, Médio Oriente, Austrália Ocidental, Central e América do Sul, Europa e áreas dos Estados Unidos 5. As estratégias mais comuns para limitar infestações mosca do mediterrâneo envolvem o uso de inseticidas (por exemplo, Malathion, Spinosade) e a favor do meio ambiente técnica do inseto estéril (SIT) 6. A última abordagem envolve a libertação no meio natural de centenas de milhares de homens prestados esterilizado por exposição a irradiação ionizante. O acasalamento de tais machos esterilizados para fêmeas selvagens resulta em nenhuma descendência, causando uma redução no tamanho da população, o que levou à erradicação. Embora SIT tem se mostrado eficaz em várias campanhas em todo o mundo, suas principais desvantagens incluem os altos custos de criação e de esterilização de milhões de insetos para ser liberado. Marcação de indivíduos liberados é necessário distinguir estéril de insetos selvagens capturados no campo durantemonitoramento das atividades e atualmente é conseguido usando pós fluorescentes. Estes procedimentos são caros e têm efeitos colaterais indesejáveis 7. A fim de otimizar e / ou a desenvolver abordagens mais eficazes para o controle desta praga, biologia medfly e genética têm sido amplamente explorada por inúmeros pesquisadores em todo o mundo. A disponibilidade da sequência do genoma medfly 8,9, irá facilitar novas investigações sobre as funções dos genes. RNA de interferência é uma ferramenta poderosa para tais estudos e isto pode ser conseguido através da microinjecção de ARNdc (ARN de cadeia dupla) ou siARN (pequeno ARN interferente). Esta técnica tem sido usada, por exemplo, para demonstrar que a cascata molecular determinação do sexo em C. capitata é apenas parcialmente conservada em relação ao de 10 de Drosophila. O desenvolvimento de protocolos para microinject embriões mosca do mediterrâneo permitidos C. capitata para ser o primeiro nãoespécies de moscas -Drosophilid ser geneticamente modificados. Como os ovos são semelhantes aos de Drosophila, quer em termos de morfologia e resistência à dessecação 11, o protocolo para a entrega do DNA do plasmídeo em embriões pré-blastoderme primeiro desenvolvidos para D. melanogaster 12,13 foi inicialmente adaptada para uso em C. capitata. Estas primeiras experiências permitiu transformação de linha de germe de moscas mediterrânicas com base no elemento transponível Minos 11. Subsequentemente, o sistema original foi modificado utilizando 14 outras abordagens baseada em transposões. Este é o caso de piggyBac da Lepidoptera Trichoplusia ni 15. O protocolo já foi ainda mais otimizado e isto permitiu a transformação de outras espécies de tefritídeos 16-21 e também de muitos outros Diptera 22-31. Todos estes sistemas se baseiam na utilização de um / sistema de transformação plasmídeo ajudante vector binário típico: artificial, transpo defeituosofilhos contêm genes desejados são montados em ADN de plasmídeo e integrado no genoma do insecto, fornecendo a enzima transposase 32. Um número de linhas de mosca do mediterrâneo transgênicos foram gerados, com vários recursos, incluindo estirpes que transportam um gene letal dominante condicional que induz letalidade, estirpes produtoras do sexo masculino somente descendentes e, portanto, não exigindo estratégias de sexagem adicionais e estirpes com esperma fluorescente, o que pode aumentar a precisão da fase de monitoramento SIT 33-37. Embora a libertação na natureza de organismos transgênicos ocorreu em testes-piloto contra os mosquitos única 38,39, pelo menos uma empresa está avaliando uma série de linhagens transgênicas mosca do mediterrâneo para a sua utilização no campo 40. Embrião microinjeção também pode favorecer o desenvolvimento de novas ferramentas de edição de genoma, tais como transcrição nucleases ativador-like efetoras (TALENS), agrupados regularmente intercaladas repete palindrï¿½icas curtas (CRISPR) / CRISPR proteína associada 9 nuclease (Cas9) e endonucleases homing genes (HEGs), o que permitirá novos estudos evolutivos e de desenvolvimento, bem como a expansão da caixa de ferramentas da biotecnologia disponível. De edição de genoma abordagens já permitiu a geração de sistemas gene-drive em mosquitos 41, e sua transferência para o medfly é iminente. Aqui nós descrevemos um protocolo universal para microinjecting ácidos nucleicos em embriões mosca do mediterrâneo que podem ser úteis para todas as aplicações acima mencionadas.

<table><tbody><tr><td>1 x injection Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5&amp;nbsp;mM KCl</td></tr><tr><td>Construct Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helper Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td>Phenol-Chloroform purified</td></tr><tr><td>Standard Larval food</td><td></td><td></td><td>1.5 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50&amp;nbsp;ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer&#039;s yeast, 1 kg soft wheat bran</td></tr><tr><td>Carrot Larval Food</td><td></td><td></td><td>2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86&amp;nbsp;g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L</td></tr><tr><td>Adult Food</td><td></td><td></td><td>yeast extract and sugar (1:10)</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z692247</td><td></td></tr><tr><td>Injection needles&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956000</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Double slided tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Black circle paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695505</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td>Diluite 1:2 before use</td></tr><tr><td>Paintbrush (000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Femtojet</td></tr><tr><td>Adult cages</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorotrifluoroethylene oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ceratitis capitata&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The strain used is ISPRA</td></tr></tbody></table>

delivery of nucleic acids through embryo microinjection in the worldwide agricultural pest insect, ceratitis capitata

A mosca mediterrânica da fruta (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) é uma espécie de pragas com altíssima relevância agrícola. Isto é devido ao seu comportamento reprodutivo: as fêmeas danificar a superfície externa de frutas e vegetais quando eles põem ovos e as larvas se alimentam chocado em sua polpa. Selvagem C. populações capitata são tradicionalmente controlada através de inseticidas e / ou abordagens eco-friendly, sendo o mais bem sucedido da Técnica do Inseto Estéril (SIT). O SIT baseia-se em massa criação, esterilização à base de radiação e liberação de campo dos homens que mantêm sua capacidade para acasalar, mas não são capazes de gerar descendência fértil. O advento ea subsequente rápido desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas, juntamente com a disponibilidade da sequência do genoma de mosca do mediterrâneo, impulsionou significativamente a nossa compreensão da biologia desta espécie. Isto favoreceu a proliferação de novas estratégias para a manipulação do genoma, que can ser utilizada para o controle da população. Neste contexto, embrião microinjeção desempenha um duplo papel na expansão da caixa de ferramentas para o controle da mosca do mediterrâneo. A capacidade para interferir com a função dos genes que regulam processos biológicos fundamentais, de facto, se expande a nossa compreensão do mecanismo molecular subjacente a invasividade moscas mediterrânicas. Além disso, a capacidade de conseguir a transformação da linha germinal facilita a produção de múltiplas estirpes transgénicas que podem ser testados para futuras aplicações de campo em novas configurações de SIT. Com efeito, a manipulação genética podem ser usadas para conferir características desejáveis ​​que podem, por exemplo, ser utilizados para monitorizar o desempenho masculino estéril no campo, ou que podem resultar em letalidade fase precoce da vida. Aqui nós descrevemos um método para microinject ácidos nucleicos em embriões de mosca do mediterrâneo para atingir estes dois objetivos principais.

Aqui relatamos duas aplicações de microinjecção de embriões dirigido para a caracterização funcional de um gene de interesse (caso 1), e na geração de estirpes transgénicas (Processo 2), respectivamente. Entrega de dsRNA em embriões para desvendar a função do gene. O gene innexin-5 codifica uma lacuna-junção que, em insectos, é expresso espe...

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

8.9K visualizações.  University of Pavia. The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Citoplasmática microinjeção no gado zigotos assistida laser

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Genética

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Microinjeção de embriões e Eletroporação na cordados<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Biologia do Desenvolvimento

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

Interferência de RNA em besouros aquáticos como uma poderosa ferramenta para manipular a expressão genética em pontos de tempo específicos de desenvolvimento

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Ambiente

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

Injetando ovos de Gryllus bimaculatus

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi Mediated Gene Knockdown e Transgénese por microinjeção no Nematóides Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Biologia

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Microinjeção de cigarrinha de milho, Peregrinus maidis, Embriões para edição do genoma CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Bioengenharia

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Um Método para microinjeção de<em&gt; Patiria minata</em&gt; zigotos

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Injeções de pupal e adultos para edição de genes RNAi e CRISPR em Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,

Resumo

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