Name: assaying predatory feeding behaviors in pristionchus and other nematodes
Uploaded: 2016-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes at JoVE.com

We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.

1. Boca forma fenotipagem <ol><li> Boca Formulário de Identificação em agarose Pads Nota: Para visualizar os morphs boca de nematóides, imobilizar os vermes com um tratamento anestésico suave em almofadas de agarose e observar como se segue. <ol><li> Crescer e manter culturas de nematóides, tais como P. pacificus em 6 cm de mídia crescimento de nemátodos padrão (NGM) placas e alimentos em um gramado de bactérias E. coli OP50 19. </li><li> Adicione almofadas de agarose adicionando primeiro 0,06 g de agarose em 3 ml de H 2 O em um tubo de 15 ml para fazer uma solução de agarose a 3 ml de 2%. Este pode ser armazenado durante até um ano a 4 ° C. </li><li> Misture e derreter a agarose cuidadosamente em um forno de microondas ou, alternativamente, use um bloco de calor colocado em&gt; 88 ° C. </li><li> Uma vez completamente derretido, adicionar 10 ul de uma solução de azida de sódio a 10% para a agarose e homogeneiza-se. CUIDADO: azida de sódio seco é reactivo e todas as formas são tóxicos. </li><li> Utilizando uma mistura 1 mlmicropipeta, colocar uma gota de não menos do que 300 ul de azida de agarose a mistura líquida para o meio de uma lâmina de microscópio de vidro padrão. </li><li> Antes de o agar arrefece, colocar rapidamente uma segunda lâmina de microscópio sobre o topo da gota de modo a achatar a agarose, que forma uma almofada após arrefecimento. Repita o procedimento para o maior número de almofadas como é exigido. </li><li> Imediatamente antes da utilização, casca Além as lâminas de microscópio de vidro deslizando-os um do outro. Nota: Se as almofadas de agarose são preparados com muita antecedência eles podem ser excessivamente seco e pode danificar os nematóides. </li><li> Para transferir vermes para as almofadas de agarose anestésicos, colocar uma gota de tampão M9 (2-3 ul) para o centro da almofada. Escolha 2-3 jovem P. adultos pacificus para a gota de M9, antes de colocar uma lamela com cuidado sobre a almofada. O P. nemátodos pacificus será imobilizado em agarose e pronto para visualizar. </li><li> Transferir a lâmina de microscópio contendo o worm anestesiado para um microscópio de uma adequadand observar sob 63X Nomarski óptica. Categorizar identidades morfo com base nas seguintes características: a presença de uma sub-ventral dente adicional, dente dorsal alargada e abertura de boca larga é indicativo de um animal Morph boca eurystomatous, enquanto que a presença de um único dente dorsal e abertura de boca estreita indica um stenostomatous animais (Figura 1). Nota: A fim de manter a saúde do animal, vermes deve ser mantida na almofada de ágar de não mais do que 5 minutos. </li><li> Depois boca identificação de metamorfose, recuperar nematóides quer eurystomatous ou stenostomatous conforme exigido pela remoção da tampa de deslizamento, deslizando-o do bloco de agarose. Cuidadosamente pegar os animais selecionados a partir do bloco de agarose (E. coli OP50 pode ser usado na seleção para ajudar a tornar mais rígidas) em placas NGM frescos. Permitir a recuperação da anestesia até o comportamento motile normal foi retomado em que os animais estão prontos para mais ensaios predatórias. </li></ol></li> &lt;li&gt; rápida Boca fenotipagem Nota: Como alternativa, com mais experiência, boca tipo de formulário pode ser analisada sem a necessidade de qualquer tratamento anestésico através de um microscópio estereoscópico com ampliação elevada (150X). <ol><li> Nematóides colocam placas NGM padrão com um gramado bacteriana de E. coli OP50 na área de visualização do microscópio. </li><li> Detectar diferenças no tamanho da boca e largura. Nota: Neste ampliação sem o dente como estruturas são observáveis, portanto, a identificação de metamorfose boca está baseada exclusivamente no largas bocas contra bocas estreitas. </li></ol></li></ol> Ensaio 2. mordida Nota: Os ensaios Morder permitir uma análise comportamental predatória detalhado. <ol><li> Crescer e manter culturas de nematóides em placas NGM padrão (6 cm) e se alimentam de um gramado de bactérias E. coli OP50 19. </li><li> Fazer placas de ensaio por crescimento de uma grande quantidade de larvas de nemátodos presa seleccionado, tal como C. elegans ou alternatively uma presa ecologicamente relevantes apropriado. Nota: Adulto C. elegans são demasiado grandes para ser presa adequada de modo que é importante usar a fase larvar. <ol><li> Manter C. elegans ou outras espécies de presas potenciais em placas NGM padrão e alimentos em um gramado de bactérias E. coli OP50 até que a população é preparado na fome, resultante em uma abundância de larvas L1 jovem. Nota: Tempo de inanição é dependente de numerosos factores ambientais e experimentais, incluindo o número de nemátodos utilizados para iniciar a cultura, a quantidade de E. coli OP50 adicionado, e a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavar quatro ou mais placas presas recém-esfomeados com M9 e passar a solução verme através de dois filtros de 20 fim de remover todos os animais de grande porte e todos os ovos restantes antes da coleta em um tubo de 15 ml. Apenas um pequeno larvas devem permanecer na solução. </li><li> Para formar um sedimento das larvas centrifugar a presa filtrado a 377 xg durante 1 min. </li><li&gt; Pipeta 3 ul de pellet verme pura em uma placa NGM seis centímetros sem E. coli OP50 presente e esperar pelo menos 30 minutos para as larvas para se espalhar o suficiente para gerar uma placa de ensaio. Nota: 3 ul de pellet verme pura nas placas de ensaio padrão contêm&gt; 3.000 larvas presa. Isto é suficiente para gerar contactos frequentes entre predadores e presas. </li><li> Tela nematóides predadores para a metamorfose boca exigida (protocolo 1). </li><li> Usando vermes escolhendo técnicas padrão e um microscópio estereoscópico luz 19, transferir predadores corretamente classificados para a placa de ensaio. Tome cuidado para transferir como pequenas bactérias OP50 quanto possível para a placa de ensaio quando a transferência de predadores, a fim de minimizar a contaminação bacteriana. Aguarde 15 minutos para permitir que o worm para se recuperar do estresse de ser transferida e verificar o comportamento móveis do tipo selvagem para garantir vermes não foram danificados a partir da transferência. Nota: Não há necessidade de passar fome P. pacificus, como eles são predadores altamente eficientes de outras larvas de nematóides, mesmo quando bem alimentadas mediante bactérias. </li><li> Após a recuperação, observar o predador usando um microscópio estereoscópico luz por 10 min. Com este equipamento, observar e caracterizar eventos de alimentação distintas, como morder, caracterizado pelo predador restringir o movimento da presa, matando, onde por uma abertura da cutícula presa é detectado; e alimentação, categorizados por um consumo observável das vísceras de presas (Figura 2A, B e Filme 1). </li><li> Repetir o ensaio de rastreio e pela observação de um mínimo de 10 nemátodos predadores individuais para assegurar a precisão. </li></ol> Ensaio 3. Corpse Nota: Os ensaios Corpse facilitar uma quantificação mais rápida do comportamento predatório. <ol><li> Crescer e manter culturas de nematóides em placas NGM padrão e alimentam-se de um l bacterianaawn de E. coli OP50 19. Gerar triplicados das placas de ensaio mencionados anteriormente (protocolo 2,1-2,5). </li><li> Tela nematóides predadores para a metamorfose boca exigida como descrito no protocolo 1. Usando vermes escolhendo técnicas padrão e uma transferência de luz microscópio estereoscópico 5 nematóides predadores com a metamorfose boca necessário para cada placa de ensaio. Deixar os predadores em conjunto com a presa durante 2 h. </li><li> Após 2 h tela da placa de ensaio para a presença de corpos esvaziados (Figura 2B e C). Identificar cadáveres pela ausência de motilidade, juntamente com defeitos morfológicos óbvios, incluindo vazamento vísceras ou faltando fragmentos vermes. </li></ol> 4. Análise da faringe e movimentação dentária <ol><li> Crescer e manter culturas de nematóides em placas NGM padrão e alimentam-se de um gramado de bactérias E. coli OP50 19. Gerar placas de ensaio tal como mencionado anteriormente (protocolo de 2,1-2,5). Se padrão 6 cmplacas NGM não se encaixam entre o objetivo eo estágio do microscópio, utilize a tampa de pratos pequenos de 35 mm de petri contendo 2 ml NGM como uma alternativa adequada. </li><li> Tela nematóides predadores para a metamorfose boca requeridos descritos no protocolo 1. Usando verme padrão escolhendo técnicas e uma lupa luz, transferir um único predador corretamente classificados para a placa de ensaio. Aguarde 15 minutos para permitir que o worm para se recuperar do estresse de ser transferido. </li><li> Observar animais predadores em um microscópio a 40 - 63X Normaski, com uma câmera de alta velocidade (Filmes 2 e 3). Registro da faringe bombeamento e movimento dentário mais de 15 segundos, a 50 Hz em pelo menos 20 animais para garantir a quantificação precisa. Repetição de filmes gravados na velocidade desejada, a fim de contar com bombas individuais e eventos dente. Nota: O bombeamento é observado no corpus, localizado no meio da faringe, enquanto que o movimento do dente é detectável na abertura da boca e só é observido a partir do dente dorsal. </li></ol>

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The authors declare no financial or competing interests.

Nematóides fornecer um sistema poderoso para a compreensão da neurobiologia e comportamento com C. elegans, até agora, sendo a principal ferramenta. No entanto, numerosas espécies de nematóides, incluindo P. exibem comportamentos pacificus, que estão ausentes ou variam em complexidade do organismo modelo C. elegans e, portanto, levantar questões fascinantes sobre a evolução e regulação desses comportamentos. Um tal comportamento adicional encontradas em muitas outras espécies de nematóides, incluindo P. pacificus é a capacidade de complementar sua dieta bacteriana por engajar na alimentação predatória 1, 20. Temos, portanto, desenvolvido e descrito um protocolo detalhado para a caracterização fácil e rápida destes comportamentos predatórios anteriormente não analisados ​​em nematóides. Em primeiro lugar, nós fornecemos métodos para triagem de variações na alimentação de aparelhos dentro da boca do nematóide. A identificação do tipo boca correta é um primeiro s essencialtep para ensaios predação bem sucedidos como, pelo menos, dentro do género Pristionchus únicos animais eurystomatous são capazes de alimentação predador. É melhor para identificar boca se transforma com o protocolo &quot;rápida fenotipagem boca&quot; descrito no protocolo 1.2 como este método é muito menos invasiva e, portanto, é menos provável que os comportamentos predatórios pode ser perturbado. No entanto, recomenda-se a primeira a se familiarizar com as diferentes estruturas da boca pela identificação com animais anestesiados em almofadas de ágar (protocolo 1.1). Após a identificação da metamorfose boca desejado, nós descrevemos dois ensaios para quantificar a alimentação predatória. Estes são, alto rendimento &quot;ensaio de cadáver&quot; rápida (protocolo 3) e um mais demorado, mas a análise comportamental mais aprofundada através do &quot;ensaio de mordida&quot; (protocolo 2). Ambos os protocolos estão altamente flexível para permitir que várias modificações, a fim de optimizar os ensaios dependendo das experimenrequisitos Tal. Para os ensaios de mordida usando P. predadores pacificus sobre C. elegans presa, observações comportamentais de interacções predadores para uma janela de tempo de 10 minutos era suficiente para quantificar uma quantidade significativa de picadas, juntamente com outros eventos de alimentação. Para os &quot;ensaios de cadáver&quot; novamente utilizando P. predadores pacificus sobre C. elegans presa, 5 predadores para 2 horas produziu números cadáver facilmente quantificáveis ​​e consistentes que permitam a análise comportamental rápida. No entanto, deve notar-se diferentes espécies de movimento de nemátodos predadores em velocidades diferentes, coma a velocidades diferentes e, em geral demonstram um grande diversidade de outros comportamentos 1. Além disso, espécies de presas diferentes também pode ser comido em taxas diferentes por razões semelhantes. Portanto, é recomendável para otimizar os ensaios com base nas espécies de nematóides testados tanto como predadores e presas, e também para quaisquer diferenças nas condições ambientais. Durante os dois &quot;mordida&quot; e &quot;corpse &quot;ensaios é fundamental que ambas presas e predadores são saudáveis, como salientou ou predadores feridos não vai matar de forma eficiente. Além disso, placas de ensaio frescos são essenciais como placas mais velhas podem se tornar seca que afeta negativamente a saúde dos nematóides levando a errônea os ensaios. espera-se também que as futuras iterações destes ensaios predadores será capaz de tirar proveito dos avanços recentes na tecnologia, a fim de automatizar grande parte da análise em que foi realizado para investigar muitos comportamentos observados em C. elegans 21, 22. Actualmente problemas podem surgir em nematóides, tais como P. pacificus como eles aparecem muito mais sensíveis ao contacto, tornando o isolamento e imobilização em câmaras microfluídicos susceptíveis de revogar a alimentação predatória. Superar isso pode ser um desafio, mas facilitaria nematóides individuais a serem selecionados para sutil predatória comportamentos. Finalmente, temos também forneceu métodos for examinar o aparelho de alimentação nematóide si facilitando comparações entre os modos de alimentação predatórias e bacterianas através da quantificação da cinética do dente e de bombeamento da faringe usando uma câmera de alta velocidade (protocolo 4). A quantificação das taxas de faringe bombeamento em C. elegans foi utilizada para monitorar a alimentação durante muitos anos 23, no entanto, C. elegans carece de qualquer forma de denticle boca e também carece de comportamentos predatórios. Através da combinação da quantificação da faringe bombeamento com que a actividade de dente, qualquer inervação dos dentes específicos para a predação pode ser também observada. Devido à ampliação necessária para observar o movimento dentário os animais movem-se frequentemente para fora do plano focal, portanto, normalmente só é possível observar o dente por janelas de tempo curtos. Além disso, ao contrário C. elegans, da faringe de P. pacificus não continuamente bombear, em vez disso, se envolve em períodos de bombeamento e alimentação. Portanto, para pum faringe precisastaxas de Ping ao alimentar a ser determinada, é importante para a ficha 15 seg de alimentação contínua. Estes métodos aqui apresentados, por conseguinte, fornecem a primeira estrutura para investigar comportamentos predadores em sistemas de nematóides. Além disso, eles também podem ser adaptável para utilização em investigação de outras interacções dentro do ecossistema nemátodo incluindo a influência dos organismos adicionalmente ecologicamente relevantes na predação incluindo microrganismos, fungos e ácaros . Assim, eles fornecem um meio para dissecar como esses comportamentos predatórios são regulados, como eles podem ter evoluído e também a sua importância ecológica.

Nematóides, com suas pequenas, mas complexos sistemas nervosos provaram ferramentas poderosas para a compreensão de muitos aspectos da neurobiologia incluindo comportamento. Grande parte desta investigação centrou-se no organismo modelo Caenorhabditis elegans em que uma riqueza de diferentes comportamentos foram dissecados e analisados ​​com sucesso. Estes incluem mecanosensorial 3, quimiotática 4, thermotactic 5,6 e magnetotáticos 7 influenciando acasalamento 8,9, aprendendo 10 e comportamentos alimentares 11. No entanto, outras espécies de nematóides mais distantemente relacionados exibem comportamentos que não são observadas na rabditídeos C. elegans ou alternativamente mostrar níveis adicionais de complexidade, o que levanta questões pertinentes sobre a sua evolução e regulação. Um tal exemplo disto pode ser observado no nematóide diplogastrid distantemente relacionado Pristionchus pacificus, que exibe muito mais complexa ser a alimentaçãohaviors e ritmos que são observadas em C. elegans 1. Isto apesar de as duas espécies compartilhando neurônios faringe homólogas 12. Coincidindo com estes comportamentos alimentares adicionais, P. pacificus também exibe uma faixa dietética expandido, como eles são predadores ávidos, capazes de complementar sua dieta bacteriana por também alimentando-se de larvas de outros nematóides. Felizmente, P. pacificus foi desenvolvido como um modelo para a biologia evolutiva comparativa e integrativa e, portanto, muitas ferramentas moleculares e genéticos estão agora disponíveis. Estes incluem um genoma totalmente sequenciado e anotado 13, ferramentas moleculares e genéticos, incluindo transgenes 14 e CRISPR / Cas9 15,16, bem como uma filogenia detalhada e bem anotado 17 com mais de 25 espécies estreitamente relacionadas, incluindo as suas espécies irmãs recém-descobertas. Além disso, a ecologia de numerosas espécies incluindo P. Pristionchus pacificus é quell definido com muitas espécies tendo já sido descrita a partilha de uma associação necromenic com escaravelhos, um host eles freqüentemente compartilhar com outras espécies de nematóides 18. P. portanto, pacificus fornece um sistema modelo excelente com o qual a dissecar a evolução de novos comportamentos e da sua importância ecológica. A fim de analisar comportamentos alimentares predadores em espécies de nematóides, tais como P. pacificus desenvolvemos vários novos ensaios comportamentais para facilitar a observação e quantificação das ações predatórias. Como P. pacificus exibe uma estrutura boca dimorphic, que influencia fortemente o comportamento predatório, identificação do morfotipo correta é essencial 1,2. A metamorfose stenostomatous boca estreita contém um único dente dorsal contundente e não se envolver em qualquer alimentação predatória. Alternativamente, a grande metamorfose eurystomatous boca inclui um muito maior em forma de garra dente dorsal e um adicional de opostosdente sub-ventral, que juntos operam para abrir de forma eficiente a cutícula das suas presas. A razão entre o eurystomatous predador à forma stenostomatous não predadores varia entre as espécies e também dentro Pristionchus P. pacificus, no entanto, a percentagem de boca eurystomatous se transformar na P. pacificus selvagem cepa (pS312) é geralmente 70 - 90% 2. Além disso, as proporções de formulário boca pode variar dependendo de diferentes influências ambientais (ambos conhecidos, incluindo a fome e uma pequena molécula de sinalização, bem como factores desconhecidos), assim identificação correcta e isolamento da forma de boca eurystomatous predador é essencial para ensaios bem sucedidos predadores. Juntamente com a descrição da forma boca predatória, temos desenvolvido um &quot;ensaio de mordida&quot; para a observação direta e quantificação de comportamentos predatórios, incluindo morder, matando e alimentando eventos. Aqui nematóides presas são isolados através do filtroção de culturas recém-esfomeados e expostas a adultos predatória P. pacificus, que são observados em conjunto ao longo de um curto espaço de tempo. Além disso, também desenvolvemos um alto rendimento &quot;ensaio de cadáver&quot; para facilitar a triagem rápida de comportamento predatório através da observação indireta de eventos predatórias. Isto tira proveito da presença de corpos de larvas como uma ferramenta para o rastreio de predação. Ambos os ensaios proporcionam métodos fáceis e altamente repetíveis para observar e medir o comportamento predatório em espécies de nematóides, tais como P. pacificus.

<table><tbody><tr><td>Nylon net filters (20 &amp;#181;m)</td><td>Merck Millipore Ltd</td><td>NY2004700</td><td>Used to filter worms just leaving larvae for use as prey.</td></tr><tr><td>PP Funnel for filter (54 mm)</td><td>Duran</td><td>292215003</td><td>Used to filter worms just leaving larvae for use as prey.</td></tr><tr><td>Small petri dish (35/10 mm)</td><td>Greiner Bio-One&amp;nbsp;</td><td>627102</td><td>For imaging on High speed camera</td></tr><tr><td>Zeiss SteREO Discovery V12</td><td></td><td></td><td>For mouth form identificaton</td></tr><tr><td>Axio-Imager A1</td><td></td><td></td><td>For mouth form identificaton</td></tr><tr><td>Glass Slides</td><td>Roth</td><td>H869</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slips</td><td>Roth</td><td>657</td><td></td></tr><tr><td>Motion Scope M3 Highspeed camera</td><td>IDT</td><td></td><td>High speed camera</td></tr><tr><td>Video zoom 44 ENG 1/2&quot; 0.5X to 2.4X</td><td>Zeis</td><td>452984-0000-000</td><td>High speed camera zoom</td></tr><tr><td>Nematode Growth Medium (NGM) ingredients:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Roth</td><td>5210.2</td><td>CAS-Nr. 9002-18-0</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Roth</td><td>3957</td><td>CAS-Nr. 7647-14-5</td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>BD</td><td>211699</td><td>Lot 4316614</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>CAS-Nr. 10035-04-8</td></tr><tr><td>Cholesterol from lanolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F 26732 00050</td><td>CAS-Nr. 57-88-5</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck</td><td>1,058,861,000</td><td>CAS-Nr. 10034-99-8</td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>ACROS organics</td><td>271080025</td><td>CAS-Nr. 7778-77-0</td></tr><tr><td>6 cm petri dish</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm petri dish</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>M9 ingredients:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>ACROS organics</td><td>271080025</td><td>CAS-Nr. 7778-77-0</td></tr><tr><td>Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390-500G-D</td><td>CAS-Nr. 7782-85-6</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Roth</td><td>3957</td><td>CAS-Nr. 7647-14-5</td></tr></tbody></table>

assaying predatory feeding behaviors in pristionchus and other nematodes

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both "corpse assays" and "bite assays" on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.

<html> Após a identificação bem-sucedida da metamorfose boca apropriada na P. pacificus, claras diferenças entre animais eurystomatous e stenostomatous pode ser detectado (Figura 3) com apenas os animais eurystomatous engajar-se em matar comportamento. Em animais stenostomatous Este comportamento parece ser suprimido por completo. Além disso, as diferenças na atividade do dente e da faringe bombeamento de animais eurystomatous sobre as bactérias e presas (Figura 4 e Filmes 2 e 3) também são evidentes. Enquanto predador alimentação, a taxa de bombagem é reduzida abaixo do observado durante a alimentação bacteriana e o movimento do dente é detectada num rácio de 12:59 com o bombeamento da faringe. Isto é potencialmente indicativa de mecanismos reguladores-chave que modulam a resposta comportamental a diferentes dieta. s / ftp_upload / 54404 / 54404fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. P. pacificus tem uma boca Dimorfismo que influencia Comportamento Alimentar. (A) A forma da boca eurystomatous é capaz de predação e tem uma abertura de boca larga com uma grande em forma de garra dente dorsal (falso-cor vermelha) e (B) um gancho adversária em forma sub-ventral dente grande (falsa cor azul). (C) a forma da boca stenostomatous só é capaz de se alimentar de bactérias e tem uma abertura de boca estreita com um em forma de sílex dente dorsal (falso-cor vermelha) e (D) no sub-ventral dente (*). Imagens Normaski são 63X e barra de escala representa 10 um. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54404/54404fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. predação Ensaios. (A) P. pacificus morde e mata as larvas de outros nematóides, tais como C. elegans. (B) Para os ensaios de morder, o número de bitesby predadores (*) pode ser observado através de um microscópio estereoscópico luz e assassinato de sucesso e alimentando eventos também gravados. Cadáveres também são claramente visíveis (círculos). (C) Para os ensaios de cadáveres, carcaças larvais (setas) pode ser facilmente identificado em comparação com larvas vivas. Barra de escala representa 1 mm de B e 150 mm em C. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54404/54404fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig3.jpg" /> Figura 3. Resultados da mordida e Corpse Ensaios em C. elegans Prey. (A) comportamento de morder só é evidente<html> na forma da boca eurystomatous com este comportamento não exibido em animais stenostomatous. Barra de erro representa o desvio padrão de 10 repetições. (B) Coincidindo com qualquer comportamento de morder evidente a partir de animais stenostomatous, ensaios de cadáver também revelam carcaças única sobre placas de ensaio de animais eurystomatous. Barra de erro representa o desvio padrão de 5 repetições. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54404/54404fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54404/54404fig4.jpg" /> Figura 4. Eurystomatous bombeamento Taxa e Tooth Movement durante a alimentação predatório. O movimento dentário é observado apenas enquanto os animais eurystomatous estão envolvidos na alimentação predatória. Este coincide também com uma redução de bombeamento da faringe. barra de erro representa o desvio padrão de 10 repetições.<html> href = &quot;https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54404/54404fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="filme 1" src="/files/ftp_upload/54404/54404movie1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54404/Movie_1_Killing_behaviour.mp4">Filme 1. Observação de Matar Comportamento para o Ensaio da mordida usando um Stereomicroscope Luz. (Clique direito a download).</a> <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/54404/54404movie2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54404/Movie_2_HS_Camera_Killing.mp4">Câmara de Filmar Filme 2. Alta velocidade de P. pacificus matando C. elegans larvas. (Clique direito a download).</a> ad / 54404 / 54404movie3.jpg &quot;/&gt; <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54404/Movie_3_HS_pumping_and_tooth.mp4">Filme 3. ampliada de alta velocidade da câmera do movimento dentário Durante predação. (Clique direito a download).</a>

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Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.

Ensaiar comportamentos alimentares predadores em<em&gt; Pristionchus</em&gt; E outros nematóides

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Environment

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

9.7K visualizações.  Max-Planck Institute for Developmental Biology. Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth. 

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Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to two families: Steinernematidae and Heterorhabditidae. Until now, more than 70 species have been described in the Steinernematidae and there are about 20 species in the Heterorhabditidae. The nematodes have a mutualistic partnership with Enterobacteriaceae bacteria and together they act as a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species.
Herein, we focus on the most common techniques considered for collecting EPN from soil. The second part of this presentation focuses on the insect-baiting technique, a widely used approach for the isolation of EPN from soil samples, and the modified White trap technique which is used for the recovery of these nematodes from infected insects. These methods and techniques are key steps for the successful establishment of EPN cultures in the laboratory and also form the basis for other bioassays that consider these nematodes as model organisms for research in other biological disciplines. The techniques shown in this presentation correspond to those performed and/or designed by members of S. P. Stock laboratory as well as those described by various authors.

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

Entomopathogenic nematodes are soil-inhabiting roundworms that parasitize a wide range of insects. We demonstrate sampling methods used for the isolation of these nematodes from the soil using two techniques: the insect baiting and the modified White trap, for the recovery of nematodes from soil samples and infected insect cadavers, respectively.

Amostragem do solo e isolamento de nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

Ambiente

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Comportamento

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild nematodes in their natural environments are valuable for understanding many aspects of biology, including the selective regimes in which distinctive genomic and phenotypic characters evolve, the genetic basis for complex trait variation, and the natural genetic diversity fundamental to all animal populations. This manuscript describes a simple and efficient method for extracting nematodes from their natural substrates, including rotting fruits, flowers, fungi, leaf litter, and soil. The Baermann funnel method, a classical nematology technique, selectively isolates active nematodes from their substrates. Because it recovers nearly all active worms from the sample, the Baermann funnel technique allows for the recovery of rare and slow-growing genotypes that co-occur with abundant and fast-growing genotypes, which might be missed in extraction methods that involve multiple generations of reproduction. The technique is also well suited to addressing metagenetic, population-genetic, and ecological questions. It captures the entire population in a sample simultaneously, allowing an unbiased view of the natural distribution of ages, sexes, and genotypes. The protocol allows for deployment at scale in the field, rapidly converting substrates into worm plates, and the authors have validated it through fieldwork on multiple continents.

This protocol outlines a method for efficiently extracting live nematodes from natural substrates in the field.

Isolamento Rápido de Nematoides Selvagens por Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

Genética

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

UMA<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensaio de Aversão ao Cobre Baseado em Status Nutricional

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Neurociência

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Investigando as proteínas príon-like espalhando e de toxicidade de usar o Metazoan Organismo Modelo<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Biologia

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. To improve the mating efficiency of B. Xylophilus and to increase the chances of mating observation, virgin adults were cultured and used for the investigation. Eggs were obtained by keeping the nematodes in water and allowing the females to lay eggs for 10 min. The second-stage juveniles (J2) were synchronized by incubating the eggs for 24 h at 25 &#176;C in the dark, and the early J4 were obtained by culturing the J2 with grey mold, Botrytis cinerea, for another 52 h. At this time point, most J4 nematodes could be clearly distinguished as being male or female using their genital morphology. The male and female J4 were collected and cultured separately in two different Petri dishes for 24 h to get virgin adult nematodes. A virgin male and a virgin female were paired in a drop of water in the well of a concave slide. The mating behavior was filmed with a video recorder under a stereomicroscope. The whole period of the mating process was 82.8 &#177;3.91 min (mean &#177;SE) and could be divided into 4 different phases: searching, contacting, copulating, and lingering. The mean minutes of duration were 21.8 &#177; 2.0, 28.0 &#177; 1.9, 25.8 &#177; 0.7 and 7.2 &#177; 0.5, respectively. Eleven sub-behaviors were described: cruising, approaching, encountering, touching, hooping, locating, attaching, ejaculating, separating, quiescence, and roaming. Interestingly, obvious intra-sexual competition was observed when one female was grouped with 3 males or one male with 3 females. This protocol is useful and valuable, not only in investigating the mating behavior of B. xylophilus, but also in acting as a reference for ethological studies of other nematodes.

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Observação e quantificação do comportamento de acasalamento no nemátodo do pinheiro,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the invasion of non-indigenous species. However, an exact identification of field predator-prey interactions is difficult in many cases. These analyses are often based on a visual evaluation of gut content or the analysis of stable isotope ratios (&#948;15N and &#948;13C). Such methods require comprehensive knowledge about, respectively, morphologic diversity or isotopic signature from individual prey organisms, leading to obstacles in the exact identification of prey organisms. Visual gut content analyses especially underestimate soft bodied prey organisms, because maceration, ingestion and digestion of prey organisms make identification of specific species difficult. Hence, polymerase chain reaction (PCR) based strategies, for example the use of group-specific primer sets, provide a powerful tool for the investigation of food web interactions. Here, we describe detailed protocols to investigate the gut contents of macroinvertebrate consumers from the field using group-specific primer sets for nuclear ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA can be extracted either from whole specimens (in the case of small taxa) or out of gut contents of specimens collected in the field. Presence and functional efficiency of the DNA templates need to be confirmed directly from the tested individual using universal primer sets targeting the respective subunit of DNA. We also demonstrate that consumed prey can be determined further down to species level via PCR with unmodified group-specific primers combined with subsequent single strand conformation polymorphism (SSCP) analyses using polyacrylamide gels. Furthermore, we show that the use of different fluorescent dyes as labels enables parallel screening for DNA fragments of different prey groups from multiple gut content samples via automated fragment analysis.

Most common gut content analyses of macroinvertebrates are visual. Requiring intense knowledge about morphological diversity of prey organisms, they miss soft bodied prey and, due to strong comminution of prey, are nearly impossible for some organisms, including amphipods. We provide detailed, novel genetic approaches for macroinvertebrate prey identification in the diet of amphipods.

Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative sparsity of information about C. elegans in its natural context comes from the challenges involved in the identification of the small nematode in nature. Despite these challenges, an increasing focus on the ecology of C. elegans has caused a wealth of new information regarding its life outside of the laboratory. The intensified search for C. elegans in nature has contributed to the discovery of many new Caenorhabditis species and revealed that congeneric nematodes frequently cohabitate in the wild, where they feed on microbial blooms associated with rotting plant material. The identification of new species has also revealed that the androdioecious mating system of males and self-fertilizing hermaphrodites has evolved three times independently within Caenorhabditis. The other two selfing species, C. briggsae and C. tropicalis, share the experimental advantages of C. elegans and have enabled comparative studies into the mechanistic basis of important traits, including self-fertilization. Despite these advances, much remains to be learned about the ecology and natural diversity of these important species. For example, we still lack functional information for many of their genes, which might only be attained through an understanding of their natural ecology. To facilitate ecological research of selfing Caenorhabditis nematodes, we developed a highly scalable method to collect nematodes from the wild. Our method makes use of mobile data collection platforms, cloud-based databases, and the R software environment to enhance researchers&#39; ability to collect nematodes from the wild, record associated ecological data, and identify wild nematodes using molecular barcodes.

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

This protocol can be used to perform large-scale ecological surveys of selfing Caenorhabditis nematodes. The primary advantage of this method is the efficient organization and analysis of ecological and molecular data associated with the nematodes collected from nature.

Uma abordagem altamente escalável para realizar pesquisas ecológicas de nematodes de caenorhabditis

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

Isolamento e Caracterização da Microbiota Natural do Nematoide Modelo Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

Investigando comportamentos coletivos em nematóides usando meio de ágar ração para cães

The Large-Scale Cultivation of Nematodes to Study Their Collective Behaviors

Animals exhibit dynamic collective behaviors, as observed in flocks of birds, schools of fish, and crowds of humans. The collective behaviors of animals have been investigated in the fields of both biology and physics. In the laboratory, researchers have used various model animals such as the fruit fly and zebrafish for approximately a century, but it has remained a major challenge to study large-scale complex collective behavior orchestrated by these genetically tractable model animals. This paper presents a protocol to create an experimental system of collective behaviors in Caenorhabditis elegans. The propagated worms climb on the lid of the Petri plate and show collective swarming behavior. The system also controls worm interactions and behaviors by changing the humidity and light stimulation. This system allows us to examine the mechanisms underlying collective behaviors by changing environmental conditions and examining the effects of individual-level locomotion on collective behaviors using mutants. Thus, the system is useful for future research in both physics and biology.

Autor em destaque: Análise comportamental coletiva do Nematóide, Caenorhabditis elegans

Here, a system is reported for studying the collective behaviors of nematodes by culturing them in bulk using dog food agar medium. This system allows researchers to propagate large numbers of dauer worms and can be applied to Caenorhabditis elegans and other related species.

O cultivo em larga escala de nematoides para estudar seus comportamentos coletivos

Animals exhibit dynamic collective behaviors, as observed in flocks of birds, schools of fish, and crowds of humans. The collective behaviors of animals ...

Ensaiar comportamentos alimentares predadores em

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