Name: automated analysis of c. elegans swim behavior using celest software
Uploaded: 2016-12-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software at JoVE.com

desenvolvimento CELEST foi financiado pelo NIH concede R21AG027513 e U01AG045864. Dados e algumas representações de vídeo curtos são adaptados a partir Restif et al. (2014) 8, que foram publicados sob a licença Creative Commons Attribution (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Agradecemos a Ricardo Laranjeiro para a ajuda manuscrito.

1. Crescimento Nematóides e Manuseio <ol><li> Crescer C. elegans em placas de Petri padrão contendo NGM manchado com OP50-1 Escherichia coli como fonte de alimento 1-3. </li><li> Manter as culturas numa incubadora que mantém a temperatura desejada. C. elegans cresce bem a partir de 15 a 25 ° C, com 20 ° C, sendo a temperatura de crescimento padrão. NOTA: A natação é um fenótipo robusta, no entanto nadar vigor pode ser afetada por fatores ambientais, incluindo a contaminação em placas e superaquecimento das culturas e slides. grandes esforços para manter condições estáveis ​​devem ser feitas. </li><li> Use uma pick nematóide caseiro feito de um fio de platina chama-selada em uma vareta de vidro para lidar com transferência de animais individuais 4. </li></ol> 2. Defina-se para Análise Swim <ol><li> Use um sistema integrado que consiste de um microscópio estereoscópico, câmera CCD digital e software de gravação de vídeo digital. A ca software CELESTn ser utilizado em um computador separado. <ol><li> Cubra o microscópio com um pano escuro (por exemplo, sentiu) para evitar reflexos na área para soltar a nadar na lâmina de microscópio e melhorar a qualidade da imagem. </li><li> Ajuste a distância de trabalho do microscópio e ampliação para visão completa da área de mergulho, eo espelho de base para obter nítido contraste dos animais contra o fundo. Definir a iluminação de campo escuro para visualizar os corpos dos adultos branco contra o fundo negro, que funciona muito bem para a visualização computacional e acompanhamento com o software de análise de mergulho. </li><li> Tome cuidado para manter a área de trabalho, lâmina de microscópio, e nadar cair muito limpo. Detritos podem interferir com a análise pela oclusão da natação livre dos adultos e finos fios de fibra pode ser detectado como inertes animais durante o rastreamento. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de animais para Análise de Aptidão Física de líquido <ol><li> Pipetar 60 ul óf tampão 1x M9 num anel de 10 milímetros pré-impresso sobre uma lâmina de microscópio. Certifique-se a queda cobre totalmente a área dentro do anel. O software extrai mais informações natação usando este tamanho de gota contidos em um slide do que seria se utilizando placas com múltiplas cavidades. </li><li> Escolha nemátodos adultos individuais e transferi-los para a gota de tampão 1x M9, minimizando o transporte de bactérias que podem obscurecer o líquido. Minimizar bactérias por em primeiro lugar colocar os animais para transferência para um dos lados da placa que não contêm muito camada bacteriana, permitindo-lhes rastrear, e então suavemente levantá-las. <ol><li> Ao transferir os nemátodos na gota, usar um escopo de dissecação perto da estação de análise para reduzir a duração do tempo de natação, o que pode afectar o comportamento dos animais 25. </li><li> Coloque apenas 4 adultos na queda, se eles se movem vigorosamente e se cruzam frequentemente. A título de orientação para minimizar nadadores sobreposição (que confunde análise computacional), considere colocar4 animais por queda quando eles são tão activa como jovens, adultos WT saudáveis ​​e 5 animais por queda quando forem mais velhos e mostrar menos vigor. NOTA: nematóides WT Saudável instintivamente começar a nadar logo depois de ser colocado em líquido. Com a ajuda de uma picareta nematóide, delicadamente separar os adultos na queda se aglutinar. </li></ol></li></ol> 4. Análise de Aptidão Física de líquido - Gravação de Vídeo de Natação <ol><li> Posicionar o slide carregado com adultos na base do microscópio para gravar seu natação. 30 s detalhes de captura de vídeos do comportamento de um animal individual no estado líquido (vídeo 1) e amostragem de um grande número de tais registros é facilmente realizado quando auxiliado por software CELEST 8,26; no entanto, mais nadar períodos pode ser ideal para outros estudos comportamentais específicas 25. Importante, certifique-se de manter a mesma ampliação em todas as gravações já que as diferenças de ampliação affecanálise de natação t e comparação viés vontade. NOTA: Estes passos são fornecidos como orientação usando o software de gravação de vídeo digital listadas na Tabela de Materiais; VirtualDub software livre acesso pode substituir, embora não tenhamos testado esse. <ol><li> Use as seguintes configurações como orientação para a análise de natação bem-sucedido: o tamanho da imagem de 696 x 520 pixels, resolução de imagem de 0,02 mm / pixel, e uma taxa de 18 frames / s. versões de maior resolução dessas configurações pode facilitar o acompanhamento, mas não afetará as medidas calculadas pelo programa. NOTA: A zona de mergulho fornecida pela queda de 60 ul de 1x tampão M9 na lâmina de microscópio não tem muita profundidade, o que minimiza o movimento para cima e para baixo de natação. </li></ol></li><li> Em Configurações, vá para &#39;Gravar&#39;, definir &#39;Limite de tamanho de Sequência de&#39; a &#39;545 quadros no disco&#39;. Sob o mesmo título, marque a caixa &quot;Use Recording Manager &#39;. Clique no botão &#39;recor atual Editarding roteiro ... &#39;botão, e sob&#39; Comandos &#39;, selecione&#39; Quadro Grab &#39;, e em &quot;condições stop&#39;, digite &#39;Parar após 0: 00: 30.00&#39;. </li><li> Para gravar, selecione &#39;New Sequence na RAM&#39; sob o título para casa, em seguida, pressione o botão &#39;Record&#39; vermelho. O software vai agarrar a 545 quadros com mais de 30 s com a câmera digital e mantê-los na memória RAM. </li></ol> 5. Análise de Aptidão Física de líquido - Tratamento de Vídeo <ol><li> Fragmentar o vídeo em uma sequência de quadros de imagem clicando no título da casa e selecionando &quot;sequência completa Exportar para ...&quot; no software de gravação de vídeo. NOTA: O software de gravação de vídeo digital pode salvar os quadros como .bmp, .jpg, .tif, ou .png, todos os quais podem ser lidos pelo programa de análise nadar aqui apresentados. Note-se que .tif usar mais espaço de armazenamento, mas alguns formatos, como .jpg pode degradar a qualidade da imagem. </li><li> Inicie o programa de análise de mergulho a partir do MATLAB by clicando no botão Executar. </li><li> Na tela inicial do programa de análise de mergulho, utilize o &#39;Adicionar um vídeo &quot;ou&quot; Adicionar vários vídeos de botões para fazer upload de sequências de imagem molda um de cada vez ou em grupos, enquanto colocação dos rótulos relevantes, tais como o genótipo, data, julgamento e duração . O software cria uma base de dados das sequências marcadas. </li><li> Ativar o acompanhamento simultâneo de vários animais nas sequências enviados ao clicar em &quot;1. vídeos processo &quot;. Na nova tela, selecionar os vídeos desejados na caixa à esquerda e clique &quot;Adicionar à lista&quot;. Para cada vídeo, clique em seu nome na lista top direita para exibir a primeira imagem do vídeo no canto inferior direito. Demarcar a zona de mergulho, selecionando 3 pontos dentro do ringue, e iniciar o processo clicando em &quot;Processo de todos os vídeos listados acima. Ver o progresso do processamento na parte inferior central. </li><li> Depois de concluído, &#39;Close&#39; tela de processamento de vídeo. </li></ol> 6. Análise de Aptidão Física de líquido - Medição <ol><li> Clique em &#39;2. medidas de computação &quot;para abrir uma nova tela onde os vídeos processados ​​podem ser carregados, um de cada vez, para validar ou rejeitar o rastreamento de animais individuais. Vídeos que foram processados ​​aparece na lista à esquerda, onde o nome do vídeo pode ser clicado para carregar esse vídeo. </li><li> Utilize este passo manual para se concentrar em áreas de rastreamento (blocos vermelhos) perdidas em contraste com rastreamento bem sucedido (blocos verdes). NOTA: Como alternativa, pode-se contar com a saída automatizada de acompanhamento válido desde que o software tem um sistema de rastreamento robusto (94,1% validade como observado em 2.020 animais de 404 vídeos 8). <ol><li> Encontrar o &quot;Validade do corpo segmentado &#39;na primeira barra de cores em toda a tela na metade inferior. A percentagem de &#39;frames válidos&#39; está em verde, ea percentagem de &#39;frames rejeitado &quot;está no vermelho. ≥80% de quadros válidos implica que o i rastreamentonformação usado para calcular medidas vem de, pelo menos, 432 quadros em cada 540 em um 30 s nadar julgamento gravada em 18 quadros / s. </li><li> Facilmente navegar e modificar blocos de válido / rejeitado quadros utilizando o &#39;Next block&#39;, &#39;Mudar validade &quot;,&quot; bloco Dividir&#39;, e as opções de &quot;quadro isolar&quot;. No caso raro que 2 animais cruzaram em uma zona de natação uncrowded, mudar seus números de identificação ao longo de um intervalo de quadro específico com o botão &#39;Mudar&#39;. </li><li> Veja os gráficos de barras na metade inferior da tela para obter informações adicionais sobre rastreamento e performances que se sobrepõem. O comprimento do corpo segmentado (do animal comprimento do corpo por quadro) correlaciona-se com sobreposição de incidência. </li></ol></li><li> Se todos os pontos brilhantes no vídeo interferir com a análise, ajuste áreas brilhantes na zona de mergulho, seleccionando a função das zonas de Brilho &#39;. </li><li> Clique em &quot;Salvar e medidas de computação &#39;para salvar a entrada de validade antes de secarregar outro vídeo processado. Nesta fase, o software calcula, no fundo (não mostrado para o usuário), mapas curvatura do desempenho de natação individual dos animais e os parâmetros indicados abaixo (Video 2). NOTA: Os parâmetros medidos que estão focados em aqui estão descritos na Tabela 1. The Wave taxa de iniciação, número de onda do corpo, assimetria, estiramento, e curling são calculados com base nos mapas de curvatura que o software calcula para os animais; A velocidade de marcha, Pincelada e atividade parâmetros de índice não são baseadas em mapas de curvatura. </li><li> Clique em &quot;Fechar&quot; para sair da tela das medidas de computação &quot;. </li></ol> 7. Análise de Aptidão Física de líquido - Saída de Resultados Nota: O software pode gerar relatórios em vários medidas do movimento de natação, que cobrem a partir evidentes para muito sutil traços comportamentais que não são facilmente marcados por olho (Videos 3 e 4). aqui ofoco está em 8 parâmetros que mostram geralmente uma boa gama dinâmica: Onda de taxa de iniciação, número de onda do corpo, assimetria, estiramento, ondulação, velocidade de deslocamento, Pincelada, e índice de atividade. <ol><li> Na tela inicial do programa, clique em &quot;3. Mostrar resultados &quot;para obter a saída de análise. </li><li> Criar grupos de amostra para tratamento estatístico, selecionando as sequências analisadas desejado de quadros na caixa à esquerda e movê-los em um grupo de amostra nova ou já existente, clicando em &quot;Adicionar à amostra selecionada&quot; ou &quot;Adicionar a nova amostra &#39;botões. </li><li> Clique em &quot;mostrar gráficos para estas amostras &#39;para ir para uma segunda tela que exibe os gráficos e estatísticas-chave das amostras para cada um dos 8 parâmetros de seleção no topo da tela. <ol><li> Se desejar, ajustar a representação dos gráficos de barras no canto superior esquerdo da tela usando as &#39;Cores&#39;, &#39;# de histogramas&#39; e &#39;# de Worms&#39; seletores. </li></ol></li><li> Usar&#39;Histogramas 2D&#39; para traçar combinações de quaisquer dois parâmetros através do &quot;Medida no eixo X &#39;e&#39; Medida no eixo Y &#39;menus à esquerda da tela. Clique em &quot;Fechar&quot; para sair e retornar à tela dos resultados de exibição &quot;. </li><li> Use o &quot;Exportar ...&quot; botão no canto superior esquerdo da tela para salvar os dados numéricos detalhados como arquivo .csv para abrir e ainda manipular em um programa de planilha. </li><li> tela &#39;Fechar&#39; dos resultados de exibição &quot;para voltar à tela inicial e clicar em &#39;Sair&#39; para garantir a poupança do banco de dados que contém as sequências de vídeo analisadas. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

O uso de C. elegans como um sistema modelo continua a aumentar devido à sua maleabilidade genética, tractability experimental e anatomia anotada ao detalhe meticuloso. Por exemplo, a estrutura neuronal e conectividade do C. elegans hermafrodita é claramente traçada 34-36, facilitando bastante investigações de circuitos neuronais específicos que controlam comportamentos específicos. 302 neurônios constituem o sistema nervoso do hermafrodita adulto, que processa uma ampla gama de entradas sensoriais em outputs comportamentais básicas, como a locomoção. A estrutura do sistema nervoso macho mais complexo também tem sido descrita 37, permitindo que os circuitos específicos do sexo a ser tratada. 37 C. elegans comportamento tem sido extensivamente estudada em placas de cultura padrão contendo meios sólidos. Desde WT de C. elegans se move em ondas senoidais previsíveis em placas encheu-agar, desvios em relação àpadrão global pode ser detectada a olho nu e teve manualmente. Esta abordagem, no entanto, está sujeita a critério do experimentador e é um trabalho intensivo. Ferramentas de hardware e software projetados para acompanhar e medir C. elegans locomoção em meios sólidos remover a polarização subjetividade e permitir estudos em grande escala, permitindo questões biológicas mais sofisticados a serem abordados. A base de dados de comportamento recente criado pelo laboratório Schafer 16 é um excelente exemplo da extensão e profundidade analítica que foi alcançado com um sistema computacional de locomoção em placas. Quando WT C. elegans é colocado em líquido, o animal se adapta rapidamente a sua proposta para o novo ambiente, iniciando um mergulho. C. elegans natação utiliza uma maior amplitude de movimento de rastreamento e pode ser mais irregular 8. Software como CELEST destina-se a preencher a lacuna para a análise detalhada de C. elegans comportamento no líquido, permiquantificação tting de parâmetros associados ao movimento que não são facilmente medidos pelo olho-aided un, ou que podem ser realizadas mais rapidamente do que de pontuação manual. Em 8 duro h um indivíduo poderia processar até 200 vídeos, ~ 1.000 registros por dia. O software define natação parâmetros que avaliam que servem como uma impressão digital abrangente de aptidão física e comportamento. Além de enriquecer a compreensão das facetas complexas de C. elegans comportamento em líquido e suas vias moleculares subjacentes, este software pode ser usado para explorar vários aspectos da biologia, incluindo respostas farmacológicas, envelhecimento e comportamento distinto. Apresentado aqui, a visão geral das mudanças quantificados que ocorrem no desempenho físico de C. elegans adultos com a idade é um exemplo de tal aplicação do software (para uma descrição mais detalhada, consulte Restif et al. 8). No contexto do envelhecimento, alguns parâmetros medidos diminuiu enquantooutros aumentada ou não consistentemente mudar de tipo selvagem. Tendências foram confirmadas em grande medida pelo perfil computacional de mutantes longevidade, e os perfis relativos de coortes ager graciosas e ruins das populações da mesma idade mantidos em condições ambientais uniformes. A alta resolução do software também pode revelar fenótipos subtis anteriormente desconhecido em mutantes extensivamente caracterizadas (por exemplo, idade-1 (hx546) na Figura 1). Existem algumas etapas particularmente críticas do protocolo descrito. A manutenção de um ambiente de temperatura constante entre o ambiente aquático ea cultura em placa de tensão é importante para mergulho reprodutibilidade, então experimentadores são altamente incentivados a ir para um grande esforço para evitar mudanças de temperatura aleatórios. meios de natação deve estar na mesma temperatura que as placas. Da mesma forma, cuidadosa atenção ao tamanho da gota para a natação vai ajudar a garantir a reprodutibilidade. Finalmente, é prudente pensar emavançar sobre o descarregamento de grandes arquivos de vídeo que se acumulam. Processamento de imagens em um site para além do computador de captura de vídeo é recomendado. O uso do software de análise aqui apresentada para nadar tem certas limitações. Em primeiro lugar, embora os programas podem rastrear simultaneamente vários animais, se mais de cinco animais são analisadas em conjunto, há uma maior chance de que os animais vão nadar em uns aos outros nas imagens de vídeo. Quando o programa não pode inequivocamente determinar qual animal era que, ao que censura os quadros de dados. Embora esse recurso programa garante que os dados para os animais individuais são de alta qualidade, que limita a taxa de transferência. Em segundo lugar, as imagens devem ser bastante limpo, livre de poeira, manchas e brilho das luzes, como sinais associados também podem confundir a análise de imagem. Como observado na seção de protocolo 2.1.1, um investimento muito baixa tecnologia que pode ajudar muito a captura de imagem, eliminando complicações com as flutuações in iluminação ambiental é para cobrir a área do palco com um pano escuro que não permite que a luz ambiente para atingir o estágio. Em terceiro lugar, o programa é otimizado para animais na fase adulta. mergulho larvas jovens muito rápido e têm corpos pequenos, o que aumenta erro de programa. Em quarto lugar, alguns dos softwares utiliza MATLAB, e quando há atualizações de versão e / ou atualizações do sistema operacional, alguns links de programas podem ser interrompidos. Atualmente, o software é otimizado para uso em MATLAB 2015b e Mac OS versão 10.10, mas esperamos em breve para deixar um versão do software que seja mais robusto contra tais mudanças. Finalmente, os arquivos de dados de vídeo podem se tornar grandes rápido, e necessitam de espaço de armazenamento a ser alocado. Em resumo, apresentado aqui é uma metodologia simples que pode ser facilmente implementado por qualquer laboratório, sem muito investimento para criar vídeos de C. elegans natação para análise CELEST. Características do pacote de software incluem automação extensiva de rastreamento atravésanálise, acompanhamento multi-animais simultânea e uso de bases matemáticas (ou seja, as medidas de curvatura) para quantificação de a maioria dos parâmetros de locomoção. O software é open source, com código e demos à disposição do público, conforme detalhado no Restif et al. 8. Embora o programa apresenta a análise da visão de computador avançado para acompanhamento, outros sistemas de rastreamento publicada (por exemplo, Greenblum et al., 2014 38) são compatíveis com a análise de parâmetros do software aqui apresentado. Futuras melhorias será voltada para converter o software em um pacote mais robusto que não restringir o uso das versões específicas dos sistemas operacionais mencionados acima (também indicadas na Tabela de Materiais).

Definindo como o comportamento genética, epigenética, experiência e ambiente de influência é um grande desafio para a biologia moderna. Simples, modelos geneticamente susceptíveis que podem ser computacionalmente rastreados e medidos podem fazer contribuições importantes em direção a esse objetivo. O nematóide Caenorhabditis elegans é um tal modelo. O objetivo deste artigo é demonstrar como C. elegans natação locomoção pode ser rastreado e quantificadas para extrair informações sobre oito características inovadoras com relevância biológica. C. elegans tem um tempo de vida relativamente curto de cerca de 2-3 W e um período de reprodução de aproximadamente 4 d a 20 ° C 1,2. Em culturas de laboratório padrão, esse nematóide microscópica é cultivado em placas de Petri contendo Nemátodo Crescimento mídia (NGM) que estão espalhados com uma fonte de alimento bacteriana 3,4. animais WT N2 mover activamente em ondas senoidais elegantes em placas cheio de agar; eles mudam o movimento do ratoes em roaming (busca de alimentos), habitação (de navegação), ou se recuperando de uma refeição (quiescência saciedade inativo) 5. Impairment 6 ou 7-12 idade também pode alterar drasticamente o movimento em placas. Os genes que modulam o comportamento, healthspan ou envelhecimento, pode ser caracterizada funcionalmente através da análise de C. elegans padrões de movimento ou locomoção. Uma abordagem para medir healthspan é classificar envelhecimento adultos em três categorias (por exemplo, A, B, e C) de acordo com sua locomoção em placas, com atividade vigorosa física sendo a classe A e paralisia sendo classe C 7,8,13. Embora essa classificação qualitativa é útil para revelar as diferenças de aptidão física, as categorias são amplas, sem limites claros e, assim, a sua pontuação está sujeita a experimentador viés. Um número crescente de trackers têm elevado a objetividade, sofisticação e precisão da análise de C. elegans movimentoem meios sólidos 14-18. C. elegans em placas de locomoção está principalmente restringida ao plano no qual o animal entra em contacto com a superfície sólida dos meios de comunicação. (C. elegans pode também induzir a exploração por levantar a cabeça do resto do corpo, que ainda está em contacto com uma superfície sólida, o posicionamento do corpo em vários planos. No entanto, este comportamento é incomum.) Quando colocadas no estado líquido, este nematóide inicia um movimento ondulatório, ou a natação, que possui movimento mais extensa dimensional, uma maior gama de velocidade e profundidade do movimento, e um aumento da incidência com a idade de movimento anterior de forma diferente a partir de posterior em comparação com animais em superfícies sólidas. Como uma rápida análise da aptidão física e da resposta ao novo ambiente, um experimentador pode colocar um animal em uma gota de líquido e marcar a sua frequência de curvas corporais no âmbito de dissecação. A gravação de vídeo pode facilitar scorings presentes e futuras do vigor de natação doanimal. No entanto, a abordagem manual limita o número de recursos que podem ser marcados, e está totalmente restrito a marcar um animal de cada vez. Locomotion em líquido tem sido menos explorada do que a locomoção em meios sólidos. De fato, há poucas opções de software que são robustas e fáceis de implementar no laboratório para medir a locomoção em líquido 19-24. O CELEST software (C. elegans Swim Test) oferece simplicidade de medidas de uso e matemáticos com base em que entregam dados (pontuações curvatura) diretamente relevantes para a natureza do movimento 8; (descrição detalhada de características e vantagens em Restif et al. 8). Além disso, a análise computacional permite a elucidação de características fenotípicas que são impossíveis para o olho humano para marcar. Aqui, os dados que exemplificam a resolução desta abordagem de análise são apresentados e um fácil de implementar o protocolo para gravar testes de natação para análise CELEST subsequente é descrito.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; WT (ancestral).</td></tr><tr><td>OP50 &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Biosafety Level: BSL-1.</td></tr><tr><td>OP50-1 &lt;em&gt;Escherichia Coli&lt;/em&gt;&amp;nbsp;</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>Streptomycin resistant strain of OP50.&amp;nbsp; Biosafety Level: BSL-1.</td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Printed Microscope Slides&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002</td><td>have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink</td></tr><tr><td>Nematode Growth Medium (NGM)</td><td>For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer, 1 mL 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L. Sterilize by autoclaving.</td><td></td><td>Stiernagle, T. Maintenance of &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)</td></tr><tr><td>M9 buffer</td><td>For 1 L: 3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L. Sterilize by autoclaving.</td><td></td><td>Stiernagle, T. Maintenance of &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CeleST</td><td>Driscoll Lab, Rutgers University</td><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; Swim Test</td><td>Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>www.mathworks.com/downloads</td><td>MatLab version 2015b (best)</td><td>The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn&#039;t be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn&#039;t need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mac OS</td><td>www.apple.com</td><td>Version 10.10</td><td>Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don&#039;t even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it&#039;s the operating system in our lab).</td></tr><tr><td>Stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Transmitted Light Base</td><td>Diagnostic Instruments</td><td>TLB 3.1</td><td></td></tr><tr><td>Digital CCD Camera</td><td>QImaging</td><td>Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)</td><td></td></tr><tr><td>Digital Video Recording Software</td><td>Norpix</td><td>Streampix Version 3.17.2</td><td></td></tr></tbody></table>

automated analysis of c. elegans swim behavior using celest software

Dissecando os circuitos neuronais e neuromusculares que regulam o comportamento continua a ser um desafio importante na biologia. O nematóide Caenorhabditis elegans tem provado ser um organismo modelo valioso para ajudar a enfrentar este desafio, de inspirar abordagens tecnológicas, construindo o conectoma cérebro humano, para realmente lançar luz sobre os drivers moleculares específicas de padrões funcionais básicos. A maior parte dos estudos comportamentais em C. elegans foram realizados em substratos sólidos. No líquido, animais exibem padrões de comportamento que incluem o movimento a uma gama de velocidades em 3D, bem como os movimentos do corpo parciais, como uma onda posterior, sem alteração da forma anterior, que introduzem novos desafios para a quantificação. Os passos de um procedimento simples, e uso de um software que permite a análise de alta resolução de C. elegans nadar comportamento, são aqui apresentados. O software, chamado CELEST, usa um programa de computador especializado que rastreiavários animais ao mesmo tempo e proporciona novas medidas de C. elegans locomoção em líquido (natação). As medidas são principalmente fundamentada na postura dos animais e com base em matemática utilizados em visão computacional e reconhecimento de padrões, sem requisitos computacionais para limiar cut-offs. A ferramenta de software pode ser usado tanto para avaliar a aptidão geral de natação em centenas de animais provenientes de ensaios pequeno lote combinados e revelar novos fenótipos, mesmo em mutantes genéticos bem caracterizados. A preparação de amostras para análise com CELEST é simples e de baixa tecnologia, permitindo ampla adaptação pela comunidade científica. Utilização da abordagem computacional descrito aqui deve, portanto, contribuir para a maior compreensão do comportamento e circuitos comportamentais no modelo C. elegans.

Ao analisar a locomoção em líquido (natação), fenótipos que não são facilmente perceptível em meio sólido (rastreamento) pode ser elucidado. Para quantificar a natação locomoção foi desenvolvido um software específico que mede dez novos parâmetros de comportamento de natação 8. O oito mais útil destes parâmetros são descritos em detalhe na Tabela 1. Estes parâmetros são nomeados de Ondas taxa de iniciação, número de onda do corpo, Assimétrico, Stretch, Curling, velocidade de viagem, curso da escova, e índice de atividade. Estudos exemplificando o poder do software ter definido o declínio funcional de centenas de envelhecimento adultos com WT, fundos mutante comportamentais ou longevidade 8, e analisaram o bem estudado mutantes longevidade idade-1 (hx546) e daƒ-16 (mgDƒ50), que abrigam mutações que perturbam a via normal de sinalização da insulina. A idade-1 gene codifica para uma phosphatidylinositide 3-quinase (PIK3) Subunidade catalítica, e, quando se abriga o hx546 mutação, provoca extensão vida útil e resistência ao estresse 27-29. O gene daƒ-16 codifica um fator de transcrição box forkhead O (FOXO) que encurta a vida útil e prejudica a resposta ao estresse, quando excluídos 30-33. Certos parâmetros de natação como a onda taxa de iniciação, velocidade de viagem, escova de acidente vascular cerebral e índice de atividade diminuiu gradualmente com a idade mesmo em origens genéticas favoráveis (Figura 1). De acordo com o conhecimento actual, de longa duração idade-1 (hx546) mutantes mostraram um desempenho físico mais vigoroso do WT em idades avançadas e extremamente antigas. Além disso, como esperado, de curta duração daƒ-16 (mgDƒ50) mutantes apresentaram comprometida desempenho, especialmente em idades extremamente antigos. Notavelmente, foi apenas sob o escrutínio da visão de computador CELEST e pacote de algoritmo matemático que o superior desempenho mergulho de idade 1-(hx546) mutantes foi detectável no início da idade adulta. O fato de que resulta em melhoria do rendimento físico na vida adulta jovem idade-1 (hx546) sugere que esta mutação afeta o desenvolvimento normal e / ou fenótipo jovem adulto de uma maneira apreciada não previamente (Figura 1). Número de corpo onda, Assimetria, esticar e ondulação parâmetros tenderam-se com a idade em WT e adultos envelhecimento mutantes (Figura 2). Curiosamente, o nível de resolução do software revelou características comportamentais mais finos como a simetria sustentada de mutantes ao longo do seu tempo de vida e a incapacidade de daƒ-16 mutantes (mgDƒ50) antigos extremas idade-1 (hx546) para esticar e enrolar-se na medida em que a mesma adultos -Idade WT e idade-1 (hx546) fazer. Para além da inevitável perda global de perfo físicarmance devido à idade, cada indivíduo adulto exibe um padrão de progressão única através do processo de envelhecimento, mesmo quando a genética eo ambiente são praticamente homogênea 7. (Ao controlar a genética eo ambiente, os possíveis efeitos de confusão desses fatores são minimizados, revelando a contribuição significativa da stochasticity à degeneração relacionada à idade.) A C. elegans população sincronizada de fundo genético semelhante mantidos em um ambiente controlado ainda contém uma mistura de diferentes classes de pessoas de acordo com suas peculiaridades envelhecimento. Apesar de todo o começo adultos saudáveis, alguns rapidamente perder sua aptidão física (maus gestores, classe C), enquanto outros manter o vigor por um período maior de tempo (agers graciosas, classe A). Bad agers, portanto, parecem ter um healthspan consideravelmente mais curto do que agers graciosas. Conforme detalhado no nosso estudo 8, agers graciosas mantida fitn física juveniless como observado por comparação com o perfil de mergulho dos adultos mais jovens (Figuras 3, 4 e 5). Esta aptidão sustentado é comparável ao desempenho físico de-1 Idade (hx546) mutantes de longa duração na idade pós-reprodutiva (D 11) (Figuras 1 e 2). Pelo contrário, agers ruins dramaticamente perderam muito de sua capacidade física logo após a reprodução, desempenho em níveis semelhantes aos dos adultos extremos de idade e progeric daƒ-16 (mgDƒ50) (Figuras 1 - 4). Essas semelhanças podem ser tiradas por comparação bruta, no entanto particular de assinaturas são facilmente perceptíveis em um olhar mais atento. Por exemplo, embora haja alguma correlação entre a extensão de ambos estiramento e enrolamento em tipos selvagens velhos extremas e envelhecimento mutantes (Figura 2), esta relação não se observa em maus gestores (Figuras 4 e 5), que apresentam maior propensão para enrolar -se, maspara não esticar nas amostras testadas. O software apresentamos acrescenta, assim, dimensão à análise da aptidão física ou a capacidade locomotora, fornecendo as ferramentas para estudos mais sofisticados que não eram tratáveis ​​antes. Em resumo, CELEST fornece leituras abrangentes em forma de oito novas medidas destacadas aqui, que definem a impressão digital comportamental específica genética, epigenética, e fundos ambientais, permitindo a identificação de padrões de parâmetros únicos e comuns que podem ser as assinaturas de condições específicas ( ambiental, farmacológicos, nutricional), processos biológicos, ou organismo estados como healthspan. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig1.jpg" /> Figura 1: CELEST Reports Software na onda Iniciação Rate (A), Índice de Atividade (B), Pincelada (C) e Viagens velocidade (D) para o WT, idade-1 (hx546) e daƒ-16 (mgDƒ50)<html> Adultos em D 4 (início da vida adulta), 11 (pós-reprodução) e 20 (extrema idade). &#39;#&#39; Em &#39;número&#39; y meios de eixo. WT são coloridos em cinza, idade-1 em verde e daƒ-16 no vermelho. As barras de erro são o erro padrão da média (SEM). WT da mesma idade e do envelhecimento mutantes foram comparados para significância estatística usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. **, P = 0,001 - &lt;0,01; ***, P = 0,0001 - &lt;0,001. n = 62 em cada ponto de dados de quatro ensaios independentes. Note-se que aqui, e para a Figura 2, cada um de 30 s de vídeo é feita com 4 animais, e para cada ensaio que marcar um total de 16 animais, a partir de 4 vídeos de natação, isto é feito em 4 réplicas biológicas para cada ponto de dados mostrados. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54359/54359fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <html> ntent &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig2.jpg" /> Figura 2: Relatórios de Software na onda do corpo Number (A), Assimétrico (B), Stretch (C) e Curling (D) para o WT, idade-1 (hx546) e (mgDƒ50) Adultos em D 4 16 daƒ-(jovens idade adulta), 11 (pós-reprodução) e 20 (extremo de idade). &#39;#&#39; Em &#39;número&#39; y meios de eixo. WT são coloridos em cinza, idade-1 em verde, e daf-16 em vermelho. As barras de erro são o erro padrão da média (SEM). WT da mesma idade e do envelhecimento mutantes foram comparados para significância estatística usando ANOVA de uma via seguida pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. *, P = 0,01 - &lt;0,05; **, P = 0,001 - &lt;0,01; ***, P = 0,0001 - &lt;0,001. N = 62 em cada ponto de dados a partir de quatro independente, 30 s nadar ensaios.E.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig3.jpg" /> Figura 3: Relatórios de Software na onda Iniciação Rate (A), Activity Index (B), Pincelada (C), e do curso de velocidade (D) para jovens adultos WT (D 4), e da mesma idade Gracioso e Bad Agers (D10 e 11). &#39;#&#39; Em &#39;número&#39; y meios de eixo. WT jovens são coloridos em cinza, classe A agers graciosas no verde, e da classe C maus agers em vermelho. As barras de erro são o erro padrão da média (SEM). Classe A agers graciosas e classe C maus agers foram comparados com D 4 adultos jovens usando o one-way ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. ****, P &lt;0,0001. N = 27 em cada ponto de dados a partir de dois independente, 30 s nadar ensaios. Graph é ligeiramente modificado a partir Restif et al. (2014) 8, que foi publicado sob o criativoCommons Atribuição (CC BY) licença http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54359/54359fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig4.jpg" /> Figura 4: Relatórios de Software na onda do corpo Number (A), Assimétrico (B) e Curling (C) para Young WT Adultos (D 4), e Agers da mesma idade graciosas e Bad (D 10 e 11). &#39;#&#39; Em &#39;número&#39; y meios de eixo. WT jovens são coloridos em cinza, classe A agers graciosas no agers verdes e classe C ruins em vermelho. As barras de erro são o erro padrão da média (SEM). Classe A agers graciosas e classe C maus agers foram comparados com D 4 adultos jovens usando o one-way ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. **, P = 0,001 - &lt;0,01; ****, P &lt;0,0001; <strong&gt; n / a, não aplicável a partir de apenas um animal fora do tamanho total da amostra enrolado. N = 27 em cada ponto de dados a partir de dois independente, 30 s nadar ensaios. Graph é ligeiramente modificado a partir Restif et al. (2014) 8, que foi publicado sob o http licença Creative Commons Attribution (CC BY): /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54359/54359fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54359/54359fig5.jpg" /> Figura 5: Relatório de software on-cola para jovens adultos WT (D 4), e-mesma idade Gracioso e Bad Agers (D 10 e 11). WT jovens são coloridos em cinza, classe A agers graciosas no agers verdes e classe C ruins em vermelho. As barras de erro são o erro padrão da média (SEM). Classe A agers graciosas e classe C maus agers foram comparados com D 4 yadultos de Oung que usa ANOVA one-way, seguido pelo teste de comparação múltipla de Dunnett. N = 27 em cada ponto de dados a partir de dois ensaios independentes. Graph é ligeiramente modificado a partir Restif et al. (2014) 8, que foi publicado sob o http licença Creative Commons Attribution (CC BY): /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54359/54359fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="video 1" src="/files/ftp_upload/54359/54359video1.jpg" /> Video 1: Natação de um grupo representativo de C. elegans adultos. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54359/Video1.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).</a> <img alt="video 2" src="/files/ftp_upload/54359/54359video2.jpg" /> Vídeo 2: CELEST Software Computação de Mapas Curvatura individuais das Performances de natação dos animais testados. mapas de curvatura são computados no fundo; eles não aparecem na interface do software com o usuário. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54359/Video2.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).</a> <img alt="vídeo 3" src="/files/ftp_upload/54359/54359video3.jpg" /> Vídeo 3: cálculo Software de Medidas de natação com base em individuais Curvatura Maps. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54359/Video3.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).</a> <img alt="video 4" src="/files/ftp_upload/54359/54359video4.jpg" /> Video 4: Cálculo Software de Medidas de natação que não dependem de curvaturaMapas. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54359/Video4.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).</a>

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Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Uma metodologia eficiente e simples para a análise baseada em computador do comportamento de natação nematóide em líquido é descrito. O método requer pouco ou nenhum investimento para C. elegans laboratórios. O hardware utilizado é padrão, e o software de computador para a análise comportamental (CELEST) é uma fonte aberta um.

Análise automatizada de<em&gt; C. elegans</em&gt; Comportamento Swim Usando CELEST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

12.4K visualizações.  Rutgers University.  Uma metodologia eficiente e simples para a análise baseada em computador do comportamento de natação nematóide em líquido é descrito. O método requer pouco ou nenhum investimento para C. elegans laboratórios. O hardware utilizado é padrão, e o software de computador para a análise comportamental (CELEST) é uma fonte aberta um. 

Vídeo: Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, acceleration and forces involved in the locomotory behavior of nematodes suspended in a column of water in response to single wavelengths of light. We demonstrate how to evaluate the locomotion of a microscopic organism using Single Wavelength Shadow Imaging (SWSI) using two different examples.
The first example is a systematic and statistically viable study of the average descent of C. elegans in a column of water. For this study, we used living and dead wildtype C. elegans. When we compared the velocity and direction of nematode active movement with the passive descent of dead worms within the gravitational field, this study showed no difference in descent-times. The average descent was 1.5 mm/sec &#177; 0.1 mm/sec for both the live and dead worms using 633 nm coherent light.
The second example is a case study of select individual C. elegans changing direction during the descent in a vertical water column. Acceleration and force are analyzed in this example. This case study demonstrates the scope of other physical properties that can be evaluated using SWSI while evaluating the behavior using single wavelengths in an environment that is not accessible with traditional microscopes. Using this analysis we estimated an individual nematode is capable of thrusting with a force in excess of 28 nN.
Our findings indicate that living nematodes exert 28 nN when turning, or moving against the gravitational field. The findings further suggest that nematodes passively descend in a column of water, but can actively resist the force of gravity primarily by turning direction.

Single Wavelength Shadow Imaging of Caenorhabditis elegans Locomotion Including Force Estimates

The technique presented here measures the path of freely swimming microscopic species using single wavelength exposure. C. elegans are used to demonstrate shadow imaging as an inexpensive alternative to costly microscopes. This technique can be adapted to accommodate various orientations, environments and species to measure direction, speed, acceleration and forces.

Comprimento de Onda Único Sombra Imagem de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Locomotion incluindo a força Estimativas

This study demonstrates an inexpensive and straightforward technique that allows the measurement of physical properties such as position, velocity, ...

Engenharia

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in contrast, have been conducted using microscope-based approaches, which limit the movement and behavior to a narrow, nearly two-dimensional focal field.1 We present a novel analytical approach that provides real-time analysis of freely swimming C. elegans in a cuvette without dependence on microscope-based equipment. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through the cuvette. We measure oscillation frequencies for freely swimming nematodes.
Analysis of the far-field diffraction patterns reveals clues about the waveforms of the nematodes. Diffraction is the process of light bending around an object. In this case light is diffracted by the organisms. The light waves interfere and can form a diffraction pattern. A far-field, or Fraunhofer, diffraction pattern is formed if the screen-to-object distance is much larger than the diffracting object. In this case, the diffraction pattern can be calculated (modeled) using a Fourier transform.2
C. elegans are free-living soil-dwelling nematodes that navigate in three dimensions. They move both on a solid matrix like soil or agar in a sinusoidal locomotory pattern called crawling and in liquid in a different pattern called swimming.3 The roles played by sensory information provided by mechanosensory, chemosensory, and thermosensory cells that govern plastic changes in locomotory patterns and switches in patterns are only beginning to be elucidated.4 We describe an optical approach to measuring nematode locomotion in three dimensions that does not require a microscope and will enable us to begin to explore the complexities of nematode locomotion under different conditions.

Microscopic organisms like the free-swimming nematode C. elegans, live and behave in a complex three-dimensional environment. We report on a novel approach that provides analysis of C. elegans using diffraction patterns. This approach consists of tracking the temporal periodicity of diffraction patterns generated by directing laser light through a cuvette.

Estudo quantitativo de locomoção livremente Natação Micro-organismos Usando Difração Laser

Soil and aquatic microscopic organisms live and behave in a complex three-dimensional environment. Most studies of microscopic organism behavior, in ...

Bioengenharia

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis baseados em microfluídica para análise quantitativa On-demand de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Acompanhamento e Medição do Comportamento

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

Neurociência

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) controls several functions in C. elegans including learning and motor activity. Conditions that stimulate DA release (e.g., amphetamine (AMPH) treatments) or that prevent DA clearance (e.g., animals lacking the DA transporter (dat-1) which are incapable of reaccumulating DA into the neurons) generate an excess of extracellular DA ultimately resulting in inhibited locomotion. This behavior is particularly evident when animals swim in water. In fact, while wild-type animals continue to swim for an extended period, dat-1 null mutants and wild-type treated with AMPH or inhibitors of the DA transporter sink to the bottom of the well and do not move. This behavior is termed "Swimming Induced Paralysis" (SWIP). Although the SWIP assay is well established, a detailed description of the method is lacking. Here, we describe a step-by-step guide to perform SWIP. To perform the assay, late larval stage-4 animals are placed in a glass spot plate containing control sucrose solution with or without AMPH. Animals are scored for their swimming behavior either manually by visualization under a stereoscope or automatically by recording with a camera mounted on the stereoscope. Videos are then analyzed using a tracking software, which yields a visual representation of thrashing frequency and paralysis in the form of heat maps. Both the manual and automated systems guarantee an easily quantifiable readout of the animals' swimming ability and thus facilitate screening for animals bearing mutations within the dopaminergic system or for auxiliary genes. In addition, SWIP can be used to elucidate the mechanism of action of drugs of abuse such as AMPH.

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Swimming induced paralysis (SWIP) is a well-established behavioral assay used to study the underlying mechanisms of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans (C. elegans). However, a detailed method to perform the assay is lacking. Here, we describe a step-by-step protocol for SWIP.

Paralisia induzida de natação para avaliar a sinalização de dopamina em Caenorhabditis elegans

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Comportamento

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Um ensaio para medir os efeitos do etanol sobre a velocidade de Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

Análise comportamental de grande c. elegans populações usando um amplo campo de visão de rastreamento plataforma automatizada

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

Imunologia e Infecção

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor impairment that worsens with time. While considerable advances have been made in determining genetic drivers of ALS for a subset of patients, the majority of cases have an unknown etiology. Further, the mechanisms underlying motor neuron dysfunction and degeneration are not well understood; therefore, there is an ongoing need to develop and characterize representative models to study these processes. Caenorhabditis elegans can adapt their movement to the physical constraints of their surroundings, with two primary movement paradigms studied in a laboratory environment- crawling on a solid surface and swimming in liquid. These represent a complex interplay between sensation, motor neurons, and muscles. C. elegans models of ALS can exhibit impairment in one or both of these movement paradigms. This protocol describes two sensitive assays for evaluating motility in C. elegans: an optimized radial locomotion assay measuring crawling on a solid surface and an automated method for tracking and analyzing swimming in liquid (thrashing). In addition to the characterization of baseline motor impairment of ALS models, these assays can detect suppression or enhancement of the phenotypes from genetic or small molecule interventions. Thus, these methods have utility for studying ALS&#160;models and any C. elegans strain that exhibits altered motility.

Evaluation of Motor Impairment in C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol describes two sensitive assays for discriminating among mild, moderate, and severe motor impairment in C. elegans models of amyotrophic lateral sclerosis, with general utility for C. elegans strains, with altered motility.

Avaliação do Comprometimento Motor em C. elegans Modelos de Esclerose Lateral Amiotrófica

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) features progressive loss of motor neurons accompanied by muscle weakness and motor ...

Swimming-Induced Paralysis (SWIP) Assay: A Method to Quantify Dopamine-Mediated Locomotion in C. elegans

Source: Kudumala, S., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/59243/swimming-induced-paralysis-to-assess-dopamine-signaling">Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in&#160;Caenorhabditis elegans</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019).
Here, we introduce an assay to measure SWIP, a behavioral phenotype of&#160;C. elegans&#160;that occurs during vigorous motion like swimming.&#160; The example protocol discusses both manual and automated analysis approaches.

Ensaio de Paralisia Induzida por Natação (SWIP): Um Método para Quantificar a Locomoção Mediada por Dopamina em C. elegans

Source: Kudumala, S., et al. Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in&#160;Caenorhabditis elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019).
Here, ...

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